大鼠骨缺損愈合里骨痂的形成過程中H19的表達情況

蘇 杭姚軍威

(武漢體育學院研究生院,湖北武漢430079)

大鼠骨缺損愈合里骨痂的形成過程中H19的表達情況

蘇 杭姚軍威

(武漢體育學院研究生院,湖北武漢430079)

研究目的:通過檢測H19在骨損傷之后愈合過程中的表達變化探討骨損失愈合的相關(guān)細胞和H19的關(guān)系。研究方法:大鼠左后肢股骨做骨缺損造模,右后肢股骨做假手術(shù)處理。于5d、10d、15d、20d、25d斷頸法處死。實時熒光定量PCR測定H19表達。研究結(jié)果:在5d到25d中,H19在損傷組和對照組均有表達;損傷后5d,實驗組H19的表達量是對照組的兩倍;損傷后10d,實驗組H19的表達量是對照組的兩倍;損傷后15d、20d、25d,實驗組H19的表達量和對照組H19的表達量基本持平。研究結(jié)論:H19促進骨細胞的增殖與分化,可加速骨損傷的愈合。

骨損傷愈合;印記基因;H19

胚胎發(fā)育8周左右，圍繞脊髓的部分開始通過胚胎結(jié)締組織的間葉分化，形成膜化骨。大多數(shù)膜化骨之后被軟骨化骨所替換，軟骨成骨進一步發(fā)展為骨，一小部分骨是直接從膜化骨衍生而來的。結(jié)締組織膜衍生骨，稱為骨化始于胚胎，直到骨骼發(fā)育完成。原骨是由膜骨化而來的，次骨是由軟骨骨化而來的。

重新構(gòu)建骨的連續(xù)性即稱作骨愈合，屬于平衡機制的細胞修復(fù)過程，伴隨多個因子參與，多個因素影響，其生物學過程復(fù)雜而多變。細胞的增殖、分化、募集、遷移，都參與骨的重塑。各種細胞生長因子的旁分泌和自分泌，骨損傷愈合過程中骨修復(fù)細胞的分化和增殖，對骨形成的調(diào)節(jié)有著十分重要的作用。

印記基因是指同源基因只表達親本來源其中的一個，而從另一方不表達。精卵結(jié)合，基因遺傳給后代時，父系和母系等位基因發(fā)生改變，進而表達特點發(fā)生改變，于是印記發(fā)生。同鏈順式作用位點稱為印記中心，該中心成簇存在80%的印記基因。異常的印記基因表達會導(dǎo)致多種缺陷類疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，在胎兒的生長發(fā)育中，印記基因是作為重要的調(diào)節(jié)器發(fā)生作用的。

損傷后的骨再生，是局部骨的再發(fā)育的過程，目前骨修復(fù)和印記基因之間的關(guān)系報道基本屬于空白。創(chuàng)傷中常常存在一些常見的疾病，如骨質(zhì)疏松、骨折、骨缺損、骨折延遲愈合、骨折不愈合和愈合緩慢，所以促進新骨生長在治療中是極為重要的。在這項研究中，檢測印記基因H19在骨損傷修復(fù)部位的表達，探索印記基因與骨損傷修復(fù)的關(guān)系，為臨床上治療骨傷，促進骨骼生長發(fā)育等提供一些必要的理論基礎(chǔ)。

1 實驗方法

1.1 實驗動物分組

實驗組：左后肢做骨缺損造模，麻醉處理，左后肢剪毛，沿股骨長軸方向做3cm開口，撥開肌肉，于股骨中段骨皮質(zhì)上做切口，切至髓腔即刻停止，青霉素消毒縫合。

對照組：右后肢做假手術(shù)處理。

1.2 實驗動物取材

分別于傷后5d、10d、15d、20d、25d采用斷頸法處死，取適量左右后側(cè)股骨組織。分組標記并處理：-80℃下保存，多聚甲醛固定。

1.3 RT-PCR法

1.3.1 總RNA提取

（1）標本于-80℃或液氮中保存，用已經(jīng)消毒的工具于冰上取約100mg組織，Trizol研磨，倒入1.5ml EP管中，加入三氯甲烷250μl，混勻，冰上靜置。

（2）混合液，4℃ 10000g，10min離心。超凈工作臺操作，取上清500μl，加入等體積3℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置15min。

（3）溶液4℃，10000g，10min離心，小心倒掉液體，加入1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，清洗RNA沉淀。4℃，10000g，5min離心，倒掉液體，干燥數(shù)分鐘，乙醇充分揮發(fā)，加入20μl RNase-Free Water，溶解RNA。

1.3.2 第一鏈cDNA合成

第一鏈cDNA的合成采用First Strand cDNA Synthesis Kit進行

（1）取11μlRNA溶液，加入1μl oligo（dT）18，于PCR儀上65℃保溫5min，迅速置冰上冷卻2min。

（2）依次加入4μL 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μlRNA inhibitor和1μl反轉(zhuǎn)錄酶，用PCR儀處理。

1.3.3 熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR上完成，每個樣品均作3個復(fù)孔，使用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒進行：

反應(yīng)程序為：

預(yù)變性 95℃，1min

循環(huán)（40次） 95℃，15s→58℃，20s→72℃，20s

末段延伸 72℃，5min

溶解曲線 72℃→95℃，每20s升溫1℃

反應(yīng)體系為：

2× qPCR Mix 5.0μL

引物工作液（2.5μM） 1.0μL

Template 1.0μL

ddH2O 2.8μL

Rox 0.2μL

Total 10μL

2 實驗結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR

從曲線圖看出：GAPDH、U6、H19溶解曲線沒有雜峰，峰形窄、尖，表明擴增產(chǎn)物特異性良好；H19擴增曲線光滑呈S型，指數(shù)擴增期、平臺期明顯，表明擴增結(jié)果理想。

2.2 不同時期實驗組和對照組H19 CT值情況

如圖1，在骨損傷愈合過程中，5d和10d損傷組H19比對照組明顯升高，非常具有顯著性差異（P＜0.01）。15d、20d、25d實驗組和對照組的H19表達基本無變化，沒有顯著性差異（P＞0.05）。隨著愈合進程的推移，表達量逐漸下降。

3 分析討論

3.1 骨損傷愈合過程

圖1

骨損傷后的修復(fù)是一個特殊的過程，不同于結(jié)締組織的纖維狀瘢痕，細胞和分子事件有序發(fā)生產(chǎn)生新骨。產(chǎn)生新骨的一系列有序過程受到系統(tǒng)和局部因子的調(diào)控，早期組織學理論認為，人體骨折愈合的一般模式是以軟骨內(nèi)成骨為基礎(chǔ)，按時間順序分為血腫、炎癥、血管再生、軟骨發(fā)生到骨發(fā)生最后是骨的重構(gòu)。很少見到基于沒有骨膜反應(yīng)和可見骨痂形成的膜化骨的直接愈合。膜化骨和軟骨化骨的特點是由不同的細胞遷移分化，細胞外基質(zhì)對鈣的形成和組織，以及局部和系統(tǒng)調(diào)控的不同所決定的。除了骨折愈合的經(jīng)典組織學進程，對于這些進程的調(diào)控機制在細胞和分子水平還存在許多未解的問題。

胚胎發(fā)育過程中的骨形成是由骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）的聚集和凝聚，隨后通過軟骨發(fā)育進而軟骨內(nèi)骨化，或通過成骨細胞分化進而膜內(nèi)骨化。雖然在成人骨里骨髓間充質(zhì)干細胞極其稀少，骨膜里的骨祖細胞和骨髓里未分化的多能間充質(zhì)干細胞，參與愈合組織的形成，這對骨折的愈合構(gòu)建非常重要。

骨損傷后，骨損傷區(qū)域有血腫發(fā)生，炎性細胞浸潤。骨損傷后5d，血腫基本完全清除，原始骨痂由骨膜反應(yīng)形成，骨損傷處充質(zhì)細胞集結(jié)，骨膜下骨祖細胞增殖。骨折后10d骨損傷處肉芽組織生長，骨膜反應(yīng)持續(xù)增長，骨膜下骨祖細胞向成骨細胞分化，軟骨細胞形成。骨折后15d，新生骨小梁在骨膜下形成。骨折后20d，膜內(nèi)成骨區(qū)骨小梁開始相互連接，成骨細胞向骨細胞轉(zhuǎn)化，成骨細胞零星分布于軟骨骨痂中和纖維骨痂中。骨折后25d，膜內(nèi)成骨區(qū)骨小梁融合成片，新的骨小梁漸漸取代軟骨骨痂。

3.2 H19與細胞分化

在最近的發(fā)現(xiàn)中，印記基因在細胞分化方面具有至關(guān)重要的作用，包括在胚胎干細胞（ESCs），誘導(dǎo)性多功能干細胞（iPSCs）和成人干細胞。在雄性和雌性生殖細胞中，親代等位基因可以被獨立標記時基因組印記建立?；蚪M印記的建立發(fā)生在印記擦除之后，是表觀遺傳重組以及整體基因組去甲基化的一部分，對于細胞分化能力必不可少。然而，現(xiàn)在的研究表明當iPSCs來自于分化的體細胞時，在基因重組中可以避免一些生殖細胞特異性重組。在發(fā)育中一個重要的疑問是IPSC技術(shù)里，重組過程中印記能否被維持。例如，核移植（NT）-克隆的老鼠一般表現(xiàn)出表觀遺傳不穩(wěn)定性和LOH，患有各種與印記基因相關(guān)的疾病。

這些細胞將來可以被用來研究基礎(chǔ)發(fā)育過程或用于人類治療。LOH不僅可以導(dǎo)致早期生長發(fā)育障礙，而且與細胞分化和癌癥也高度相關(guān)。例如H19 Peg1 Peg3，是已知的腫瘤抑制基因。此外，“imprint-free”小鼠ESCs 具有完全的LOH，對于嵌合體發(fā)育產(chǎn)生明顯的效果。因此，對于IPSCS中印記基因的表達和功能需要仔細研究，這些研究結(jié)果對于胚胎干細胞和成體干細胞的印記分析，突出了具有分化能力的多能干細胞群中印記基因功能的重要性。

印記基因與成體干細胞群的維持和功能密切相關(guān)。父系peg3表達轉(zhuǎn)基因小鼠顯示成體鼠的PEG3在各種組織中的干細胞群中表達受限，包括大腦、腸、骨骼、肌肉和皮膚。神經(jīng)球的生成，是通過體外神經(jīng)元分離和擴增技術(shù)形成的，在此過程中導(dǎo)致了約100%的PEG3陽性細胞的生成。此外，在表皮移植實驗表明轉(zhuǎn)移PEG3陽性細胞在毛囊干細胞壁龕中具有自我更新和分化能力。這些實驗表明，PEG3在成體干細胞中起著功能性作用，但目前尚不清楚這些作用是否與早期發(fā)育中所體現(xiàn)出的作用不同。

小鼠中，母系表達的H19基因與成人造血干細胞（HSC）群的維持有關(guān)。誘導(dǎo)母系HSCs H19/IGF2 ICR刪除，可使H19表達減少和IGF2表達增加，同時造血干細胞數(shù)目短期內(nèi)增加，長期減少，逐漸喪失造血潛能和功能。此外，母系H19/Igf2 ICR 的刪除通過增加IGF2表達量，降低IGF1r表達量導(dǎo)致IGF2-IGF1R通路的不適當?shù)募せ?，IGF1r是miR-675的靶位點。這導(dǎo)致由FOXO3介導(dǎo)的細胞周期阻滯相關(guān)的靜止受到抑制，最終導(dǎo)致活化以及長期HSCs耗盡。此外，研究證實小鼠神經(jīng)干細胞（NSCs）及其壁龕選擇性丟失DLK1印跡對于后天神經(jīng)形成至關(guān)重要。DLK1是Notch信號的膜結(jié)合受體，出生后大多數(shù)組Notch信號下調(diào)。小鼠DLK1缺陷導(dǎo)致慢區(qū)分神經(jīng)干細胞減少，從而導(dǎo)致成人嗅球神經(jīng)元耗竭。神經(jīng)干細胞和周圍的星形膠質(zhì)細胞從兩個等位基因表達DLK1，而DLK1只從父系等位基因表達。DLK1這種協(xié)調(diào)雙等位基因表達凸顯了印記基因調(diào)控環(huán)境特異性的重要性，以及基因劑量對印記基因的重要性。

本研究中，大鼠骨損傷造模后5d到10d，骨膜反應(yīng)形成原始骨痂，骨膜下骨祖細胞增殖向成骨細胞分化，骨損傷處有大量間充質(zhì)細胞聚集。在此期間，實驗組H19表達量明顯增加且是對照組的兩倍，15d到25d基本無變化。在間充質(zhì)細胞和骨祖細胞等干細胞分化過程中，H19高表達，說明H19參與調(diào)控間充質(zhì)細胞、骨祖細胞分化，其具體機制還不清楚。

4 結(jié)論

H19可以促進大鼠骨細胞的增殖與分化，加快損傷部位愈合。

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蘇杭（1993—），女，湖南省邵陽人，碩士研究生，運動人體科學。

姚軍威（1990—），男，江蘇徐州人，碩士研究生，運動人體科學。