短短芽孢桿菌的鑒定及其抑菌物質(zhì)的初步研究

龔國利， 王忠忠

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安市微生物藥物工程實驗室， 陜西 西安 710021)

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短短芽孢桿菌的鑒定及其抑菌物質(zhì)的初步研究

龔國利1，2， 王忠忠1

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安市微生物藥物工程實驗室， 陜西 西安 710021)

從美國黃石國家公園土樣分離到一株耐高溫菌株S1039，經(jīng)過形態(tài)、生理生化以及16SrDNA測序分析鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis).并對其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)粗提物的部分性質(zhì)進(jìn)行了初步探究.實驗結(jié)果表明，菌株S1039產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)粗提物具有良好的抑菌活性，并且耐高溫、耐堿性物質(zhì)、對胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感.能夠抑制革蘭氏陰性菌及陽性菌的生長，具有工業(yè)開發(fā)前景.

鑒定； 短短芽孢桿菌S1039； 抑菌物質(zhì)

0 引言

益生芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中一類好氧或兼性厭氧，產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌，在自然界廣泛分布于植物根際土壤，空氣及水體中.該類菌形成的芽孢能夠產(chǎn)生對熱、電磁輻射、紫外線很強的抗性，因此環(huán)境適應(yīng)性優(yōu)良，其中絕大多數(shù)的益生芽孢桿菌分泌的次級代謝產(chǎn)物具有抑制植物病原真菌及病原細(xì)菌的作用.例如，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類抗生素: 伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)等對人體腸道中的致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌有較強的抑制作用[1].地衣芽孢桿菌(Bacilluslichnifarimis)產(chǎn)生的桿菌肽能夠有效控制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、甲烷桿菌(Methanebacillus)等G+和G-細(xì)菌[2,3].多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)產(chǎn)生的堿性多肽類抗生素多粘菌素E對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)等革蘭氏陰性桿菌有強烈的殺菌作用[4].短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)是一種能夠分泌短桿菌肽(gramieidin)、短桿菌酪肽(tyrocidine)、胞外多糖[5]、幾丁質(zhì)酶[6]以及羥苯乙酯[7]等多種抑菌物質(zhì)的微生物[8,9]，因此在生物防治上具有廣闊的應(yīng)用前景.

本研究從美國黃石國家公園淤泥中分離篩選出一株高效產(chǎn)抗菌物質(zhì)的芽孢桿菌S1039，經(jīng)過形態(tài)，生理生化特征及16SrDNA序列分析等方法鑒定為短短芽孢桿菌，并對其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)粗提物的部分理化性質(zhì)進(jìn)行了初步探究.

1 材料與方法

1.1 主要原料與儀器

1.1.1 主要原料

(1)菌株分離土樣

采集自美國黃石國家公園.

(2)培養(yǎng)基

NA：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%，pH7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉1.5%，蛋白胨2.0%，氯化鈣0.20%，Twen-20 1%，pH7.2.

(3)試劑

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、DNA marker、 PCR擴(kuò)增試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司.

1.1.2 主要儀器

PCR儀(PCR-9700)，西安天隆科技有限公司；核酸電泳儀(4001P)，北京六一儀器公司；電泳槽(BIO-RAD)、BIS910凝膠成像系統(tǒng)，北京東勝創(chuàng)新生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株分離

準(zhǔn)確稱取1 g待分離土樣，加入到10 mL的無菌試管中，再加入9 mL的雙蒸水充分混勻，做系列梯度稀釋(10-1～10-8)，取稀釋度為10-5、10-6、10-7、10-8的土壤懸液于80 ℃水浴保溫處理10 min，冷卻至室溫，涂布平板(NA)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落至指示菌培養(yǎng)基(金黃色葡萄球菌及大腸桿菌)驗證抑菌圈的產(chǎn)生，將產(chǎn)抑菌圈的單菌落轉(zhuǎn)接至新的NA中做純化培養(yǎng).

1.2.2 菌株的形態(tài)及生理生化特征測定

將菌株S1039接種于NA平板上，于37 ℃培養(yǎng)16 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征，培養(yǎng)48 h觀察菌落的顏色及外部特征.生理生化特征型鑒定參照文獻(xiàn)[10]及伯杰氏細(xì)菌鑒定學(xué)手冊[11].

1.2.3 菌體基因組DNA的提取、16SrDNA擴(kuò)增、測序及序列比對分析

(1)基因組DNA提取

將活化培養(yǎng)16 h的菌體接一環(huán)于NB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒(上海捷瑞)提取菌體基因組DNA，4 ℃保存?zhèn)溆?

(2)16SrDNA擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增50μL的反應(yīng)體系：25μL 2×PCRmaster mix，基因組DNA(37.5μg/mL) 0.5μL，細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增通用引物27F： (5′-AGTTT GATCMTGGCTCAG-3′)1μL(10μM)，1492R：(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)1μL(10μM)，剩余體積用dd H2O補足至50μL.

PCR反應(yīng)循環(huán)條件： ①96 ℃預(yù)變性4 min；②94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)(變性-退火-延伸)；③72 ℃修復(fù)延伸10 min，使16SrDNA擴(kuò)增完整.取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(1%)凝膠電泳觀察擴(kuò)增效果，并將PCR產(chǎn)物純化(PCR產(chǎn)物純化試劑盒)送至上海生工生物工程有限公司完成測序.

(3)16SrDNA序列比對分析

通過在線輸入測序結(jié)果至Genbank(http://www.ncbinl m.nih.gov/Blast/)進(jìn)行序列同源性比較，采用RDP (http:rdp.cme.msu.edu/)，MAGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株S1039的分類位置.

1.3 抗菌粗提物制備及其抑菌活性測定

1.3.1 抗菌粗提物的制備

將新分離的菌株S1039以4%(V/V)接種量接種于50 mL(300 mL搖瓶)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 rpm搖瓶培養(yǎng)36 h，4 ℃下12 000 rpm 離心20 min，得上清，向無菌上清液加入固體硫酸銨粉末至終濃度70%，4 ℃過夜，8 000 rpm 離心15 min，取5 mL的25 mmol/L(pH7.0)的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀得抗菌物質(zhì)的粗提物，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 抑菌活性測定

采用雙層平板瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行菌株S1039抗菌粗提物抑菌活性測定.平板底層加入15 mL素瓊脂水溶液，上層加入25mL NA(混有金黃色葡萄球菌CVCC1885或大腸桿菌BL21(108CFU/mL)，制成指示細(xì)菌培養(yǎng)基.無菌牛津杯(7 mm)打孔，加入200μL 的抗菌粗提物，測定其抑菌活性，抑菌活性的大小用抑菌圈直徑來表示，以25 mmol/L(pH7.0)的磷酸鹽緩沖液做對照，每組試驗重復(fù)三次.

1.4 抗菌粗提物部分性質(zhì)初步探究

1.4.1 蛋白酶對抗菌粗提物抑菌活性的影響

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、鏈酶蛋白酶，分別配成5 mg·mL-1的酶液，取200μL的抗菌粗提物與上述各蛋白酶液等量混合，4 ℃靜置2 h，分別取上述蛋白酶處理液200μL至指示菌培養(yǎng)基中， 37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，瓊脂擴(kuò)散法測定各蛋白酶處理液的抑菌活性，以未處理的抗菌粗提物及25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液做對照，每組試驗重復(fù)三次.

1.4.2 不同pH 對抗菌粗提物抑菌活性的影響

取8個50 mL的三角瓶，每個三角瓶中加入5 mL的抗菌粗提物，用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L的NaOH分別調(diào)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室溫條件下靜置4 h，再依次將各粗提液pH調(diào)至7.0，分別取不同pH值處理的抗菌粗提物200μL至指示菌培養(yǎng)基中， 37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測定不同酸堿度處理的粗提液抑菌活性，以未處理的抗菌粗提物及25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液做對照，每組試驗重復(fù)三次.

1.4.3 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性

取6支2 mL的離心管，每支離心管中加入1.5 mL的抗菌粗提物，分別置于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴中保溫處理10 min，待冷卻至室溫，分別取不同溫度處理的抗菌粗提物200μL至指示菌培養(yǎng)基中， 37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測定不同溫度處理的抗菌粗提物的抑菌活性變化，以未處理的抗菌粗提物及25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液做對照，每組試驗重復(fù)三次.

1.4.4 抑菌陰陽性檢驗

將大腸桿菌BL21(108CFU/mL)，金黃色葡萄球菌CVCC1885(108CFU/mL)等采用牛津杯瓊脂打孔法分別制成指示菌平板，向孔中加入150μL的發(fā)酵離心上清液(S)及發(fā)酵原液(C)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測定菌株S1039發(fā)酵上清液是否能夠抑制陰陽性細(xì)菌的生長，以發(fā)酵原液及水洗沉淀做對照，每組試驗重復(fù)三次.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株S1039鑒定結(jié)果

2.1.1 S1039的菌落及菌體形態(tài)特征

菌株S1039的菌落及菌體形態(tài)特征如圖1所示.由圖1可以看出， S1039細(xì)胞短桿狀、芽孢中生、呈橢圓形、革蘭氏染色陽性，菌落邊緣較整齊、灰白色、表面光滑濕潤、不產(chǎn)生可溶性色素.

(a)菌落形態(tài)

(b)革蘭氏染色1 000倍油鏡觀察圖1 菌株S1039菌落及菌體形態(tài)特征

2.1.2 16SrDNA測序分析

16SrDNA PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，菌株S1039 16SrDNA擴(kuò)增片段在1.5 kb左右，符合細(xì)菌16SrDNA片斷大小，在凝膠成像儀紫外條件下快速切割該目的條帶，薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收后(上海捷瑞)，送至上海生工生物工程有限公司測16SrDNA序列大小為1 478 bp，

序列信息為CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGTCTCTTCGGAGGCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGATGGCTTCGGCTATCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTG CAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAA CACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTG TAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT TGGGGGTTTCAATACCCTCAGTGCCGCAG CTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAG TACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGA CCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTTCGGGG CAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTA GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGA GAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGG CGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT GGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGA GAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTC AGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTA CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACA.

圖2 S1039的16SrDNA擴(kuò)增電泳圖

NCBI在線登錄使用Blastn在GeneBank基因庫中進(jìn)行同源性搜索，通過從Genebank中選擇與此菌株16SrRNA相似性最高的其它菌株的16S rRNA序列，采用MAGA 6.06構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示.由圖3可以看出，S1039與短短芽孢桿菌Brevibacillusbrevisstrsin CanS-411 (KT5 80607.1)的親緣關(guān)系最近，且在一個分支中.由此證明，菌株S1039為短短芽孢桿菌.

圖3 S1039的16SrDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

2.1.3 菌株S1039生理生化試驗結(jié)果

短短芽孢桿菌S1039的生理生化特征性試驗結(jié)果如表1所示.

表1 短短芽孢桿菌S1039的生理生化特征

注：+表示陽性反應(yīng)；-表示陰性反應(yīng)；V表示陽性或陰性反應(yīng).

2.2 菌株S1039胞外抗菌粗提物的抑菌活性測定結(jié)果

采用雙層平板瓊脂擴(kuò)散法測定抗菌粗提物的抑菌活性，其結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，以金黃色葡萄球菌CVCC1885(108CFU/mL)做指示菌，抗菌粗提物的抑菌直徑為18.6 mm，以大腸桿菌BL21(108CFU/mL)做指示菌，抗菌粗提物的抑菌直徑為21.4 mm.說明菌株S1039產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有良好的抑菌活性[12].

(a)金黃色葡萄球菌CVCC1885

(b)大腸桿菌BL21圖4 S1039胞外抗菌粗提物抑菌活性測定

2.3 菌株S1039胞外抗菌粗提物的部分性質(zhì)

2.3.1 蛋白酶對抗菌粗提物抑菌活性的影響

不同蛋白酶液處理后的抗菌粗提物抑菌活性測試結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出，胰蛋白酶、胃蛋白酶處理過的抗菌粗提物抑菌活性無明顯下降，蛋白酶k及鏈霉蛋白酶處理過的抗菌粗提物抑菌活性明顯下降，說明該抑菌物質(zhì)對其敏感.

圖5 不同蛋白酶對抗菌粗提物抑菌活性影響

2.3.2 pH對抗菌粗提物抑菌活性的影響

不同pH對胞外抗菌粗提物抑菌活性影響如圖6所示.由圖6可以看出，當(dāng)pH在7～8時，抗菌物質(zhì)的抑菌活性最好，抑菌圈直徑為18.76 mm，pH低于7時，抑菌活性明顯下降.當(dāng)pH降為3時，仍有一定的抑菌活性.pH高于8時，抗菌物質(zhì)抑菌活性隨著pH的增大而緩慢減小，表明該抑菌物質(zhì)對堿類物質(zhì)不敏感或其本身就是一類堿性物質(zhì)[13].

圖6 不同pH值對胞外抗菌粗提物抑菌活性的影響

2.3.3 溫度對抗菌粗提物抑菌活性的影響

不同溫度對抗菌粗提物的抑菌活性影響如圖7所示.由圖7可以看出，在研究的溫度變量范圍內(nèi)，40 ℃恒溫水浴處理的抗菌物質(zhì)抑菌活性最高.隨著溫度的持續(xù)升高，抗菌物質(zhì)的抑菌活性呈緩慢下降的趨勢，在50 ℃～70 ℃之間抑菌活性基本不變，溫度高于70 ℃時，抑菌活性下降較明顯，當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時，抗菌物質(zhì)抑菌活性下降了31%，說明該抗菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性[12,14,15].

圖7 不同溫度對抗菌粗提物抑菌活性的影響

2.3.4 抗菌物質(zhì)抑革蘭氏陽性及陰性菌檢驗

短短芽孢桿菌S1039產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對革蘭氏陰性菌及陽性菌抑菌性檢驗如圖8所示.由圖8可以看出，菌株S1039均能夠抑制大腸桿菌BL21(陰性菌)及金黃色葡萄球菌CVCC1885(陽性菌)的生長，并且從抑菌圈的大小能夠說明該抑菌物質(zhì)對陰性菌的抗性較強于陽性菌，其是否能夠抑制真菌及病原菌的生長還有待進(jìn)一步試驗驗證.

(a)金黃色葡萄球菌CVCC1885

(b)大腸桿菌BL21圖8 抗菌物質(zhì)抑制革蘭氏陽性及陰性菌檢驗

另外取出離心沉淀，超聲破碎10 min，無菌水洗滌3次，以無菌水洗破碎的沉淀溶液作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水洗沉淀無抑菌圈產(chǎn)生，表明該抑菌物質(zhì)分泌于胞外，而對照組有較小的抑菌圈產(chǎn)生，出現(xiàn)這種情況的原因可能是：(1)未水洗沉淀中大量細(xì)胞含有少量的胞外分泌物；(2)發(fā)酵上清液未徹底去除.

3 結(jié)論

菌株S1039分離于美國黃石國家公園土壤，經(jīng)形態(tài)、生理生化特征測定[11]，16SrDNA測序在線比對分析(http://www.ncbi.Nlm.nih.gov/ Blast/)，鑒定S1039為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)，采用MAGA6.06構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了菌株S1039的進(jìn)化分類位置.

短短芽孢桿菌S1039分泌的胞外抗菌物質(zhì)對胃蛋白酶，胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K較敏感.在100 ℃沸水浴中持續(xù)煮沸10 min，室溫冷卻驗證仍有69%的抑菌活性，表明該抗菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性.在pH7～8之間，該抗菌物質(zhì)抑菌活性最好，抑菌直徑達(dá)18.76 mm.此外，該抗菌物質(zhì)能夠抑制革蘭氏陰性菌及陽性菌的生長，但其是否對真菌及其它病原菌具有抗性還有待進(jìn)一步驗證.下一步將對菌株S1039分泌的抗菌物質(zhì)有效活性成分進(jìn)行提取純化，鑒定該抗菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu).

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Identification ofBrevibacillusbrevisstrain and preliminary study on its antibacterial substance

GONG Guo-li1,2, WANG Zhong-zhong1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021 ,China； 2.Xi′an Microbiology and Pharmaceutical Engineering Laboratory, Xi′an 710021, China)

A high temperature resistant strain S1039 was isolated from the soil samples of the Yellowstone National Park,which was identified asBrevibacillusbrevisby morphological,physiological and biochemical and 16SrDNA sequencing.And the partial properties of the crude extract of the antimicrobial substance produced by strain S1039 were initially tested.The results showed that the bacteriostatic substance has good thermal stability and is not sensitive to pepsin,trypsin and alkaline substances.Which could inhibit the growth of Gram-negative bacteria and positive bacteria and have the prospect of industrial development.

identification;BrevibacillusbrevisS1039; antibacterial substances

2017-02-07

陜西省教育廳自然科學(xué)專項科研計劃項目(14JK1101)； 西安市未央?yún)^(qū)科技計劃項目(201309)

龔國利(1976-)，男，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn)人,教授，博士，研究方向:微生物發(fā)酵

2096-398X(2017)04-0126-06

Q939.92

A