IFN—γ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

孫俊若男 李海明 蘇韻 屈利娜 黨涵 楊磊

摘要 [目的]用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞-肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），以不同濃度的IFN-γ為阻斷劑，探討干擾素-γ（IFN-γ）對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）表型重塑的作用。[方法]將原代培養(yǎng)的BMEC分為對(duì)照組、誘導(dǎo)組（TGF-β1 10 ng/mL）、藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）及阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）。培養(yǎng)72 h后，觀察α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和膠原I（COLⅠ α1）的mRNA相對(duì)表達(dá)量。[結(jié)果]誘導(dǎo)組α-SMA、CTGF和膠原I mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P<0.05）；藥物組CTGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05），α-SMA和COLⅠ α1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P<0.05）；阻斷組IFN-γ明顯抑制了TGF-βl誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化。[結(jié)論]IFN-γ能夠負(fù)性調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞-肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），減少COLⅠ α1分泌。

關(guān)鍵詞 TGF-β1；IFN-γ；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；α-SMA；CTGF；膠原I

中圖分類號(hào) S823.9+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0099-03

Effects of Interferon-γ（IFN-γ） on the Transdifferentiation of Mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

SUN Junruonan， LI Hai-ming， SU Yun， YANG Lei* et al

（Orient Science & Technology College of Hunan Agricultural University， Changsha，Hunan 410128）

Abstract [Objective] Transforming growth factor-β1 （TGF-β1） was used to induce the transdifferentiation of mammary epithelial cells-myofibroblast cells of dairy cows. Taking different concentrations of IFN-γ as blocking agent， the effects of interferon-γ （IFN-γ） on the phenotypic remodeling of mammary epithelial cells of dairy cows were discussed. [Method] The mammary gland epithelial cells of primary culture were divided into control group，induced group （TGF-β1 10 ng/mL）， drug administration group （IFN-γ 20 ng/mL） and blocking groups（TGF-β1 10 ng/mL + IFN-γ 10，20，50，100 ng/mL） and cultured for 72 hours. mRNA expressions of α-SMA， CTGF and collagenⅠα1 were observed. [Result] mRNA relative expression quantity of a-SMA， CTGF and collagen I in induced group significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， mRNA relative expression quantity of CTGF in drug administration group had no significant difference （P>0.05）， mRNA relative expression quantity of α - SMA and COL Ⅰ α1 significantly decreased （P<0.05）. IFN-γ obviously inhibited the transdifferentiation induced by TGF-β1 in blocking group. [Conclusion] IFN-γ can negatively regulate EMT induced by TGF-β1 and reduce the secretion of COL Ⅰ α1.

Key words TGF-β1；IFN-γ；Mammary epithelial cells of dairy cows；α-SMA；CTGF；Collagen I

IFN-γ是一種Thl型細(xì)胞因子，是由抗原、有絲分裂素等刺激，由活化的CD4+Thl、CD8+T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞所分泌的一類可溶性糖蛋白，主要在單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞中表達(dá)。IFN-γ具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，包括對(duì)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的膜分子表達(dá)、活化和分化的影響。

近些年，在肝臟組織的纖維化研究中發(fā)現(xiàn)IFN-γ能夠抑制肝臟星狀細(xì)胞（HSC）增殖，對(duì)抗ECM的合成，從而抑制肝臟纖維化[1-3]。在特發(fā)性肺損傷（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮抗肺纖維化作用。TGF-β的過量表達(dá)，是導(dǎo)致纖維化的主要誘因。在口腔黏膜瘢痕組織的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在低劑量時(shí)能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，在高劑量時(shí)主要起抑制作用。然而，關(guān)于在乳腺纖維化的進(jìn)程中IFN-γ的作用則鮮見報(bào)道。

細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellur matrix，ECM）的沉積、分解以及細(xì)胞凋亡等是組織器官發(fā)生纖維化的主要決定因素。ECM的合成與分泌主要由活化的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞（Myofibroblast，MFB）完成，而α-SMA是MFB的標(biāo)志性抗原[4-6]；CTGF是TGF-β1的重要下游因子，膠原蓄積是ECM沉積的重要表現(xiàn)。因此，α-SMA、CTGF及COLI α1 mRNA的表達(dá)能夠在一定程度上反映細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化及IFN-γ對(duì)轉(zhuǎn)分化細(xì)胞表型重塑過程中起到的作用。筆者以TGF-β1為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞-肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），以不同濃度的IFN-γ為阻斷劑，探討干擾素-γ（IFN-γ）對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）表型重塑的作用，以期為奶牛乳腺組織重塑的機(jī)理研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組人TGF-β1和IFN-γ，均購自Peprotech公司；SYBR Primescipt real-time RT-PCR Kit、RNA iso plus、DNA Marker，購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。奶牛乳腺上皮細(xì)胞由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)病理學(xué)教研室提供，試驗(yàn)所用細(xì)胞為原代培養(yǎng)6～8代凍存細(xì)胞。復(fù)蘇后待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底壁80%時(shí)，用0.25%胰酶于37 ℃條件下消化4～8 min，以含10%FBS的培養(yǎng)液中止消化，重懸細(xì)胞液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿底壁達(dá)90%融合時(shí)，加入含有0.1%FBS培養(yǎng)液處理24 h后，加入藥物。

1.2.2 試驗(yàn)分組。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（無血清培養(yǎng)基）、誘導(dǎo)組（TGF-β1 10 ng/mL）、藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）及阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別加藥物處理72 h。

1.2.3RT-PCR方法檢測(cè)α-SMA、CTGF和COLIα1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中α-SMA 、CTGF、COLIα1和β-actin的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑中的EASY Dilution對(duì)cDNA（500 ng/μL）進(jìn)行10倍稀釋，做8個(gè)稀釋倍數(shù)，然后將分別以各稀釋倍數(shù)的cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：SYBR Primer EX TaqTMⅡ （2×）12.5 μL，PCR 正向引物（10 μmol/L）1 μL，PCR反向引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2，ddH2O 8.5 μL；RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；繪制熔解曲線。選取線性較好的4～6個(gè)點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；以β-actin為內(nèi)參，以等量相應(yīng)的cDNA為模板，分別平行擴(kuò)增α-SMA、CTGF和COLⅠ α1 。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。采用2-△△Ct法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每個(gè)樣品取2次測(cè)定的平均值，然后使用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，各組間差異采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組（TGF-β1 10 ng/mL）CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；與對(duì)照組相比，藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量受到抑制，但差異并不顯著（P>0.05）；與誘導(dǎo)組相比，阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）CTGF mRNA的表達(dá)受到明顯抑制，并呈劑量依賴。

2.2 α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組（TGF-β1 10 ng/mL）α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；與對(duì)照組相比，藥物組（IFN-γ 20 ng/mL）α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量受到明顯抑制（P<0.05）；與誘導(dǎo)組相比，阻斷組α-SMA mRNA的表達(dá)量受到明顯抑制，并呈劑量依賴。

2.3 COLI α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

從圖3可以看出，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組（TGF-β1 10 ng/mL）COLI α1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；對(duì)照組與處理組（IFN-γ 20 ng/mL）BMEC COLI α1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較低，且差異不顯著（P<0.05）；與誘導(dǎo)組相比，阻斷組COLI α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量受到明顯抑制，并呈劑量依賴。

3 討論與結(jié)論

BMEC參與奶牛乳腺泌乳調(diào)控且在乳房炎發(fā)病過程中是病原損傷的主要細(xì)胞。乳腺纖維化是奶牛乳腺炎重要的病理表現(xiàn)，患病奶牛最終因泌乳功能下降或喪失被淘汰。目前，人類醫(yī)學(xué)研究表明在多種組織器官纖維化進(jìn)程中IFN-γ在不同程度上均能起到抑制纖維化的作用。在肝纖維化過程中，IFN-γ能夠降低肝臟星狀細(xì)胞（HSC）的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[7-8]；在肺臟纖維化研究中同樣發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能夠改善肺纖維化的程度，緩解肺臟纖維化進(jìn)程[9]。纖維化的發(fā)生與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積密切相關(guān)，ECM的沉積的主要因素是間質(zhì)細(xì)胞的超量表達(dá)和增生，而造成其超量表達(dá)的因素目前認(rèn)為是由間質(zhì)細(xì)胞原發(fā)性增殖和實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化（EMT）引起。

該試驗(yàn)用TGF-β1誘導(dǎo)BMEC發(fā)生轉(zhuǎn)分化，探討在IFN-γ 作為藥物逆轉(zhuǎn)EMT的可能性。結(jié)果表明，誘導(dǎo)組（TGF-β1 10 ng/mL）BMEC α-SMA、COLⅠ α1及CTGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，說明誘導(dǎo)試驗(yàn)是成功的；藥物

組（IFN-γ 20 ng/mL）

BMEC分泌α-SMA和COLⅠα1及TGF-β1下游因子CTGF具有較為明顯的抑制；阻斷組（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）誘導(dǎo)后BMEC α-SMA、COLⅠα1及CTGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量均受到不同程度抑制，且隨藥物（IFN-γ）添加劑量的增大明顯下降，具有劑量依賴性。這表明IFN-γ能夠抑制肌纖維母細(xì)胞（MFB）標(biāo)志因子α-SMA mRNA的表達(dá)，具有對(duì)BMEC表型重塑的促進(jìn)作用；同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞蓄積標(biāo)志COLⅠα1[10] mRNA表達(dá)量的下降，表明IFN-γ能夠阻止間質(zhì)細(xì)胞蓄積及膠原的成熟，其作用途徑可能是通過降低TGF-β1的活性，或是抑制TGF-β1下游因子CTGF的合成，或是通過抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減少肌纖維母細(xì)胞的數(shù)量間接抑制膠原的合成，或是直接抑制膠原的生成，其機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，IFN-γ能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，還可抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生，其機(jī)制可能與IFN-γ參與下調(diào)TGF-β1下游因子CTGF的表達(dá)有關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果可為奶牛乳腺纖維化進(jìn)程的改善及乳腺纖維化的治療提供新的思路和借鑒。

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