寒地水稻紋枯病菌形態(tài)特征及ITS鑒定

李修平 馬文東 ?，| 宋成艷 趙雪 張麗敏

摘要 [目的]分離鑒定寒地水稻紋枯病病原菌，為寒地水稻紋枯病抗性育種提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。[方法]采集水稻紋枯病病株并分離培養(yǎng)病菌，采用柯赫氏檢驗(yàn)法和ITS鑒定的方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定。[結(jié)果]將分離獲得病菌以牙簽嵌入法接種水稻植株，植株呈現(xiàn)水漬狀典型紋枯病病斑。利用ITS1和ITS4引物擴(kuò)增病菌DNA，測(cè)序結(jié)果拼接后與NCBI上已知序列比對(duì)，結(jié)果表明該菌與登錄號(hào)為No.KT362083.1的Rhizoctonia solani（立枯絲核菌）有97%的同源性。[結(jié)論]形態(tài)學(xué)特征鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致，該菌為立枯絲核菌，為寒地水稻紋枯病致病菌。

關(guān)鍵詞 寒地水稻；紋枯病菌；形態(tài)觀察；ITS鑒定

中圖分類號(hào) S435.111.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0156-03

Morphological Observation and ITS Identification on Rice Sheath Blight （Rhizoctonia solani）in Cold Region

LI Xiu-ping1，MA Wen-dong2，CHANG Wei3 et al （1.School of Life Sciences，Jiamusi，University，Jiamusi，Heilongjiang 154007；2.Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Jiamusi，Heilongjiang 154026；3.Key Laboratory of Soybean Biology of Chinese Education Ministry，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030）

Abstract [Objective] Strain of rice sheath blight in cold region was isolated，and identificated in order to provide technical support and theoretical basis for rice sheath blight resistance breeding.[Method] Diseased plants from rice sheath blight were collected，and strain was isolated and cultured.Morphological observation and molecular identification on strain were carried out by using the method of Koch′s test and ITS identification.[Result] The isolated strain inoculated rice plants with toothpick embedding method，the plants showed hygrophanous typical sheath blight spots.ITS1 and ITS4 primers were used to amplify the strain DNA，sequencing results were compared with known sequences on NCBI，Blast searches results showed a high identity with reference sequences（ITS：97%）.Representative sequences of both regions were deposited to GenBank（ITS：Accession No.KT362083.1）.[Conclusion] Morphological and molecular results confirm this strain as Rhizoctonia solani，the strain is the pathogens of rice sheath blight.

Key words Rice in cold region；Rhizoctonia solani；Morphological observation；ITS identification

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的世界性水稻病害。在我國長江流域和南方稻作區(qū)，水稻紋枯病已成為危害嚴(yán)重的主要水稻病害之一[1]。20世紀(jì)90年代后，由于寒地稻作區(qū)施肥水平不斷提高，加之紋枯病菌寄主廣泛、優(yōu)秀抗源獲得較少等原因，寒地水稻紋枯病造成的產(chǎn)量損失日益嚴(yán)重，水稻紋枯病已成為影響寒地稻作區(qū)水稻生產(chǎn)的上升性主要病害之一[2]。

目前，寒地水稻紋枯病研究多集中在藥劑防治方面[3-6]，也有少量關(guān)于寒地水稻紋枯病發(fā)病規(guī)律的研究報(bào)道[2，7-9]，寒地水稻紋枯病的遺傳研究和育種工作進(jìn)展較緩慢。使用藥劑防治水稻紋枯病效果一般，而且污染環(huán)境、提高農(nóng)民生產(chǎn)成本，培育抗病優(yōu)質(zhì)寒地水稻品種是根本解決辦法?？剐澡b定是寒地水稻紋枯病抗性育種的首要工作，而分離和鑒定寒地水稻紋枯病病原菌是抗性鑒定的前提。真菌性病害的鑒定方法，傳統(tǒng)上是通過對(duì)其形態(tài)特征、生物學(xué)和生理學(xué)、致病性特征進(jìn)行描述。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，同工酶、可溶性蛋白電泳、血清學(xué)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)以及rDNA-ITS序列分析技術(shù)不斷在病原菌鑒定和遺傳學(xué)分析中廣泛應(yīng)用[10]。rDNA-ITS是目前分子系統(tǒng)性廣泛采用的標(biāo)記基因之一，近年來rDNA-ITS序列分析技術(shù)因其兩側(cè)編碼區(qū)的高度保守性及操作方法簡便、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)而被應(yīng)用于各類真菌性病害的分類鑒定和遺傳多樣性分析中[11-14]。筆者通過形態(tài)學(xué)特征觀察和ITS鑒定的方法，對(duì)采集于寒地的水稻紋枯病病株進(jìn)行了病原菌分離與鑒定，以期為寒地水稻紋枯病抗性育種提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻紋枯病菌。2014年采集于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所紋枯病發(fā)病植株，于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院病理研究室進(jìn)行分離培養(yǎng)保存[15]。

1.1.2 病菌接種植物材料。收集30份寒地水稻種質(zhì)資源，采用大田管理，每個(gè)品種種植2行，行長1 m；旱育秧，插秧規(guī)格為30 cm×10 cm。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化及形態(tài)特征觀察。

采集水稻紋枯病發(fā)病植株，采用常規(guī)組織分離法，從發(fā)病葉鞘的病健交界處進(jìn)行分離。分離得到的菌株經(jīng)純化后在PDA上進(jìn)行培養(yǎng)和形態(tài)觀察，并置于0～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將編號(hào)SB-2的菌株置于PDA平板上，于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行28 ℃光暗交替培養(yǎng)，觀察菌落、菌核形態(tài)特征，生物顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)，參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行病原菌鑒定。

1.2.2 致病性測(cè)定。

按照柯赫氏法則，對(duì)健康的寒地水稻種質(zhì)資源進(jìn)行接種，并設(shè)無傷對(duì)照，對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。接種方法參照潘學(xué)彪等[17]提出的牙簽嵌入法，將木質(zhì)牙簽剪成長0.8～1.0 cm的小段，鋪于培養(yǎng)皿底部，加入適量PDA培養(yǎng)基，覆蓋牙簽以厚度0.5～1.0 cm為宜，121 ℃高壓滅菌15 min，接種，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待菌絲密集地布滿培養(yǎng)基時(shí)進(jìn)行田間接種，每個(gè)品種接種3株，每稻叢接種3個(gè)莖稈，并掛標(biāo)簽。用鑷子將短牙簽自上向下嵌入接種莖稈第2～3葉鞘，由于該2個(gè)葉鞘不再伸長，并且接種后葉鞘抱莖狀態(tài)未被改變，故植株呈自然狀態(tài)。

1.2.3 病原菌再分離。

從接種后發(fā)病水稻植株葉鞘上分離培養(yǎng)病原菌，對(duì)其形態(tài)特征與最初接種病原菌菌株進(jìn)行比較。

1.2.4 病原菌的ITS鑒定分析。

1.2.4.1 病原菌DNA提取。在PDA固體培養(yǎng)基上接種病原菌，置于28 ℃培養(yǎng)7 d，刮取菌絲或菌核，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA。

1.2.4.2 病原菌rDNA-ITS序列分析。采用真核生物核糖體 DNA 通用引物 ITS1/ITS4 進(jìn)行擴(kuò)增。序列：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 反應(yīng)體系（25.00 μL）：5 mmol/L MgCl2 2.50 μL，10×buffer 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.00 μL，20 μmol/L引物0.25 μL，10 U/μL Taq 聚合酶0.25 μL，15 ng/μL模板DNA 3.00 μL，ddH2O 15.50 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸 10 min。陰性對(duì)照用 ddH2O 代替模板 DNA，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)后，將擴(kuò)增的菌株 PCR 產(chǎn)物送黑龍江博凱實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司進(jìn)行正反向雙向測(cè)序。

1.2.4.3 序列比對(duì)分析。將PCR測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行處理，獲得DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫上已知序列比對(duì)分析，進(jìn)行病原菌的同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

菌株SB-2在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4 d后，菌落可長滿皿，菌絲生長迅速，菌絲體初期無色，后期變淡褐色，分枝與主枝呈銳角或直角，分枝處有縊縮。成熟菌核淡褐色至褐色，半球形或類球形，菌核表面常有黏液分泌，常多個(gè)菌核聚合成團(tuán)，菌核呈深褐色圓形或不規(guī)則形，較緊密（圖1）。

2.2 菌株SB-2的致病性

菌株SB-2采用成株期牙簽嵌入法，于水稻植株分蘗末期接種于30份寒地水稻種質(zhì)資源，接種36 d后調(diào)查，接種水稻植株在近水面的葉鞘上出現(xiàn)水漬狀橢圓形斑，為水稻紋枯病典型病斑特征（圖2）。將接種后發(fā)病水稻植株進(jìn)行病原菌的再次分離培養(yǎng)，獲得與原菌株形態(tài)一致的病原菌。對(duì)照植株未表現(xiàn)出紋枯病發(fā)病癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，菌株SB-2為水稻紋枯病致病菌。

2.3 水稻紋枯病ITS序列分析鑒定

利用ITS通用引物對(duì)病原菌菌株SB-2提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得750 bp的片段，回收該片段并雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果處理后與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，在GenBank中已知序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該病原菌ITS序列與登錄號(hào)為KT362083.1的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）同源性高達(dá)97%，表明該菌為Rhizoctonia solani，為寒地水稻紋枯病致病菌。

3 結(jié)論與討論

對(duì)2014年采集的水稻紋枯病發(fā)病植株進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)并獲得菌株SB-2，通過形態(tài)特征觀察、柯赫氏法則致病性鑒定，接種該菌株后水稻植株呈現(xiàn)紋枯病水漬狀病斑，表明該菌株為寒地水稻紋枯病致病菌；采用rDNA-ITS序列進(jìn)行分子鑒定，菌株SB-2序列與登錄號(hào)為No.KT362083.1的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-1-IA）同源性高達(dá)97%，該菌株為寒地水稻紋枯病致病菌，形態(tài)特征鑒定結(jié)果與ITS分子鑒定結(jié)果一致。

傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要依靠真菌的形態(tài)特征及生理生化特征等描述，但由于其種類眾多、個(gè)體多態(tài)性差異明顯等原因，常會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[18]。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，真菌的分類中引入了rDNA-ITS序列分析技術(shù)，核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔序列進(jìn)化速度快、種間變異豐富，該技術(shù)具有操作簡便、特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確、GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫儲(chǔ)存大量序列信息可供查詢等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病原菌的鑒定及分類、遺傳多樣性等研究[19-20]。

融合菌群測(cè)定是目前絲核菌分類的另一有效方法，可獲得菌的種屬鑒定甚至是亞類的鑒定結(jié)果，但具有菌絲融合現(xiàn)象復(fù)雜、融合標(biāo)準(zhǔn)難以判斷準(zhǔn)確、鑒定過程復(fù)雜、時(shí)間長等缺點(diǎn)[21]。將ITS快速分子鑒定方法與融合菌群分類細(xì)致準(zhǔn)確的測(cè)定方法相互結(jié)合、相互驗(yàn)證，能夠更加準(zhǔn)確有效地開展病原菌鑒定工作。

水稻紋枯病對(duì)寒地水稻生產(chǎn)危害不斷加重，而關(guān)于寒地水稻紋枯病病原菌鑒定分離的研究鮮見報(bào)道，確定寒地水稻紋枯病病原菌分類及獲得病原菌菌種，對(duì)于寒地水稻紋枯病抗性育種具有重要意義，可為其提供抗性鑒定技術(shù)工具，為寒地水稻紋枯病遺傳、發(fā)病規(guī)律研究及防治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]王玲，左示敏，張亞芳，等.中國南方八?。ㄗ灾螀^(qū)）水稻紋枯病菌群體 遺傳結(jié)構(gòu)的SSR分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（13）：2538-2548.

[2] 宋成艷，王桂玲，孟慶忠，等.寒地水稻紋枯病初步研究[J].植物保護(hù)，2002，28（2）：8-11.

[3] 胡玉明.5%己唑醇懸浮劑防治水稻紋枯病田間藥效試驗(yàn)[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2016（12）：4.

[4] 葉秀芬，柴榮耀，張震，等.12種殺菌劑對(duì)水稻紋枯病的防治效果[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2011-2013.

[5] 顧菊根，蔣秀芬，周君，等.不同藥劑防治水稻紋枯病試驗(yàn)研究[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2016（6）：131，149.

[6] 史興濤.防治水稻紋枯病藥劑田間篩選試驗(yàn)[J].湖北植保，2016（4）：20-21，26.

[7] 李貴臣.寒地水稻紋枯病的發(fā)生與防治[J].北方水稻，2012，42（6）：59，66.

[8] 辛惠普，靳學(xué)慧，姚守禮，等.寒地水稻紋枯病發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，12（2）：1-6.

[9] 靳學(xué)慧，馬匯泉，郭永霞.寒地水稻紋枯病產(chǎn)量損失測(cè)定[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（2）：9-12.

[10] 文景芝.大豆疫霉根腐病菌檢測(cè)鑒定方法及病害傳播途徑研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2001：10-14.

[11] 王麗娟，徐秀德，姜鈺，等.東北玉米苗枯病病原鐮孢菌rDNA ITS鑒定[J].玉米科學(xué)，2011（4）：131-133，137.

[12] 王春蘭，朱品，黃睿，等.杭州地區(qū)一株侵染水稻的嗜水小核菌菌株的鑒定[J].科技通報(bào)，2013（9）：55-60.

[13] 劉寶玉，胡俊，蒙美蓮，等.馬鈴薯黑痣病病原菌分子鑒定及其生物學(xué)特性[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011，38（4）：379-380.

[14] 王艷，曾翠云，陳紅剛，等.黨參斑枯病病原菌及其生物學(xué)特性[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2016（6）：928-934.

[15] 彭紹裘，范坤成.水稻紋枯病研究論文選集[C].長沙：湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，1997.

[16] 陸家云.植物病原真菌學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：362.

[17] 潘學(xué)彪，陳宗祥，徐敬友，等.不同接種調(diào)查方法對(duì)抗水稻紋枯病遺傳研究的影響[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997（3）：28-33.

[18] 陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3785-3786，3792.

[19] 張正光，王源超，鄭小波.大豆疫霉和苜蓿疫霉rDNA ITS序列分析[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（4）：542-548.

[20] XU P F，HAN Y P，WU J J，et al.Phylogenetic analysis of the sequences of rDNA internal transcribed spacer （ITS） of Phytophthora sojae[J].Jounal of genetics and genomics，2007，34（2）：180-188.

[21] ELIAS K S，SCHNEIDER R W.Vegetiative compatibility groups in Fusarium oxysporum f.sp lycopersici[J].Phytopathol，1991，81（2）：159-162.