丹梔逍遙散對多囊卵巢大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達的影響

侯麗瑩，鄧麗玲，羅 佩，余曦明，全春梅，趙 娜，楊正望*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410007）

·方藥研究·

丹梔逍遙散對多囊卵巢大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達的影響

侯麗瑩1，鄧麗玲1，羅 佩1，余曦明1，全春梅1，趙 娜1，楊正望2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410007）

目的 探討丹梔逍遙散對多囊卵巢（polycystic ovaries,PCO）大鼠血清睪酮（testosterone,T）、抗苗勒管激素（anti-mulerian hormone,AMH）及卵巢局部AMH蛋白表達的影響。方法SD雌性大鼠以頸背部皮下注射脫氫表雄酮（dehydroepiandrostexone,DHEA）溶液構(gòu)建PCO大鼠模型，判定造模成功后再隨機分成模型組、達英-35組、丹梔逍遙散組，并設(shè)空白組，分別用蒸餾水、達英-35及丹梔逍遙散對大鼠灌胃給藥，連續(xù)灌胃21 d，停藥7 d為一療程，灌胃3個療程后處死大鼠，采用放射免疫法測定T、AMH，免疫組織化學法檢測PCO大鼠卵巢局部AMH蛋白表達。結(jié)果與模型組比較，丹梔逍遙散組血清T、AMH水平及AMH蛋白表達強度均下降 （P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論丹梔逍遙散治療高雄激素血癥 （hyperandrogenism,HA）可能是通過降低PCO大鼠血清T、AMH水平，降低卵巢局部AMH蛋白表達強度，對AMH進行良性調(diào)節(jié)，從而改善HA。

多囊卵巢綜合征；高雄激素血癥；抗苗勒管激素；丹梔逍遙散；牡丹皮；梔子

多囊卵巢綜合征 （polycystic ovary syndrome,PCOS）是育齡期常見的內(nèi)分泌代謝和生殖障礙疾病。高雄激素血癥（hyperandrogenism,HA）是引起PCOS患者局部病理變化的重要機制之一。近年來的基礎(chǔ)研究認為卵巢局部微環(huán)境的失調(diào)是維持高雄激素血癥的重要機制。尤其是抗苗勒管激素水平（anti-mulerian hormone,AMH）作為一種卵巢局部重要調(diào)節(jié)因子，在PCOS患者中高表達，成為診治和研究PCOS新的突破點。研究表明高雄激素的發(fā)生可能與AMH有一定的相關(guān)性，血清AMH濃度在PCOS合并HA婦女中更高[1-2]。

既往PCOS的中醫(yī)藥治療研究大多以補腎活血化瘀為主要目標進行攻關(guān)，相關(guān)的實驗研究肯定了補腎活血方藥能夠改善PCOS[3]。隨著臨床研究的深入，以疏肝健脾清熱為切入點的中醫(yī)藥治療逐漸受到人們的關(guān)注，從肝論治PCOS高雄激素血癥也取得了一定成效。本研究立足于從肝論治，以卵巢局部微環(huán)境AMH與雄激素調(diào)節(jié)失常在HA形成中發(fā)揮作用為假說，通過運用導師楊正望主任醫(yī)師常用方劑丹梔逍遙散干預多囊卵巢 （polycystic ovaries,PCO）大鼠模型，初步探討丹梔逍遙散對PCO大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達的影響，進一步揭示其可能改善HA的作用機制。

1 材料

1.1 動物

21 d齡斷乳未成年雌性健康SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（75±15）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為：SCXK （湘）2011-0003，飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，許可證號為：SYXK （湘）2013-0005。室溫20～26℃，相對濕度40%～60%，保持通風干燥，標準顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。

1.2 藥品和試劑

丹梔逍遙散處方為：白術(shù)10 g，柴胡6 g，當歸10 g，茯苓 15 g，甘草 5 g，牡丹皮 15 g，山梔 10 g，芍藥10 g，薄荷5 g，煨姜5 g。飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。先加蒸餾水浸泡30 min，水煎煮兩次，2次所得濾液混合后濃縮，生藥含量為0.91 g/mL，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。炔雌醇環(huán)丙孕酮片（商品名：達英-35，每片含醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇 0.035 mg）由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司提供，購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。DHEA購自湖北芳通藥業(yè)有限公司，注射用大豆油購自蘇州捷易龍貿(mào)易有限公司，T、AMH放射免疫試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所，AMH免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機（德國LEIKA儀器有限公司），脫水機、包埋機（武漢俊杰電子有限公司），金迪YD-A生物組織攤片機（浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠），DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造商有限公司），Motic BA410研究型顯微鏡 （麥克奧迪實業(yè)集團公司），Motic Images Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司）。

2 方法

2.1 PCO大鼠模型的制備與評價[4-5]

SD大鼠喂養(yǎng)至23 d齡后，按隨機數(shù)字表法隨機分為2組，即空白對照組20只，模型制備組40只。模型制備組每日上午10點頸背部皮下注射DHEA 0.06 g/(kg·d)+0.2 mL 注射油劑（大豆油），溶劑用量恒定為0.2 mL不變，由于每天每只大鼠均需稱量不等的DHEA單獨配制不同濃度的注射液，在此基礎(chǔ)上對DHEA注射液的配制進行調(diào)整，按DHEA 0.06 g/(kg·d)+0.2 mL注射油劑 （大豆油）來換算?？瞻讓φ战M20只，同期每日上午10點頸背部皮下注射0.2 mL注射油劑，連續(xù)20 d。每日稱體質(zhì)量，定期觀察攝食及活動情況，注射10 d后開始每天下午4時進行1次陰道脫落細胞學觀察，用光滑吸管吸取少量生理鹽水，沖入大鼠陰道內(nèi)，吸取少量陰道液，涂于載玻片上直接光鏡觀察，觀察其動情周期變化，陰道涂片顯示模型制備組大鼠光鏡下僅見大量白細胞，少量角化細胞提示一直處于動情間期，失去規(guī)律性變化，無排卵；正常組仍保持規(guī)律的動情周期。注射第20日當晚8時禁食，次日晨起各組隨機抽取10只大鼠，頸椎脫臼法處死大鼠，解剖雙側(cè)卵巢，以卵巢最大平面作為待檢平面石蠟包埋，進行HE染色觀察卵巢形態(tài)學變化判定造模是否成功。

2.2 藥物干預方法

判定造模成功后，模型制備成功大鼠按隨機數(shù)字表分為3組，分別是模型組、丹梔逍遙散組、達英-35組。模型組每天灌服等量蒸餾水，丹梔逍遙散組每天按時灌服丹梔逍遙散方，1次/d，給藥劑量換算法以成人女性平均體質(zhì)量60 kg體表面積換算，折合到大鼠用藥劑量為 9.2 g/（kg·d）， 約為 1 mL/100 g，達英-35組每天灌服達英-35（每片含醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg），臨床劑量為2.035 mg/d，折合到大鼠約為 0.2 mg/（kg·d），以蒸餾水溶解后，灌胃量按當日大鼠體質(zhì)量灌服藥物，連續(xù)灌胃21 d，停藥7 d，28 d為1個療程，共給藥3個療程。

2.3 標本采集及組織形態(tài)學檢查

頸椎脫臼法處死大鼠，摘取大鼠雙側(cè)卵巢，除去表層脂肪結(jié)締組織，用4%多聚甲醛固定,雙側(cè)卵巢作如下操作：一側(cè)HE染色后行形態(tài)學檢查，觀察卵巢形態(tài)學變化，另一側(cè)行免疫組化法檢測AMH蛋白表達情況。

2.4 血清相關(guān)指標檢測

大鼠灌胃完畢后所有大鼠禁食水12 h，斷頸取血后靜置離心，3 000 r/min離心20 min,收集上清液，-20℃冰箱儲存，按放免試劑盒說明書測定血清T及AMH。

2.5 卵巢組織免疫組織化學分析

按照SP檢測試劑盒說明書進行，工作濃度為1∶100，以細胞質(zhì)中有棕黃色或者棕褐色顆粒出現(xiàn)為陽性表達。切片置于400倍高倍鏡下觀察，每張切片隨機選擇觀察5個高倍鏡視野，采用Motic Images Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行分析，以切片背景的灰度值作背底校正，測定平均光密度值（average optical density,AOD）。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠卵巢形態(tài)組織學

空白對照組大鼠肉眼觀見卵巢色澤較紅潤，HE染色光鏡下可見空白對照組顆粒細胞排列整齊，形態(tài)完整，呈多層改變，可多達8～9層。模型組大鼠肉眼觀見卵巢表面蒼白，包膜增厚，隱約可見擴張的囊泡，光鏡下可見囊狀擴張卵泡，卵泡內(nèi)可見卵母細胞及放射冠消失，顆粒細胞層數(shù)減少，可為2～3層，且排列較為疏松，提示PCO大鼠模型造模成功。見圖1。

圖1 大鼠卵巢組織光鏡圖（HE，×400）

3.2 大鼠血清T、AMH水平表達的比較

與空白對照組比較，模型組、丹梔逍遙散組、達英-35組T水平均顯著升高（P＜0.01），模型對照組AMH水平升高（P＜0.01），但丹梔逍遙散組、達英-35組與空白對照組比較AMH水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，丹梔逍遙散組、達英-35組T 及 AMH 水平下降（P＜0.01 或 P＜0.05）。 見表1。

3.3 卵巢局部組織AMH表達比較

與空白對照組比較，模型組、達英-35組AMH表達強度升高（P＜0.01），但丹梔逍遙散組與其比較無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，丹梔逍遙散組、達英-35組AMH表達強度均下降（P＜0.05）。見表1，圖2。

表1 各組 T、AMH、AMH 蛋白表達的比較（±s）

表1 各組 T、AMH、AMH 蛋白表達的比較（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 n T（ng/mL） AMH（ng/mL） AMH吸光度值（OD）空白對照組 10 0.123±0.009 5.252±0.621 0.307±0.117模型組 10 0.172±0.006△ 6.078±0.325△ 0.498±0.105△丹梔逍遙組 10 0.132±0.004△▲▲5.046±0.552▲▲ 0.302±0.278▲達英-35組 10 0.144±0.006△▲▲5.628±0.420▲ 0.405±0.662△▲F值 101.248 8.479 13.342 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 各組大鼠卵巢局部AMH蛋白的表達（免疫組織化學法，×400）

4 討論

PCOS是高度異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病和代謝紊亂疾病，高雄激素血癥與PCOS發(fā)病有相關(guān)性[6]。隨著國內(nèi)外學者對于PCOS病理機制研究越來越多，AMH與雄激素在HA患者卵巢局部微環(huán)境中的作用也日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的AMH水平高于正常同齡女性的2～3倍，且PCOS患者的AMH水平與睪酮水平具有相關(guān)性[7]。Xia等認為AMH與雄激素二者之間的失調(diào)才是造成卵巢多囊化的主要原因[8]。其他報道[9]指出AMH在高雄激素的PCOS患者外周血中的表達量遠高于雄激素水平正常但卵巢中有更多小卵泡的PCOS患者，說明AMH與卵泡數(shù)量并非簡單線性關(guān)系，可能是雄激素和 AMH對卵巢多囊化的改變起著協(xié)同作用。

本實驗結(jié)果顯示，模型對照組較空白對照組血清AMH水平及T水平明顯升高（P＜0.01），且模型對照組AMH表達明顯高于空白對照組，這可能是睪酮水平的增高促進了AMH的產(chǎn)生，而AMH的高表達抑制了芳香化酶的活性，阻礙其合成及雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化過程，造成局部卵巢高雄激素的微環(huán)境改變，引起HA。我們已知過多的雄激素可以提高始基卵泡向竇前和小竇卵泡發(fā)展速度，超過臨界，則可阻礙優(yōu)勢卵泡的選擇，而小竇卵泡中的顆粒細胞激素轉(zhuǎn)化并非朝著雌激素而是進一步加重了局部高雄激素環(huán)境，周而復始使睪酮與AMH之間形成一個惡性通路，造成HA，并導致了卵巢多囊化。因此，我們認為HA與卵巢局部微環(huán)境AMH及雄激素調(diào)節(jié)失常有關(guān)。

在臨床上，PCOS高雄激素血癥患者往往表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)、痤瘡、毛發(fā)濃密、脫發(fā)、肥胖等肝郁化熱癥狀。肝之不調(diào)影響到腎、脾、胃、心、肺等多臟腑的病變，導致痰、濕、熱（火）、瘀等多重病理因素交織，但肝氣郁結(jié)的病機貫穿HA發(fā)生發(fā)展的始終，為從肝論治HA提供了理論依據(jù)。袁迎軍等[10]用隨機數(shù)字表法將73例肝郁血熱型PCOS患者分為中藥組37例和西藥組36例，中藥組口服丹梔逍遙散加減，西藥組口服達因-35,3個月為1個療程，停藥1個月經(jīng)周期后兩組血清 LH、LH/FSH、T 均下降 (P＜0.05)，E2、FSH、PRL無明顯變化 (P＞0.05)。停藥6個月經(jīng)周期后，中藥組血清LH、LH/FSH、T仍較治療前下降(P＜0.05)，西藥組恢復到治療前水平。丹梔逍遙散加減可有效治療肝郁血熱型PCOS，且遠期療效肯定。本研究選用導師多年來運用治療PCOS高雄激素血癥的基本處方——丹梔逍遙散。源于明朝薛己著《內(nèi)科摘要》，又名加味逍遙散，由山梔子、牡丹皮、當歸、茯苓、白術(shù)、柴胡、牡丹皮、甘草等藥物組成。方中牡丹皮調(diào)肝瀉火，活血化瘀，梔子疏肝瀉火，內(nèi)清血熱，引火下行，當歸、白芍益榮養(yǎng)血以養(yǎng)肝也。四藥合用清肝火瀉內(nèi)熱，白術(shù)、茯苓、甘草實脾土御肝木，益脾和中。獨柴胡一味，一以為厥陰之報使，一以升發(fā)諸陽。薄荷少許，疏散郁遏之氣，煨姜降逆和中。諸藥合用，正具有疏肝清熱、養(yǎng)血健脾之效，我們的研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，丹梔逍遙散組、達英-35組T水平均下降（P＜0.01）。此外，還檢測了AMH水平及其蛋白表達強度，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，丹梔逍遙散組AMH水平、AMH表達強度均下降（P＜0.01或P＜0.05）。說明丹梔逍遙散在一定程度上也能夠降低AMH水平及AMH蛋白表達強度。根據(jù)Jonard和Dewailly[11]對AMH在PCOS中的作用機制提出的假說，認為丹梔逍遙散治療HA可能是通過抑制高水平的AMH，降低AMH蛋白表達，從而作用于顆粒細胞芳香化酶，促進其合成，并增加卵泡對FSH敏感性，使得PCOS中卵巢AMH與FSH的平衡趨向中，由以AMH抑制芳香化酶作用為主的部分減弱，而增強FSH激活芳香化酶的作用，促使顆粒細胞將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，阻斷睪酮與AMH之間的惡性通路，調(diào)節(jié)二者改善卵巢局部微環(huán)境，從而改善HA。

綜上所述，實驗提示丹梔逍遙散能夠降低AMH及T水平，降低顆粒細胞AMH蛋白表達改善高雄激素狀態(tài)，達到治療HA的目的。中藥治療HA是多環(huán)節(jié)、多靶點的協(xié)同過程，丹梔逍遙散是否通過其他途徑影響AMH從而改善HA尚不得知。因此，進一步以卵巢局部AMH為切入點深入研究中醫(yī)藥干預HA卵巢局部微環(huán)境的調(diào)控機制，可為我們探索中藥干預PCOS高雄激素血癥疑難病癥方法研究提供理論依據(jù)和新的思路。

[1]Qiao J,Feng HL.Extra and intraovarian factors in polycystic ovary syndrome:impacton oocyte maturation and embryo developmental competence[J].Hum Rerod Update,2011,17(1):17-33.

[2]李 軼,李瑞岐,歐頌邦,等.高雄激素和非高雄激素型多囊卵巢綜合征患者血清抗苗勒管激素分泌特點及診斷效能比較[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2014,30（2）:111-115.

[3]楊正望,文 炯,張增玲.補腎化瘀方對PCOS大鼠卵巢顆粒細胞CYP450表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2011,31（1）:30-32+39.

[4]張曉薇,鄺健全,曾愛群,等.脫氫表雄酮誘導多囊卵巢綜合征動物模型的研究[J].廣州醫(yī)學院學報,2000,28(3):14-18+91.

[5]李 燕,張慶文,王紅彬.脫氫表雄酮誘導SD大鼠多囊卵巢綜合征模型的實驗研究[J].中國醫(yī)藥科學,2013，3（7）:35-37.

[6]石玉華,陳子江,唐 蓉,等．多囊卵巢綜合征患者內(nèi)分泌及代謝特征研究[J]．山東醫(yī)藥,2006,46(26):4-6.

[7]Dewailly D,Pigny P,Soudan B,et al.Reconciling the definitions of polycystic ovary syndrome:The ovarian follicle number and serum anti-Mullerian hormone concentrationsaggragate with the makers of hyperandrogenism[J].J Clin Endocrinol Metab,2010,95(9):4399-4405.

[8]Xia N,Tsatsoulis A.Review:Fetal programming of polycystic ovary syndrome by androgen excess:evidence from experimental,clinical,and genetic association studies[J].J Clin Endocrinol Metab,2006,91(5):1660-1666.

[9]Eldar-Geva T,Margalioth EJ,Gal M,et al.Serum anti-Mullerian hormone levels during controlled ovarian hyperstimulation in women with polycystic ovaries with and without hyperandrogenism[J].Hum Reprod,2005,20(7):1814-1819.

[10]袁迎君,藍 嵐.丹梔逍遙散加減治療肝郁血熱型多囊卵巢綜合征 37 例療效觀察[J].河北中醫(yī),2014，36（8）:1175-1178.

[11]Jonard S,Dewailly D.The follicular excess in polycystic ovaries,due to intravarian hyperandrogenism,may be the main culprit for the follicular arrest[J].Hum Reprod Update,2004,10:107-117.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Danzhi Xiaoyao Powder on the Expression of Serum T,AMH and Local Ovaries AMH in Polycystic Ovaries Rats

HOU Liying1,DENG Liling1,LUO Pei1,YU Ximing1,QUAN Chunmei1,ZHAO Na1,YANG Zhengwang2*
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Gynecology and Obestrics,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObejectiveTo investigate the effect of Danzhi Xiaoyao powder on the experssion of serum testosterone(T),anti-mulerian hormone (AMH)and local ovarian AMH in polycystic ovaries (PCO)rats.MethodsThe PCO rat models were built by subcutaneous injection of dehydroepiandrostexone at back of SD female rats. The succesfully modeling rats were randomly devided into normal group,Diane-35 group,Danzhi Xiaoyao powder group and the blank group was also assigned.The rats were given intragastric gavage with distilled water,Diane-35 and Danzhi Xiaoyao powder,respectively,continuously for 21 days,stopped for 7 days as a cycle.After 3 cycles of administration,the rats were executed.The serum level of T and AMH were measured with radioimmunoassy.The local ovarian expression of AMH were measured with immunohistomchemical.ResultsCompared with the model group,the serum of T,AMH and the expression of AMH in the Danzhi Xiaoyao Powder group were reduced (P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionDanzhi Xiaoyao powder could treat hyperandrogenism (HA)by lowering the serum T,AMH and the local ovarian AMH expression,so it can improve HA with benign regualtion on AMH.

polycystic ovary syndrome;hyperandrogenism;anti-mulerian hormone;Danzhi Xiaoyao powder;cortex moutan radicis;fructus gardeniae

R285.5；R289.53；R711.75

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.02.007

2016-07-02

湖南省自然科學基金項目（14JJ7061）。

侯麗瑩，女，在讀碩士研究生，研究方向：生殖內(nèi)分泌。

*楊正望，女，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，E-mail：435068288@qq.com。

本文引用：侯麗瑩，鄧麗玲，羅 佩，余曦明，全春梅，趙 娜，楊正望.丹梔逍遙散對多囊卵巢大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（2）：141-144.