南五味子果實多糖和脂溶性物質(zhì)抗菌抗氧化作用研究

林雄平 林彬彬 卓雄標 蘇巧玲 彭彪

摘要 [目的]研究南五味子果實多糖和脂溶性物質(zhì)的抗菌抗氧化作用。[方法]采用水提取法、乙醚索氏提取法，分別提取南五味子果實多糖和脂溶性物質(zhì)，并對其抗菌作用、抑制羥自由基能力進行研究，并初步鑒定果皮脂溶性物質(zhì)的化學(xué)成分。[結(jié)果]南五味子果皮、果肉的脂溶性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌有抗菌作用，抑菌圈分別為19.39、18.28 mm；南五味子果皮、果肉、種子的脂溶性物質(zhì)對枯草芽孢桿菌有抗菌作用，抑菌圈分別為32.87、19.54、7.52 mm。南五味子多糖、果肉和種子的脂溶性物質(zhì)，抑制羥自由基能力分別為4 011.48、3 079.01、1 082.66 U/mL。[結(jié)論]南五味子果實具有較強的抑菌作用及抑制羥自由基能力。南五味子可作為一種野生水果開發(fā)。

關(guān)鍵詞 南五味子；果實；抗羥自由基；抗菌；多糖；脂溶性物質(zhì)

中圖分類號 S789.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0119-03

Study on the Antimicrobial and Antioxidant Activities of Polysaccharide and Liposoluble Substance from Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep Fruit

LIN Xiong-ping1，2，LIN Bin-bin1，ZHUO Xiong-biao3 et al （1.Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde，F(xiàn)ujian 352100；2.Engineering Technology Center of Fujian Characteristic Medicinal Plants，Ningde，F(xiàn)ujian 352100；3.Department of Assets and Logistic Management，Ningde Normal University，Ningde，F(xiàn)ujian 352100）

Abstract [Objective] To study the antimicrobial and antioxidant activities of polysaccharide and liposoluble substance from Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep fruit.[Method] The antibacterial activity and inhibition of hydroxyl free radical were studied on K.longipedunculata fruit though the method of water extraction and ethyl ether soxhlet′s extraction，and the chemical composition of peel lipid soluble substances were identified preliminarily.[Result] The results were as follows，lipid soluble substances from K.longipedunculata peel and flesh had antibacterial effect on Staphylococcus aureus and inhibition zone were 19.39，18.28 mm respectively.The inhibition zone of lipid soluble substances from K.longipedunculata peel and flesh and seed against Bacillus subtilis were 32.87，19.54，7.52 mm respectively.Antihydroxyl radical ability of polysaccharides and fat soluble extraction of flesh and seed fat soluble extraction were 4 011.48，3 079.01，1 082.66 U/mL.[Conclusion] K.longipedunculata has strong antibacterial activity and inhibition of hydroxyl radical capacity.K.longipedunculata can be developed and utilized as wild fruit resources.

Key words Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep；Fruit；Inhibition of hydroxyl free radical；Antibiosis；Polysaccharide；Fat soluble substances

南五味子（Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep），俗稱土木香、紫荊皮、小血藤[1]，集中在黃河流域以南，我國是南五味子的原產(chǎn)地，主要分布于云南、貴州、四川、廣東、廣西、福建等省[2]。南五味子為名貴常用中藥材，其藥用部位主要是藤和根，具有補血活血、祛風(fēng)除濕的功效[3]。劉麗等[4]研究南五味子不同溶劑提取物抑菌活性及其組分性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，南五味子水及乙醇提取物對8種致病菌均有良好的抑制作用，南五味子乙醇提取物含有黃酮、多酚、甾體、三萜、生物堿、香豆素與內(nèi)酯等。南五味子乙醇提取物對食品腐敗細菌具有顯著的抑菌活性[5]。另外，南五味子提取的木脂素可結(jié)合失眠大鼠的5-HT1A受體，作為一個潛在的5-HT1A受體激動劑藥物[6]。南五味子的果實提取物可作為γ-氨基丁酸受體的調(diào)節(jié)劑，提高增強γ-氨基丁酸受體上的氯電流[7]。但目前尚未見到有關(guān)乙醚為溶劑提取南五味子并進行抑菌活性、抗自由基能力的研究及其組分性質(zhì)鑒定、開發(fā)與綜合利用等方面的研究報道。筆者對南五味子果皮、果肉、種子分別進行乙醚溶劑提取脂溶性物質(zhì)，將提取物進行抗菌作用、抗羥自由基能力研究，再對抗菌作用最強的成分進行化學(xué)成分分析，為南五味子作為食藥兩用水果研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

南五味子果實采自福建省寧德市屏南縣南五味子種植園，采摘后將成熟果實去除雜質(zhì)，淘洗，瀝干，晾干，鮮果裝于塑料袋中，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。部分鮮果自然風(fēng)干或35 ℃烘干后，分別剝?nèi)」?、果肉和種子，以及一整串南五味子研磨成粉，過40目篩，備用。

1.2 菌種 細菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis（Ehren-berg）Cohn]、大腸桿菌[Escherichia coli （Migula） Casleillni and Chalmers]。真菌：啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis Hansen）、黑曲霉（Aspergillus nige v.Tiegh）。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取。采用

水提取法。取一整串南五味子粉末15 g，精密稱定，置于蒸餾瓶中，加蒸餾水150 mL，連接進出水口，下進水，上出水，則進出水口的另一端與低溫冷卻液循環(huán)泵相連。在加熱爐上100 ℃回流8 h，將蒸餾瓶中回流所得物離心（3 000 r/min，25 ℃），保留底層水提取液，再將水提取液蒸發(fā)，即可得到水提取法所提取的多糖物質(zhì)，置于4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.2 脂溶性物質(zhì)的提取。采用乙醚索氏提取法。精密稱定南五味子果皮粉末20 g、果肉粉末8 g、種子粉末20 g，分別用濾紙包扎結(jié)實，并在封口處系上白色細繩，防止果皮粉末從包扎袋中沖刷出來，而堵住索氏提取器的虹吸管；分別將裝有粉末的包扎袋置于提取管中，最高部位不得與提取管最上部液體出口等高或更高；冷凝管下端口與進水管相連，上端口與出水管相連，而進出水管的另一端與低溫冷卻液循環(huán)泵相連；加乙醚300 mL于提取瓶中，于60 ℃索氏提取10 h；揮發(fā)干溶劑，即得南五味子果皮、果肉、種子在乙醚中的脂溶性物質(zhì)，置于4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.3 提取物抗菌效果測定。

配置好的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基同培養(yǎng)皿、無菌水、玻璃珠等放入手提式壓力蒸汽滅菌器中121 ℃，分別滅菌20、30 min，80 ℃恒溫箱干燥培養(yǎng)皿，將接種環(huán)、培養(yǎng)皿、無菌水、玻璃珠等放入無菌操作臺，紫外滅菌30 min以上，打開風(fēng)機運轉(zhuǎn)10 min。雙手及雙臂用70%酒精消毒再進行無菌操作，待培養(yǎng)基冷卻到一定程度，未凝固時，將各菌種分別用接種環(huán)接種到5瓶無菌水中，倒入數(shù)顆玻璃珠搖勻，將稀釋的菌水分別倒入5瓶不同的培養(yǎng)基中混勻，并將每瓶帶有菌種的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿20～25 mL，靜置冷卻制成平板，做好標簽，待冷卻凝固后分別貼上沾有濃度5 mg/mL樣品和空白對照的濾紙片，設(shè)3個重復(fù)組，然后將金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌倒置在37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，啤酒酵母、黑曲霉培養(yǎng)基倒置在28 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察各組分的菌種生長狀況，并測定抑菌圈的直徑大小。

1.3.4 提取物對抑制羥自由基能力的測定。

1.3.4.1 試劑組成與配制。①0.03%H2O2標準應(yīng)用液的配制：3%H2O2標準貯備液∶雙蒸水=1∶99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。②底物應(yīng)用液的配制：底物貯備液∶雙蒸水=1∶99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配（樣本為抑制羥自由基，即測定管吸光度比對照管吸光度低）。③試劑3應(yīng)用液∶甲液應(yīng)用液與乙液等比例混合，按需配制，余下4 ℃保存。④顯色劑的配制：試劑4應(yīng)用液∶試劑5∶試劑6∶冰乙酸=8∶3∶3∶2，現(xiàn)用現(xiàn)配。其中，試劑3、4、5、6來自抑制羥自由基測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3.4.2 羥基自由基能力的測定。以上配制好的應(yīng)用液，先在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min，混勻在37 ℃水浴中進行。

將表1中空白組的各溶液混勻，37 ℃反應(yīng)1 min，從加完試劑3應(yīng)用液開始到1 min結(jié)束，立即加入顯色劑終止反應(yīng)，1次只做1根試管。其他組各溶液混勻，室溫放置20 min，在550 nm、1 cm光徑、雙蒸水調(diào)零條件下，測定各管吸光度值。

抑制羥自由基能力=對照OD值-測定OD值標準OD值-空白OD值×標準品濃度×1 mL 取樣量×樣品測試前稀釋倍數(shù)式中，抑制羥自由基能力單位為U/mL；標準品濃度為8.824 mmol/L；樣品測試前稀釋100倍。

1.3.5 色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法分析果皮脂溶性物質(zhì)的化學(xué)成分。

Vrian450-GC/240-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對南五味子果皮各化合物進行分離和結(jié)構(gòu)分析，色譜柱為VF-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm彈性石英毛細柱，進樣口溫度280 ℃，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，流量1 mL/min，載氣為氦氣；柱溫程序：從初始溫度60 ℃開始，以15 ℃/min的速度加熱，在15 min內(nèi)加熱至280 ℃；離子源為EI，質(zhì)量掃描范圍40～500 amu，掃描方式SCAN/FULL，進樣量1.0 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 南五味子果實多糖脂溶性物質(zhì)的提取 從表2可看出，水提取法主要是提取南五味子果實的多糖物質(zhì)，南五味子果實的多糖提取高達43.3%，說明南五味子是一種含糖量較高的聚合漿果。乙醚索氏提取法，主要提取脂溶性物質(zhì)，南五味子脂溶性物質(zhì)提取果皮提取率3.5%、果肉提取率2.0%、種子提取率40.7%，三者相比較，種子脂溶性物質(zhì)含量最高，可見種子營養(yǎng)物質(zhì)含量最高。

2.2 南五味子果實提取物抗菌效果 由表3可知，南五味子果實脂溶性物質(zhì)對2種細菌有抑制作用，其中，南五味子果皮脂溶性提取物的抗菌效果最好，最大的抑菌圈可達32.87 mm。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對果皮中脂溶性物質(zhì)最為敏感，而對種子中脂溶性物質(zhì)敏感度相對比較弱或幾乎不敏感；枯草芽孢桿菌比金黃色葡萄球菌對果皮的脂溶性提取物更為敏感，所以枯草芽孢桿菌的抑菌圈更大。乙醚脂溶性物質(zhì)的提取對G+菌有抑菌作用，對G-菌、真菌無抑菌作用。

2.3 南五味子果實提取物抑制羥自由基能力

試驗結(jié)果表明，南五味子多糖、果肉脂溶性物質(zhì)和種子脂溶性物質(zhì)均有抑制羥自由基能力，其中多糖抑制能力最強，抑制能力高達4 011.48 U/mL，而果皮脂溶性物質(zhì)的結(jié)果為負數(shù)，因此沒有抑制羥自由基能力。抑制羥自由基能力由大到小依次為多糖、果肉脂溶性物質(zhì)、種子脂溶性物質(zhì)、果皮脂溶性物質(zhì)。南五味子果實抑制羥自由基能力強，因此可以對南五味子果實的抗氧化性進行更深入的研究。

2.4 果皮脂溶性物質(zhì)的化學(xué)成分

對南五味子果皮脂溶性物質(zhì)的總離子流圖（圖1）進行分析鑒定，經(jīng)計算機譜庫檢索，對檢索結(jié)果與標準質(zhì)子圖核對，初步確定了南五味子果皮脂溶性物質(zhì)的11種成分，其主要有8種：亞硫酸己十四酯、氯代十八烷、2，6-二異丙基萘、正十九烷、（-）-α-蒎烯、1-碘四十八烷、正十六烷、N，α-二甲基苯乙胺。

3 討論與小結(jié)

南五味子果實為聚合漿果，掛果量大，平均一串有50～60顆，果核具觀賞價值，成熟果可生食，植物的果實與北五味子有所不同[8]，化學(xué)成分也有所差異[9]。南五味子是我國傳統(tǒng)藥材之一，被我國衛(wèi)生部頒布為可用于保健食品的物質(zhì)[10]。

該試驗對南五味子果實進行多糖、脂溶性物質(zhì)的提取，采用水提取法提取多糖，粗提取率為43.3%，與譚曉虹等[11]報道的南五味子超聲波提取多糖含量（8.7%）相比，南五味子果實的水提取多糖的含量高于超聲波提取多糖的含量，可見水提取法提取多糖效果更佳。采用乙醚索氏法提取脂溶性物質(zhì)，總粗體率46.2%，與劉麗等[4]報道中的南五味子乙醇提取率（34.2%）、乙酸乙酯提取率（67.1%）、石油醚（67.0%）相比，南五味子果實溶于乙醚中的物質(zhì)大于溶于乙醇中的物質(zhì)，可見南五味子果實中脂溶性物質(zhì)含量較高。

南五味子果實各部位的乙醚提取，得到的脂溶性物質(zhì)進行抗菌試驗。劉麗等[4]研究發(fā)現(xiàn)，整串果實提取物質(zhì)量濃度100 mg/mL的溶液對金黃色葡萄球菌抑菌圈分別為乙醇提取物26.17 mm、乙酸乙酯提取物17.35 mm，石油醚提取物無抑菌作用；對枯草芽孢桿菌抑菌圈分別為乙醇提取物19.14 mm、乙酸乙酯提取物14.37 mm，石油醚提取物無抑菌作用。該試驗測試溶液的質(zhì)量濃度為5 mg/mL，南五味子果皮、果肉的乙醚提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈分別為19.39、18.28 mm；果皮、果肉、種子的乙醚提取物對枯草芽孢桿菌抑菌圈分別為32.87、19.54、7.52 mm，與劉麗等[4]研究結(jié)果相比，乙醚提取物抗菌效果均強于乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果?？梢姡颐烟崛∥镏泄ぶ苄晕镔|(zhì)抗菌效果最好，抑菌圈最大的可達32.87 mm。

近年來隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，有關(guān)預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老的研究應(yīng)用前景廣泛。該試驗通過體外抗氧化試驗，對提取物采用紫外分光光度法進行測定。與趙春蘇等[12]研究的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇的超聲波提取物的清除自由基能力相比，水提取的多糖抑制羥自由基能力均強于超聲波提取物抑制羥自由基能力?？梢姡衔逦蹲庸麑嵥崛》ㄌ崛〉亩嗵俏镔|(zhì)體外抗氧化活性更好，可作為天然的抗氧化、預(yù)防衰老的食藥兩用資源進行開發(fā)。

研究抗菌效果最好的果皮脂溶性物質(zhì)成分，初步確定了南五味子果皮脂溶性物質(zhì)的8種主要成分，與卓雄標等[13]研究的南五味子種子油的主要9種成分[反式-橙花叔醇、δ-欖香烯、香樹烯、乙酸冰片酯、（+）-苜蓿烯、（+）-γ-古蕓烯、香葉基香葉醇、S-（Z）-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二烷三烯-3-醇、10-二十一（碳）烯]相比，果皮中的脂溶性物質(zhì)均不相同，可見，南五味子果皮中的物質(zhì)與種子中的物質(zhì)差別較大。因時間問題，該研究僅通過與標準圖譜核對初步確定其成分，因此在之后的試驗中可深入研究，確定南五味子果皮更為具體的成分。

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