泛素樣蛋白蛋白酶體系統(tǒng)對單耐異煙肼結(jié)核桿菌耐藥性的影響研究

張帥，吳芳，吳江東，章樂，朱薈云，張大龍，武青青，張萬江*

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 石河子 832002）

泛素樣蛋白蛋白酶體系統(tǒng)對單耐異煙肼結(jié)核桿菌耐藥性的影響研究

張帥1，吳芳1，吳江東1，章樂1，朱薈云1，張大龍2，武青青2，張萬江1*

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 石河子 832002）

為探討泛素樣蛋白蛋白酶體系統(tǒng)對單耐異煙肼結(jié)核桿菌耐藥性的影響及其機(jī)制。采用刃天青顯色法，比較單耐異煙肼結(jié)核桿菌（對照組）與4種基因（Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因）過表達(dá)的單耐異煙肼結(jié)核桿菌菌株和4種相同基因缺失突變的單耐異煙肼結(jié)核桿菌菌株異煙肼最低抑菌濃度（MIC）值的差異；比較在應(yīng)用外排泵抑制劑后，單耐異煙肼結(jié)核桿菌（對照組）與4種基因（Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因）過表達(dá)的單耐異煙肼結(jié)核桿菌菌株和4種相同基因缺失突變的單耐異煙肼結(jié)核桿菌菌株異煙肼MIC差值間的差異。結(jié)果顯示：（1）與單耐異煙肼結(jié)核桿菌相比，過表達(dá)PafA基因的該菌株異煙肼的MIC值增加了1.03 μg/mL，過表達(dá)Dop、Mpa基因的該菌株異煙肼的MIC值分別降低了1.03 μg/mL、0.68 μg/mL,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與單耐異煙肼結(jié)核桿菌相比,過表達(dá)Pup基因的該菌株異煙肼的MIC值增加了8 μg/mL，缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因的該菌株異煙肼的MIC值分別降低了4.82、4.98、4.99、4.9 μg/mL,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)與在應(yīng)用外排泵抑制劑后單耐異煙肼結(jié)核桿菌相比,過表達(dá)Pup基因的該菌株異煙肼的MIC差值增加了8 μg/mL，缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因的該菌株異煙肼的MIC差值分別降低4.65、4.81、4.83、4.75 μg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與在應(yīng)用外排泵抑制劑后單耐異煙肼結(jié)核桿菌相比,過表達(dá)Dop、PafA、Mpa基因的該菌株異煙肼的MIC差值分別降低了1、0.99、0.65 μg/mL，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可知，結(jié)核桿菌泛素樣蛋白蛋白酶體系統(tǒng)對單耐異煙肼結(jié)核桿菌耐藥性的產(chǎn)生有調(diào)控作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控單耐異煙肼結(jié)核桿菌外排泵的功能來調(diào)控其耐藥性的產(chǎn)生。

結(jié)核桿菌；泛素樣蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)；耐藥性；異煙肼；機(jī)制

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核桿菌感染引起的一種世界性傳染病，也是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。在我國結(jié)核桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)，患HIV人數(shù)的增加以及結(jié)核病的潛伏感染使結(jié)核病疫情進(jìn)一步嚴(yán)峻，更加急需尋求新的途徑來幫助我們解決結(jié)核桿菌耐藥問題[1]。

結(jié)核桿菌泛素樣蛋白蛋白酶體系統(tǒng)（Mycobacterium tuberculosis ubiquitin-like protein-proteasome system，MTB PPS)由結(jié)核桿菌泛素樣蛋白與結(jié)核桿菌蛋白酶體組成。該系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程中所需的輔助因子有：Dop、PafA、Mpa。MTB PPS 是胞內(nèi)蛋白降解的重要機(jī)制，在去酰胺酶Dop，連接酶PafA，ATP酶Mpa等輔助因子的作用下，Pup可以共價(jià)標(biāo)記多種功能蛋白，并介導(dǎo)被標(biāo)記蛋白通過蛋白酶體降解[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，MTB PPS主要介導(dǎo)和調(diào)控結(jié)核桿菌菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的選擇性降解，對結(jié)核桿菌在宿主體內(nèi)的生長、分化、代謝、繁殖、滲透調(diào)節(jié)、持留性、毒性、趨化性、變異性、致病性及其引起的宿主免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]。被Pup修飾的蛋白質(zhì)包括了8種功能的蛋白質(zhì)如中間代謝、脂類代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、毒力等，這暗示Pup的修飾可能是一種全局性的修飾，而且通過修飾介導(dǎo)了原核生物的各種生命活動(dòng)過程[4]。

本課題組前期研究結(jié)果表明：暴露于低濃度抗生素壓力下的單耐異煙肼結(jié)核桿菌（INH-MTB）菌株與非暴露條件下相比，兩種狀態(tài)下INH-MTB菌株中PPS各基因的表達(dá)有差異。在Diana等[5]研究中，將INH-MTB菌株暴露于低濃度抗生素壓力下，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)外排泵基因的表達(dá)水平增高。同時(shí)外排泵活動(dòng)的增強(qiáng)是導(dǎo)致結(jié)核桿菌耐藥的機(jī)制之一。關(guān)于MTB PPS是否與INH-MTB菌株耐藥性產(chǎn)生之間具有相關(guān)性，以及MTB PPS是否通過調(diào)控INH-MTB菌株外排泵的功能來調(diào)控其耐藥性的產(chǎn)生，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 菌株

INH-MTB菌株由新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采集樣本并鑒定保存，Pup、Dop、PafA和Mpa基因分別缺失突變和過表達(dá)的各INH-MTB菌株由本課題組構(gòu)建并鑒定保存。

1.2 試劑

異煙肼（上海Aladdin有限公司），維拉帕米（上海信誼藥廠有限公司），氯丙嗪（上海研生實(shí)業(yè)有限公司），利血平（上海信誼藥廠有限公司），羰基氰氯苯腙（天津希恩斯生化科技有限公司），刃天青（上海Aladdin有限公司），二甲基壓楓（山西太谷化工廠），10%的醋酸（天津市坤華化工有限公司），Tween 80（天津化學(xué)試劑廠），生理鹽水（上海生物工程有限公司），胰蛋白胨OXOID（英國Tryptone公司），酵母提取物OXOID（英國Tryptone公司），OADC細(xì)菌增菌液（美國BD公司）。

1.3 結(jié)核桿菌的培養(yǎng)及菌懸液的制備

培養(yǎng) INH-MTB 菌株，Pup、Dop、PafA 和 Mpa基因分別缺失突變和過表達(dá)的各INH-MTB菌株至對數(shù)生長期，并將其研磨至呈乳酪樣，用生理鹽水稀釋至每種菌懸液濃度為1.0×106/mL。

1.4 配制含不同濃度異煙肼的7H9液體培養(yǎng)基

根據(jù)各個(gè)菌株預(yù)實(shí)驗(yàn)中MIC值的不同，將異煙肼通過倍比稀釋成不同的濃度梯度。在1-11孔中異煙肼濃度由高至低，第12孔作為對照孔。

1.5 INH-MTB 菌株，Pup、Dop、PafA、Mpa基因分別缺失突變和過表達(dá)的各INH-MTB菌株異煙肼MIC值的測定

不同濃度異煙肼的配制，方法如1.4。向含不同濃度異煙肼的酶標(biāo)板各孔中加入稀釋好的菌懸液100 μL，用無菌保鮮膜封板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)5天，第6天加入0.1 g/L刃天青顯色液30 μL，至第12孔，繼續(xù)溫育24 h，若第12孔變?yōu)榉奂t色，則加相同劑量的刃天青顯色液至其它各孔，24 h后觀察并記錄各孔的顏色變化情況。顏色由藍(lán)色變?yōu)榉凵珓t預(yù)示著細(xì)菌生長，以保持藍(lán)色的最低藥物濃度為該菌株異煙肼的MIC值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行7次。

1.6 測定藥物外排泵抑制劑對INH-MTB菌株，Pup、Dop、PafA和 Mpa基因分別缺失突變和過表達(dá)的各INH-MTB菌株異煙肼MIC值的影響

1.6.1 4種泵抑制劑的配制

維拉帕米、氯丙嗪分別用高壓滅菌水配置成濃度為 1140、72 μg/mL的儲(chǔ)存液。利血平用10%醋酸進(jìn)行溶解，滅菌水稀釋成384 μg/mL的儲(chǔ)存液。羰基氰氯苯腙(CCCP）用二甲基亞砜溶解后加滅菌水稀釋成240 μg/mL的儲(chǔ)存液。

1.6.2 測定藥物外排泵抑制劑對各菌株異煙肼MIC值的影響

每次實(shí)驗(yàn)前在7H9培養(yǎng)液中加入藥泵抑制劑儲(chǔ)存液，使藥泵抑制劑維拉帕米、氯丙嗪、利血平、CCCP 的終濃度分別為 142.5、18、96、15 μg/mL（4種外排泵抑制劑的最適濃度為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過濃度梯度實(shí)驗(yàn)篩選確定）。向 1.4中的含有不同濃度異煙肼的無菌微孔酶標(biāo)板內(nèi)加入100 μL配置好的外排泵抑制劑濃度如上所述。其余步驟同1.5。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行7次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行One-Way ANOVA單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pup基因過表達(dá)可提高異煙肼的MIC值

所測得INH-MTB菌株、rINH-MTB::Pup菌株（過表達(dá) Pup基因的 INH-MTB菌株）、rINH-MTB::Dop菌株（過表達(dá)Dop基因的INH-MTB菌株）、rINH-MTB::PafA菌株（過表達(dá)PafA基因的INH-MTB菌株）、rINH-MTB::Mpa菌株（過表達(dá)Mpa基因的INH-MTB菌株）異煙肼的MIC值如圖1結(jié)果所示。與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比，rINH-MTB::Pup菌株異煙肼的MIC值增加了8μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比，rINH-MTB::PafA菌株異煙肼的MIC值增加了1.03 μg/mL，rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::Mpa菌株異煙肼的MIC值分別降低了1.03μg/mL、0.68μg/mL，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 INH-MTB菌株及其過表達(dá)菌株異煙肼的MIC值Fig.1 MIC determination of INH-MTB strain and its overexpression strains to isoniazid

2.2 Pup基因、Dop基因、PafA基因和Mpa基因的缺失均可降低異煙肼的MIC值

所測得INH-MTB 菌株、INH-MTB△Pup菌株（缺失Pup基因的INH-MTB菌株）、INH-MTB△Dop菌株（缺失Dop基因的INH-MTB菌株）、INH-MTB△PafA菌株（缺失PafA基因的INH-MTB菌株）、INH-MTB△Mpa菌株（缺失Mpa基因的INH-MTB菌株）異煙肼的MIC值如圖2所示。與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比，INH-MTB△Pup菌株、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株異煙肼的 MIC 值分別降低了 4.82、4.98、4.99、4.9 μg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 INH-MTB菌株及其缺失突變菌株異煙肼的MIC值Fig.2 MIC determination of INH-MTB strain and its deletion mutant strains to isoniazid

2.3維拉帕米對各菌株異煙肼MIC值影響最大

作用濃度為47.5μg/mL的維拉帕米、6μg/mL的氯丙嗪、32μg/mL的利血平、5μg/mL的CCCP對各菌株異煙肼的MIC值的影響：使INH-MTB菌株異煙肼的 MIC值分別以下降 32、0、0、0倍為主；使rINH-MTB::Pup菌株異煙肼的MIC值分別以下降64、0、2、2 倍為主；使 rINH-MTB::Dop 菌株異煙肼的MIC值分別以下降 32、0、0、0倍為主；使 rINH-MTB::PafA菌株異煙肼的 MIC值分別以下降 32、0、0、0倍為主；使rINH-MTB::Mpa菌株異煙肼的MIC值分別以下降 32、0、0、0為主；使 INH-MTB△Pup菌株異煙肼的 MIC值分別以下降 16、0、2、2倍為主；使INH-MTB△Dop菌株異煙肼的MIC值分別以下降8、0、2、2倍為主；使 INH-MTB△PafA 菌株異煙肼的MIC值分別以下降 4、0、2、2倍為主；使 INH-MTB△Mpa菌株異煙肼的 MIC值分別以下降 8、0、2、2倍為主。

2.4 Pup基因過表達(dá)菌株是通過調(diào)控其外排泵功能影響耐藥性

INH-MTB菌株、rINH-MTB::Pup菌株、rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::PafA菌株、rINH-MTB::Mpa菌株在加用外排泵抑制劑（相同濃度和劑量的維拉帕米）前后異煙肼的MIC差值（圖3）。

圖3 INH-MTB菌株及其過表達(dá)菌株異煙肼的MIC差值Fig.3 The difference value of MIC in INH-MTB strain and its overexpression strains to isoniazid

結(jié)果顯示：與應(yīng)用外排泵抑制劑前相比，應(yīng)用外排泵抑制劑后的INH-MTB菌株、rINH-MTB::Pup菌株、rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::PafA菌株、rINH-MTB::Mpa菌株異煙肼的MIC分別降低了4.95、12.95、3.95、5.94、4.3 μg/mL。與在應(yīng)用外排泵抑制劑前后INH-MTB菌株異煙肼的MIC差值相比，rINH-MTB::Pup菌株異煙肼的MIC差值增加了8ug/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與在應(yīng)用外排泵抑制劑前后INH-MTB菌株異煙肼的MIC差值相比，rINH-MTB::Dop菌株、rINH-MTB::PafA菌株、rINH-MTB::Mpa菌株異煙肼的MIC差值分別降低了1、0.99、0.65 μg/mL，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5△Pup菌株、△Dop菌株、△PafA菌株、△Mpa菌株是通過調(diào)控其外排泵功能影響耐藥性

INH-MTB菌株、INH-MTB△Pup菌株、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株在加用外排泵抑制劑（相同濃度和劑量的維拉帕米）前后異煙肼的MIC差值（圖4）。結(jié)果顯示：與應(yīng)用外排泵抑制劑前相比，應(yīng)用外排泵抑制劑后的INH-MTB 菌 株 、INH-MTB△Pup菌 株 、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株異煙肼的 MIC分別降低了 4.95、0.3、0.14、0.12、0.2μg/mL。與在應(yīng)用外排泵抑制劑前后INH-MTB菌株異煙肼的 MIC差值相比，INH-MTB△Pup菌株、INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株、INH-MTB△Mpa菌株異煙肼的MIC差值分別降低 4.65、4.81、4.83、4.75 μg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 INH-MTB菌株及其缺失突變菌株異煙肼的MIC差值Fig.4 The difference value of MIC in INH-MTB strain and its deletion mutant strains to isoniazid

3 討論

在真核生物中，存在一種泛素修飾介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解機(jī)制，可以通過共價(jià)鍵將含有76個(gè)氨基酸殘基的泛素基團(tuán)結(jié)合到一些折疊不正確或功能缺失的蛋白質(zhì)上，從而作為一種降解信號讓蛋白酶體識(shí)別并降解[6]。Pearce等[7]人在原核生物結(jié)核桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的、被稱作Pup的小蛋白，它可以附著到其它蛋白質(zhì)上決定該蛋白的命運(yùn)，控制或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其他重要的生理過程。

Pearce等[7]發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，F(xiàn)abD(丙二酰CoA-酰基載體蛋白)和蛋白酶體一起溫育，發(fā)現(xiàn)FabD未被降解，推測其降解還需要另外一種輔助因子。通過在大腸桿菌中進(jìn)行細(xì)菌雙雜交，發(fā)現(xiàn)Mpa能和 rv2111c編碼的蛋白Pup相互作用，而且這個(gè)蛋白質(zhì)和蛋白酶體的核心蛋白在同一個(gè)順反子中被同時(shí)表達(dá)，因此推測Pup參與了蛋白質(zhì)的降解。另外對PafA的突變也導(dǎo)致FabD不能被降解，而它具有一種連接賴氨酸和谷氨酸的連接酶活性，因此推測Pup是通過PafA蛋白連接在目的蛋白上的。同時(shí)Striebel等[8]通過質(zhì)譜結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Pup羧基端Gly-Gly-Gln的谷氨酰胺必須經(jīng)過脫酰胺作用變成谷氨酸，然后才能和目的蛋白上的賴氨酸發(fā)生結(jié)合，其中脫酰胺酶是Dop，它的缺失導(dǎo)致目的蛋白的大量堆積以及Pup修飾的蛋白質(zhì)檢測不到，因此它的脫酰胺作用是Pup修飾必需的[9]。由此可見，在MTB PPS中Pup需要在輔助因子的作用下標(biāo)記多種功能蛋白，并介導(dǎo)被標(biāo)記蛋白通過蛋白酶體降解。

本研究結(jié)果顯示：（1）rINH-MTB::Dop菌株異煙肼的MIC值與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，INH-MTB PPS中Dop基因的過表達(dá)對細(xì)菌耐藥性無影響?？赡芘cDop蛋白被部分降解以維持MTB PPS的功能穩(wěn)定有關(guān)。Elharar等[10]的研究:檢測處于指數(shù)生長期的過表達(dá)Dop基因的恥垢分支桿菌菌株的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株Dop的mRNA水平相比增高7倍。然而，過表達(dá)Dop基因的恥垢分枝桿菌其Dop蛋白水平與野生型相比無差異；過表達(dá)Dop基因的恥垢分支桿菌對底物的Pup化水平與野生型菌株相比幾乎無差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)低水平的Dop可有效促使Pup化的發(fā)生，而高水平的Dop會(huì)使Dop的去酰胺化作用和去Pup化作用之間發(fā)生失衡，更傾向于促使Pup化的底物發(fā)生去Pup化。因此，高水平的Dop會(huì)致使Pup化與去Pup化之間無效循環(huán)的發(fā)生。結(jié)果證明低水平的Dop蛋白對維持MTB PPS功能的穩(wěn)定很重要。

（2）與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比，INH-MTB△Dop菌株、INH-MTB△PafA菌株異煙肼的MIC值明顯降低。由于Dop或PafA的缺失阻斷了MTB內(nèi)底物蛋白的 Pup化過程，造成底物蛋白FabD、PanB等的堆積。其中FabD是結(jié)核桿菌分支菌酸合成過程中的重要酶蛋白，但這些折疊不正確或功能缺失蛋白的堆積可能阻礙了正常細(xì)胞壁的合成過程，從而提高抗菌藥物通過細(xì)胞壁的滲透力來影響 MTB的耐藥性。Imkamp和 Festa等[9，11]發(fā)現(xiàn)Dop基因的敲除、PafA的突變，可以造成底物蛋白的積累，檢測不到Pup標(biāo)記蛋白的存在，Dop和PafA對于Pup與靶蛋白連接是必需的。

（3）與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比，rINHMTB::Mpa菌株、rINH-MTB::PafA菌株異煙肼的MIC值無明顯變化。Mpa是Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的輔助因子，在它的輔助作用下可完成對靶蛋白的降解，Mpa可以發(fā)生Pup化，最終被蛋白酶體降解。Pup對靶蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，不僅使得底物通過蛋白酶體被降解，同時(shí)也調(diào)節(jié)了PPS自身酶的活性[12]。PafA可以通過自身發(fā)生ploy-pupylation，以及在Mpa或prcBA缺失的菌株中會(huì)出現(xiàn)PafA的累積[13]。由于過表達(dá)Mpa基因、過表達(dá)PafA基因?qū)NH-MTB菌株異煙肼的MIC值無影響，我們推測結(jié)核桿菌有可能通過Pup標(biāo)記Mpa和PafA蛋白，然后通過蛋白酶體降解以維持PPS的穩(wěn)定。

（4）與INH-MTB菌株異煙肼的MIC值相比，INHMTB△Mpa菌株、INH-MTB△Pup菌株異煙肼的MIC值明顯降低。在結(jié)核桿菌泛素樣蛋白蛋白酶體通路中Mpa即是底物的受體又可以調(diào)節(jié)蛋白酶體α亞基“門”的開關(guān)。Mpa有助于結(jié)核桿菌在宿主體內(nèi)的生存，Mpa可以使細(xì)菌對各種應(yīng)激行為的耐受性增強(qiáng)，并且在鼠感染模型中缺失Mpa菌株對鼠的毒力明顯降低[14]。Pup可能具有兩種功能，它不僅使底物成為蛋白酶體識(shí)別的標(biāo)記物，而且使靶蛋白帶上無序標(biāo)簽，有利于靶蛋白的降解。我們推測Mpa或Pup的缺失會(huì)導(dǎo)致底物蛋白的堆積，使細(xì)菌對各種應(yīng)激行為的耐受性減弱。

（5）Pup基因過表達(dá)可提高異煙肼的MIC值。可能是由于Pup蛋白的增多加速了MTB體內(nèi)有害蛋白的降解速度，使MTB的適應(yīng)性增強(qiáng)。我們檢測了Msm體內(nèi)Ino1的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示:對于過表達(dá)Pup的野生型Msm其體內(nèi)的Ino1不能被檢測到，這可能是由于體內(nèi)清除Ino1的速度加快了[15]。

MTB PPS中的Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因可以影響該菌株的耐藥表型。提示MTB PPS與INH-MTB菌株的耐藥性之間有關(guān)聯(lián)。其中MTB內(nèi)PPS基因的缺失使菌株耐藥性降低的現(xiàn)象或許對結(jié)核病的臨床治療具有一定的指導(dǎo)作用。通過抑制MTB PPS中基因的表達(dá)或抑制其翻譯后的蛋白功能有可能成為結(jié)核病治療的有效靶點(diǎn)。

細(xì)菌內(nèi)藥物濃度的平衡需要藥物流入和流出系統(tǒng)的共同作用。通過對微生物全基因組序列的分析，已經(jīng)證實(shí)和假定的藥物外排泵占所有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的6%-18%。其中MmpL7是一個(gè)RND家族的轉(zhuǎn)運(yùn)體。對其功能研究發(fā)現(xiàn)，MmpL7蛋白在恥垢分枝桿菌中表達(dá)時(shí)會(huì)使異煙肼的MIC值升高，但在泵抑制劑作用下其MIC值有所降低，這提示MmpL7對結(jié)核桿菌的耐藥作用是通過將藥物外排出菌體實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)中所選用的維拉帕米、利血平、氯丙嗪、CCCP，是4種不同類型的已被證實(shí)具有外排泵抑制功能的藥物。通過刃天青顯色法檢測到在應(yīng)用泵抑制劑維拉帕米、利血平、氯丙嗪、CCCP后，INH-MTB菌株，Pup、Dop、PafA和Mpa基因分別缺失突變和過表達(dá)的各INH-MTB菌株異煙肼的MIC值會(huì)有不同程度的降低，其中以維拉帕米對上述各菌株異煙肼MIC值影響程度最大，利血平、氯丙嗪、CCCP對實(shí)驗(yàn)中各菌株MIC值影響程度較小。刃天青顯色法檢測菌株異煙肼的MIC值，該法存在一定的缺陷，因?yàn)樗幬餄舛炔捎帽侗认♂尫ㄊ褂姓`差時(shí)最小為2倍，需要通過多次驗(yàn)證減少誤差。研究認(rèn)為MIC值至少降低4倍才有意義[16]。在這四種外排泵抑制劑中，維拉帕米的抑制作用最強(qiáng)，我們推測可能是由于維拉帕米與外排異煙肼的外排泵具有更高的親和力。綜上所述，我們篩選維拉帕米作為試驗(yàn)中的外排泵抑制劑來分析其對各菌株異煙肼MIC值的影響。

在加用相同劑量、相同濃度的外排泵抑制劑維拉帕米前后，我們將 Pup、Dop、PafA和Mpa基因分別缺失突變的各INH-MTB菌株異煙肼的MIC差值與INH-MTB菌株異煙肼的MIC差值進(jìn)行了比較。結(jié)果提示：上述各菌株異煙肼MIC值的下降與Pup、Dop、PafA、Mpa基因?qū)ν馀疟霉δ艿恼{(diào)控有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)提示，MTB PPS與結(jié)核桿菌耐藥性之間具有相關(guān)性，并且MTB PPS可能是通過調(diào)控外排泵的功能來影響MTB耐藥性。該系統(tǒng)是如何調(diào)控外排泵的功能來影響耐藥性，目前尚不清楚。MTB中PPS的發(fā)現(xiàn)開啟了以蛋白質(zhì)降解的調(diào)控為特征的抗結(jié)核藥物研發(fā)的大門，以PPS為靶標(biāo)的抗結(jié)核新藥的研發(fā)將會(huì)為耐藥結(jié)核病的治療提供新的有效途徑。

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Study on the effect of ubiquitin like protein-proteasome system reacts to the drug-resistance of isoniazid monoresistantMycobacterium tuberculosis

Zhang Shuai1,Wu Fang1,Wu Jiangdong1,Zhang Le1,Zhu Huiyun1,Zhang Dalong2,Wu Qingqing2,Zhang Wanjiang1*
(1 Laboratory for Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases/Center for Collaborative Innovation to Control Highly Infectious Zoonoses in the Western Region of Xinjiang/Department of Pathophysiology,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 Department of ICU,The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To explore the effect and mechanism of ubiquitin like protein-proteasome system reacts to the drug-resistance of isoniazid monoresistantMycobacterium tuberculosis.Using the method of resazurin chromogenic,the difference of minimum inhibitory concentration (MIC)of isoniazid were examined among the isoniazid monoresistantMycobacterium tuberculosis(INH-MTB,as a control group)strain,four over-expression genes(Pup,Dop,PafA and Mpa)INH-MTB strains and four same deleted genes (△Pup,△Dop,△PafA and△Mpa)INH-MTB strains.The difference value of MIC of isoniazid were analyzedamong INH-MTB strain,four over-expression genes (Pup,Dop,PafA and Mpa)INH-MTB strains and four same deleted genes (△Pup,△Dop,△PafA and△Mpa)INH-MTB strains.The results showed that the MIC value of isoniazid was 1.03 μg/mL higher in PafA over-expression INH-MTB strain than that in INH-MTB;the MIC value of isoniazid in Dop,Mpa over-expression strains were 1.03 μg/mL and 0.68 μg/mL lower than that in INH-MTB,respectively.The differences had no statistical significance(P>0.05).The MIC value of isoniazid was 8 μg/mL higher in Pup over-expression INH-MTB strain than that in INH-MTB;the MIC value of isoniazid were 4.82ug/ml,4.98 μg/mL,4.99ug/ml and 4.9 μg/mL lower in △Pup,△Dop,△PafA and△Mpa INH-MTB strains than that in INH-MTB,respectively.The differences had statistical significance(P<0.05).After using efflux pump inhibitors,the difference Value of MIC of isoniazid in Pup over-expression INH-MTB strain was 8 μg/mL higher than that in INH-MTB;the difference Value of MIC of isoniazid were 4.65 μg/mL,4.81 μg/mL,4.83 μg/mL,4.75 μg/mL lower in△Pup,△Dop,△PafA and△Mpa INH-MTB strains than that in INH-MTB,respectively.The differences had statistical significance (P<0.05).The difference value of MIC of isoniazid in Dop,PafA,Mpa over-expression INH-MTB strain were 1 μg/mL,0.99 μg/mL,0.65 μg/mL lower than that in INH-MTB,respectively.The differences had no statistical significance(P>0.05).It can be concluded thatMycobacterium tuberculosisubiquitin like protein-proteasome system regulate the development of drug-resistance of INH-MTB strain and may affect its resistance by regulating the function of efflux pumps.

Mycobacterium tuberculosis;ubiquitin like protein-proteasome system;drug-resistance;isoniazid;mechanism

R378.91

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.006

1007-7383(2017)02-0163-06

2016-12-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260261），石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX201446）

張帥（1989-),女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)楦腥拘约膊〉牟±砩韺W(xué)研究。

*通信作者：張萬江（1967-），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事感染性疾病的發(fā)病機(jī)制與防治研究，e-mail:zwj1117@126.com。