三種蔬菜對(duì)水中四環(huán)素的吸收累積效應(yīng)

崔詩(shī)瑤，李 婧，曹海艷，范力博，蘇玉紅

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

四環(huán)素是四環(huán)素類廣譜抗菌劑的一種，常用于人畜預(yù)防、治療細(xì)菌性感染疾病，被人畜服用后，70%以上的藥品不能被完全吸收，通常以原藥或代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排出體外[1-2]。據(jù)報(bào)道，2013年中國(guó)抗生素年使用量達(dá)16.2萬(wàn)t，約占世界用量的1/2，其中52%為獸用，48%為人用，超過(guò)5萬(wàn)t抗生素被排放到水土環(huán)境中[3-4]。這些抗生素在環(huán)境介質(zhì)中雖然以痕量水平存在，但是長(zhǎng)期暴露在此濃度下的動(dòng)植物、微生物仍會(huì)受到影響，如攜帶抗性基因的抗性細(xì)菌的產(chǎn)生[5-7]，對(duì)蔬菜種子發(fā)芽及生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[8-10]。此外，研究者在肉類[11-12]及蔬菜[13-14]中也檢出了多種抗生素，而研究表明來(lái)自食品的抗生素暴露與兒童肥胖發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間呈正向相關(guān)[15-16]。

研究報(bào)告表明，土壤中的抗生素能被不同作物吸收并在體內(nèi)不同部位累積[17]，所檢測(cè)到的含量為各種抗生素在植物體內(nèi)的累積總量，難以用于判斷抗生素在植物體內(nèi)的吸收、傳輸效率和累積速率；此外，根際分泌物對(duì)植物吸收、累積TC的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，抗生素在土壤—植物系統(tǒng)內(nèi)的遷移和轉(zhuǎn)換規(guī)律尚未摸清。因此，本研究以酸性水溶液提取-SPE富集濃縮（自制MIP-SPE小柱）-高效液相色譜法測(cè)定的方法，擬研究根際暴露時(shí)間不同時(shí)，TC在小白菜、木耳菜和大白菜3種水培蔬菜葉中的含量及其累積速率，考察24 h處理后3種蔬菜不同部位TC含量分布，并初步探索根際分泌物對(duì)植物吸收與傳輸TC的影響。研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究抗生素在土壤—植物系統(tǒng)中的遷移規(guī)律，建立蔬菜中抗生素遷移模型，對(duì)蔬菜中抗生素通過(guò)食物鏈帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試蔬菜

小白菜品種：上海青（南京金盛達(dá)種子有限公司），大白菜品種：吉祥美味快菜（青島申榮農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）。種子經(jīng)H2O2（30%）催芽后用蒸餾水發(fā)芽1周，轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)1個(gè)月備用。木耳菜成株購(gòu)于烏魯木齊市南公園，在營(yíng)養(yǎng)液中緩苗1周備用。

1.2.2 供試藥劑

鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（TC，98%），北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純），北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇、冰乙酸、鹽酸、磷酸均為分析純，購(gòu)自天津市百世化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TBL80-2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；P230Ⅱ高效液相色譜儀配備紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器（大連依利特股份有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海雷磁廠）；FDY2002-SUV超純水儀（富勒姆科技有限公司）。

1.3 HPLC分析條件

Spursil C18色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為乙腈︰0.01 mol/L磷酸水溶液（20︰80，V︰V）。

1.4 抗生素根際暴露試驗(yàn)、樣品采集與前處理方法

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，用蒸餾水配制2組不同TC濃度的營(yíng)養(yǎng)液，濃度分別為5 mg/L和10 mg/L，即為T1和T2；用未處理的預(yù)培蔬菜根際液配制另外2組不同TC濃度的營(yíng)養(yǎng)液，濃度分別為5 mg/L和10 mg/L，則為T3和T4。4個(gè)處理均用液相色譜法準(zhǔn)確測(cè)定溶液中的TC濃度。

將以上4組處理營(yíng)養(yǎng)液分別裝于玻璃瓶中（瓶外壁涂黑），每瓶溶液體積均為60 mL。把預(yù)選出的生長(zhǎng)周期一致、生物量接近的3種蔬菜根部分別置于不同TC濃度處理的玻璃瓶中，每瓶1株，小白菜每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，木耳菜和大白菜每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。在不同的設(shè)定時(shí)刻（t＝1、3、8、24 h）分別取3種蔬菜的不同部位（根、莖、葉）及營(yíng)養(yǎng)液0.5 mL，植物樣品經(jīng)洗凈拭干后稱其鮮質(zhì)量，用于測(cè)定TC含量。

植物樣品用pH 3.0的蒸餾水研磨，然后超聲提取，提取液離心后取上層清液，用自制的前處理裝置富集后（MIP特異吸附），以甲醇︰乙酸＝9︰1（V︰V）的混合液洗脫，將洗脫液用N2吹至近干，用甲醇定容至0.1 mL后，用HPLC測(cè)定洗脫液中的TC含量（加標(biāo)回收率為55.22%～85.81%，RSD＝7.52%，n=9，加標(biāo)濃度10～1 500 μg/kg）；營(yíng)養(yǎng)液樣品過(guò)濾后用HPLC測(cè)定TC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際液中TC濃度的變化趨勢(shì)

分別測(cè)定了不同處理時(shí)間3種蔬菜根際液中TC的濃度變化情況（圖1是T1處理下3種蔬菜根際液中TC濃度變化，其余處理下變化趨勢(shì)相同）。隨處理時(shí)間的增加，3種蔬菜根際液TC濃度逐漸降低，小白菜和木耳菜的根際液TC濃度在8～24 h均呈下降趨勢(shì)，而大白菜的根際液TC濃度在處理8～24 h內(nèi)趨于穩(wěn)定，可見(jiàn)不同蔬菜對(duì)TC的吸收規(guī)律有所不同。

2.2 TC在不同蔬菜根、莖中的含量

圖1 3種蔬菜根際液中TC濃度的變化趨勢(shì)

表1 處理24 h后3種蔬菜根、莖中的TC含量

試驗(yàn)結(jié)果表明，3種蔬菜均能吸收累積根外部溶液中的TC。處理24 h后，3種蔬菜體內(nèi)TC的含量如表1所示。根際暴露24 h后，小白菜根中TC含量在T1和T2處理間有顯著性差異，表明根際溶液中TC濃度大小顯著影響根中TC的累積，但根際分泌物可以極大減弱這種影響，使得采用根際液配制的T3和T4處理間的小白菜根中TC無(wú)顯著性差異；小白菜莖中TC含量T1和T2處理間無(wú)顯著性差異，表明蒸餾水配制的營(yíng)養(yǎng)液中TC濃度對(duì)莖中TC累積無(wú)影響，而T4處理莖中TC含量高于T3，且存在顯著差異，T2和T4處理的莖中含量間也存在顯著性差異，表明根際分泌物有利于TC從根部向地上部遷移。在不同處理間大白菜根中的TC含量變化與小白菜表現(xiàn)出相同的規(guī)律，均表現(xiàn)為T2顯著高于T1，T3與T4差異不顯著，可見(jiàn)大白菜與小白菜的根對(duì)TC的累積量受蒸餾水配制的外部營(yíng)養(yǎng)液中TC濃度影響顯著，但不受根際液配制的營(yíng)養(yǎng)液中TC濃度影響。根外部溶液中TC濃度及溶液條件對(duì)木耳菜根、莖中TC含量影響不顯著。

2.3 不同時(shí)間對(duì)TC在蔬菜葉中的含量及累積速率的影響

TC在3種蔬菜葉中的累積速率如表2～4所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，蔬菜根部能夠快速吸收TC并傳輸至葉片，根際暴露1 h在3種蔬菜葉片中均檢出了較高含量的TC，24 h時(shí)3種蔬菜葉片中TC的含量大小依次為：木耳菜＞大白菜＞小白菜。3種蔬菜葉片中TC的含量受時(shí)間影響較小，使得累積速率不斷減小。

如表2所示，隨著吸收時(shí)間的增長(zhǎng)，小白菜葉片中TC含量只有T1變化顯著，在8 h時(shí)達(dá)到最大，顯著大于1 h；在根際暴露24 h后，葉片中TC含量4個(gè)處理之間無(wú)顯著性差異，這與其根、莖中TC含量情況有所差異（表1）。小白菜葉片中TC的累積速率隨著時(shí)間的增加呈下降的趨勢(shì)，其中T2、T3、T4不同處理時(shí)間的累積速率存在顯著差異。

如表3所示，在不同處理時(shí)間內(nèi)，木耳菜葉片TC含量T1和T2處理呈先下降（1～3 h，差異不顯著）后增加（3～24 h，T1差異不顯著，T2差異顯著）趨勢(shì)，T3和T4處理的變化規(guī)律不明顯；根際暴露24 h時(shí)，木耳菜葉片TC含量在同類營(yíng)養(yǎng)液不同TC濃度處理（T1和T2，T3和T4）之間差異顯著，在不同營(yíng)養(yǎng)液同一TC濃度處理（T1和T3，T2和T4）之間無(wú)顯著性差異，可見(jiàn)木耳菜對(duì)TC的累積量受根際營(yíng)養(yǎng)液中TC濃度的影響較明顯。隨著時(shí)間的增加，木耳菜葉片中的TC累積速率逐漸下降，不同處理根際暴露1 h時(shí)的累積速率均顯著大于3、8、24 h，3 h時(shí)的累積速率均顯著大于8、24 h；而在同一處理時(shí)間，營(yíng)養(yǎng)液中TC濃度越大，木耳菜葉片TC累積速率越大。

如表4所示，根際暴露24 h時(shí)，大白菜葉片TC含量在同類營(yíng)養(yǎng)液不同TC濃度處理（T1和T2，T3和T4）之間、不同營(yíng)養(yǎng)液同一TC濃度處理（T1和T3，T2和T4）之間均無(wú)顯著性差異。在不同處理時(shí)間內(nèi)，大白菜葉片中的TC積累速率隨時(shí)間增加而降低，不同處理根際暴露1 h時(shí)的累積速率均顯著大于8、24 h，3 h時(shí)的累積速率也顯著大于8、24 h，而同一處理時(shí)間點(diǎn)各處理TC積累速率均無(wú)顯著性差異。

表2 不同處理時(shí)間TC在小白菜葉中的含量和累積速率及其差異性分析

表3 不同處理時(shí)間TC在木耳菜葉中的含量和累積速率及其顯著性分析

表4 不同處理時(shí)間TC在大白菜葉中的含量和累積速率及其顯著性分析

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，3種蔬菜均能吸收累積根外部溶液中的TC，處理1 h內(nèi)即能在小白菜、木耳菜和大白菜葉中檢出較高含量的TC；TC的吸收與累積效率與植物種類相關(guān)，根際暴露24 h后，木耳菜葉中TC含量遠(yuǎn)大于大白菜和小白菜，這與林琳等[18-19]研究蔬菜對(duì)抗生素吸收累積的結(jié)果一致。根外部溶液中TC濃度及溶液條件對(duì)木耳菜根、莖中TC含量影響不顯著。根對(duì)TC的累積受根際溶液中TC濃度的影響，但根際分泌物可能減弱這種影響。根際分泌物與微生物相互作用，參與物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)[20]，影響TC在蔬菜中的遷移。

張乙涵等[21]發(fā)現(xiàn)水溶液中不同植物對(duì)四環(huán)素的敏感性頻次分布有明顯的差異，不同植物的根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)對(duì)四環(huán)素生態(tài)毒性的敏感順序均為：根伸長(zhǎng)＞芽伸長(zhǎng)。本試驗(yàn)處理24 h后，4個(gè)處理之間小白菜葉片TC含量無(wú)顯著性差異，而莖中TC含量T4與其他3個(gè)處理存在顯著性差異，這與張乙涵[21]等研究不同物種敏感性分布不同的結(jié)果一致。根際分泌物在短期內(nèi)對(duì)木耳菜累積TC有一定的影響，可能與植物根系分泌物和根際微生物種群的結(jié)構(gòu)與功能的差異[22]等因素有關(guān)。營(yíng)養(yǎng)液中TC濃度越大，木耳菜葉片對(duì)TC的累積速率越大，這與鮑艷宇等[23]的研究成果相似，小麥的根伸長(zhǎng)抑制率或芽伸長(zhǎng)抑制率與抗生素的濃度之間均存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。大白菜葉片TC累積速率隨處理時(shí)間增加而逐漸降低，可見(jiàn)根際分泌物對(duì)大白菜TC累積速率有抑制作用?？墒且?yàn)楦H分泌物與周圍環(huán)境產(chǎn)生根際效應(yīng)，影響根際微生物的生態(tài)分布、種群組成，進(jìn)而對(duì)植物根系活性表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用[23]。

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