黃瓜線粒體DNA指紋圖譜的構(gòu)建及其在雜交品種純度鑒定中的應(yīng)用

趙 宇，沈 佳，李 季，張 璐，婁群峰，陳勁楓

(作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 南京 210095)

黃瓜線粒體DNA指紋圖譜的構(gòu)建及其在雜交品種純度鑒定中的應(yīng)用

趙 宇，沈 佳，李 季，張 璐，婁群峰，陳勁楓

(作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 南京 210095)

為實(shí)現(xiàn)黃瓜雜交種子純度的快速鑒定，利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建‘長(zhǎng)春密刺’等21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜。結(jié)果表明：從69對(duì)線粒體引物中，共篩選出13對(duì)在21份黃瓜品種中呈現(xiàn)出多態(tài)性的引物。同時(shí)，基于親本材料的指紋圖譜，利用引物mtSSR 4對(duì)‘南水3號(hào)’商品種子進(jìn)行檢測(cè)，分子標(biāo)記鑒定純度為95.7%，且真、假雜種編號(hào)與田間形態(tài)鑒定結(jié)果一致。黃瓜線粒體DNA指紋圖譜的構(gòu)建，不僅能為‘南水3號(hào)’等雜交種的純度檢測(cè)工作提供新的技術(shù)指導(dǎo)，還可為黃瓜品種的鑒定、遺傳親緣關(guān)系分析等提供一種新的方法。

黃瓜；純度鑒定；分子標(biāo)記；線粒體；指紋圖譜

DNA指紋圖譜是指某一品種具有的不同于其他品種的特異DNA片段，其表現(xiàn)方式為一系列電泳圖譜的差異，是鑒別不同品種和品系以及子代與親本遺傳相關(guān)方面的有力工具[1]。隨著各種DNA分子標(biāo)記的出現(xiàn)，已經(jīng)構(gòu)建了部分作物的RFLP指紋圖譜[2]、RAPD 指紋圖譜[3]、AFLP 指紋圖譜[4]、SSR指紋圖譜[5-6]、ISSR指紋圖譜[7-8]、SRAP指紋圖譜[9-10]和SNP指紋圖譜[11]等。RFLP技術(shù)具有共顯性，但是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；RAPD技術(shù)成本低，但是不能鑒定雜合子；AFLP技術(shù)多態(tài)性豐富、結(jié)果穩(wěn)定可重復(fù)，但是該技術(shù)已經(jīng)申請(qǐng)專利，在應(yīng)用中具有局限性；SSR技術(shù)與AFLP技術(shù)相比，多態(tài)性更強(qiáng)，但是微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)具有一定困難；ISSR技術(shù)穩(wěn)定性和多態(tài)性都很好，但一般為顯性標(biāo)記，不能鑒定雜合子；SRAP技術(shù)可顯示大量的共顯性標(biāo)記；SNP技術(shù)可以快速地進(jìn)行基因型分型。

根據(jù)已有報(bào)道，黃瓜線粒體DNA表現(xiàn)為嚴(yán)格的父系遺傳[12-13]，并且黃瓜線粒體基因組巨大，達(dá)到了1 685 kb，且短的分散重復(fù)序列占黃瓜線粒體基因組的13%[14]，這都為線粒體標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。線粒體DNA指紋圖譜是根據(jù)不同品種間線粒體DNA多態(tài)性構(gòu)建的，對(duì)于品種鑒定、遺傳多樣性研究、種子純度分析、遺傳親緣關(guān)系分析等具有同樣重要的意義。尤其對(duì)于線粒體父系遺傳物種而言，它能快速檢測(cè)雜交種子純度，追蹤花粉污染源。

隨著黃瓜良種培育工作的迅速開展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多同名異物和同物異名現(xiàn)象，品種混亂問題給黃瓜生產(chǎn)造成了很大損失。分子標(biāo)記技術(shù)的迅猛發(fā)展為品種鑒定開辟了一種新的途徑[15]。DNA指紋鑒定技術(shù)，以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，在實(shí)際操作過程中具有快速準(zhǔn)確、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，通過構(gòu)建品種DNA指紋圖譜實(shí)現(xiàn)品種快速鑒定，已成為未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。基于黃瓜核基因組的雙親遺傳特性，RAPD[16-17]、SSR[18-19]、SRAP[20]等分子標(biāo)記構(gòu)建的部分黃瓜品種的指紋圖譜已有報(bào)道。但是由于黃瓜育種材料遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，新育成的品種間遺傳差異越來(lái)越小，這就需要更多方法來(lái)有效鑒定一些性狀差異小的品種。

筆者首次報(bào)道了基于黃瓜線粒體基因組父系遺傳特性構(gòu)建的黃瓜線粒體DNA指紋圖譜，并以‘長(zhǎng)春密刺’等21份黃瓜品種為材料，利用黃瓜線粒體基因組開發(fā)的標(biāo)記構(gòu)建了21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜，為黃瓜品種特異性、真實(shí)性、純度鑒定、遺傳親緣關(guān)系分析等提供了重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組保存的21份黃瓜種質(zhì)為試驗(yàn)材料（表1），2015年春季定植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實(shí)驗(yàn)基地。

表1 21份黃瓜種質(zhì)材料

1.2 黃瓜基因組DNA提取及檢測(cè)

取苗期新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA，用1%（ω）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃瓜線粒體引物多態(tài)性篩選

試驗(yàn)所用引物為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組開發(fā)的69對(duì)線粒體引物，對(duì)21份黃瓜品種進(jìn)行擴(kuò)增分析，從中選取穩(wěn)定擴(kuò)增且具有多態(tài)性的用于構(gòu)建線粒體DNA指紋圖譜。

以‘長(zhǎng)春密刺’等21份黃瓜品種的基因組DNA為模板，PCR 反應(yīng)體系為：2×Mix 12 μL，滅菌ddH2O 9 μL，正反向 10 μmol·L-1引物各 1 μL，模板50 ng·μL-1DNA 1 μL，總體積 24 μL，擴(kuò)增程序優(yōu)化后確定為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，68℃退火1 min，72℃延伸30 s，共6個(gè)循環(huán)，94℃變性20 s，58℃退火 1 min，72℃延伸 30 s，共 9個(gè)循環(huán)，94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共 13個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存；PCR擴(kuò)增結(jié)束后采用8%（ω）聚丙烯酰胺凝膠，180 V電泳3 h后檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染顯色后記錄數(shù)據(jù)，拍照采集電泳圖像。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上，有清晰條帶記為1，無(wú)條帶記為0，模糊不清的條帶不予統(tǒng)計(jì)，依據(jù)分子質(zhì)量從小到大的順序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用NTSYS-pc軟件生成聚類圖。

1.5 雜種1代群體驗(yàn)證

‘南水3號(hào)’是以‘13479 F’為母本和‘13560 F’為父本雜交獲得的雜種1代。從2014年秋季南京農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組生產(chǎn)的‘南水3號(hào)’商品種子中隨機(jī)取70粒，父母本各取1粒，于2015年春季定植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實(shí)驗(yàn)基地。分別提取黃瓜基因組DNA，利用在親本中具有多態(tài)性的1對(duì)線粒體引物進(jìn)行種子純度鑒定，3次重復(fù)。將分子鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證2種方法的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體引物擴(kuò)增分析

從69對(duì)線粒體引物中篩選出13對(duì)帶型清晰、多態(tài)性較好的引物用于分析21份黃瓜品種的多態(tài)性。13對(duì)引物都位于黃瓜線粒體第1條環(huán)上，每對(duì)引物可以檢測(cè)到1～3個(gè)數(shù)目不等的多態(tài)性片段，共26個(gè)多態(tài)性片段，擴(kuò)增產(chǎn)物片段在100～400 bp之間，引物數(shù)據(jù)見表 2。mtSSR5、mtSSR10、mtSSR52、mtindels87可以擴(kuò)增出3種多態(tài)性片段，mtSSR4、mtSSR46、mtSSR63、mtindels73、mtindels79 可以擴(kuò)增出 2 種多態(tài)性片段，mtSSR40、mtindels81、mtindels82、mtindels83可以擴(kuò)增出1種多態(tài)性片段。通過上述結(jié)果可以看出，黃瓜線粒體基因組具有較高的多態(tài)性。

表2 線粒體基因組多態(tài)性引物及其序列

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

采用以上13對(duì)引物對(duì)21份黃瓜材料進(jìn)行指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物都只能將21份黃瓜材料分為若干個(gè)組，沒有任何一對(duì)引物能將21份黃瓜材料完全區(qū)分。例如，21份黃瓜材料，可被引物mtSSR10分成3組（圖1-A），可被引物mtindels81分成2組(圖1-B)。因此，需要對(duì)引物進(jìn)行組合才能完全鑒定21份黃瓜材料。

圖1 mtSSR10（A）和mtindels81（B）對(duì)21份黃瓜品種資源的擴(kuò)增結(jié)果

以1代表擴(kuò)增出某個(gè)多態(tài)性DNA帶，0代表未擴(kuò)增出某個(gè)多態(tài)性DNA帶，對(duì)擴(kuò)增片段從小到大進(jìn)行轉(zhuǎn)換，將這些圖譜轉(zhuǎn)換為由1和0組成的字串。根據(jù)上述13對(duì)線粒體多態(tài)性引物的0、1統(tǒng)計(jì)結(jié)果，構(gòu)建了21份黃瓜品種線粒體DNA數(shù)字化指紋圖譜（表3），通過不同的字串排列順序，鑒定出不同黃瓜品種。

表3 21份黃瓜品種線粒體DNA數(shù)字化指紋圖譜

2.3 聚類分析

通過UPGMA聚類分析，得到21份黃瓜品種的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖2)。以遺傳相似系數(shù)0.71為標(biāo)準(zhǔn)，可將21份黃瓜品種分為4個(gè)類群：A、B、C、D類。A 類包括‘長(zhǎng)春密刺’‘EC5’‘朝優(yōu) 3 號(hào)’‘L8’‘歐美佳’‘P01’‘二早子’‘8419s’‘JC3’‘樹春美雅’‘13560F’‘翠玉八號(hào)’；B 類包括‘平望（G）’‘JC1’‘寧佳 7 號(hào)’‘407 Beit Alpha’‘Homenmade Pickles’；C 類包括‘Amir’‘Boothbyls Blonde’‘13479F’；D 類只有‘Hardwickii’。通過上述結(jié)果可以看出，華北型黃瓜集中在A類，華南型和歐洲溫室型黃瓜也主要集中在A類，加工型黃瓜主要集中在B類，野生型‘Hardwickii’親緣關(guān)系遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為D類。聚類結(jié)果說明黃瓜品種的親緣關(guān)系與地域分布有較為明顯的關(guān)系，同一栽培區(qū)域育成的品種在不同程度上聚在一起。

2.4 雜交種純度鑒定

2.4.1 分子標(biāo)記鑒定結(jié)果 ‘南水3號(hào)’種子中的假種子主要是母本自交種。很明顯，引物mtSSR4對(duì)黃瓜雜交種F1及其親本能利用黃瓜線粒體父系遺傳特性（F1的條帶與父本的是一致的）進(jìn)行有效區(qū)分（圖3）。擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示：67粒種子條帶與父本一致為真雜種，3粒種子條帶與母本一致（泳道17、32、52）即母本自交種，為假雜交種，種子純度為95.7%。

圖2 21份黃瓜品種的聚類結(jié)果

2.4.2 田間鑒定結(jié)果 ‘南水3號(hào)’植株高，瓜條形狀為長(zhǎng)棒狀；‘13479 F’植株高度中等，瓜條形狀為圓筒形，在田間易于區(qū)分（圖4）。經(jīng)過田間統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株性狀多數(shù)表現(xiàn)一致。70株黃瓜，67株為‘南水 3 號(hào)’，3株為‘13479 F’（編號(hào)為 17、32、52），純度為95.7%，與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果一致，說明可以利用線粒體基因組開發(fā)出來(lái)的分子標(biāo)記檢測(cè)黃瓜雜交種子純度。

圖3 mtSSR4對(duì)‘南水3號(hào)’的純度檢測(cè)

圖4 ‘13479F’和‘南水3號(hào)’性狀比較

3 討論與結(jié)論

目前，利用線粒體基因組開發(fā)的標(biāo)記已經(jīng)構(gòu)建了部分水稻[21]、高粱[22]、大豆[23]等作物的指紋圖譜。高等植物線粒體DNA存在多種遺傳方式，有雙親、母系和父系遺傳[24]，其中大多數(shù)為母系遺傳。黃瓜線粒體DNA為父系遺傳，基因組序列大小為1 685 kb，并且基因組中含有約605 kb的重復(fù)DNA序列[25-26]。本研究利用黃瓜線粒體基因組標(biāo)記探索了黃瓜線粒體DNA的多態(tài)性，利用黃瓜線粒體DNA父系遺傳特性，首次構(gòu)建了‘長(zhǎng)春密刺’等21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜，為黃瓜品種鑒別、品種資源評(píng)價(jià)與保存、種子純度鑒定、遺傳親緣關(guān)系分析等研究提供了一種新的方法。

‘翠玉八號(hào)’和‘Boothbyls Blonde’在引物mtindels73中具有特征譜帶；‘Hardwickii’分別在引物mtSSR5、mtSSR10、mtSSR46中具有特征譜帶。在進(jìn)行DNA指紋檢測(cè)的過程中，僅采用1個(gè)特征引物即可鑒別出相對(duì)應(yīng)的黃瓜品種，簡(jiǎn)單方便。然而，就本研究而言，只有‘翠玉八號(hào)’‘Boothbyls Blonde’和‘Hardwickii’具有特征引物，鑒別能力有限。本研究的21份黃瓜品種，需要13對(duì)線粒體引物進(jìn)行組合鑒別，然而隨著黃瓜品種數(shù)量的增加，這13個(gè)引物組合的鑒別效果可能會(huì)逐漸減弱，可根據(jù)具體檢測(cè)情況適當(dāng)增加線粒體引物。

目前市場(chǎng)上廣泛存在黃瓜雜交1代品種，然而人工制種的種子質(zhì)量難以控制，容易出現(xiàn)偽劣種子。雜交種純度低不僅會(huì)使品種推廣年限變短，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量降低，影響農(nóng)民收益。因此，黃瓜雜交種品種純度的鑒定是一項(xiàng)很重要的任務(wù)。試驗(yàn)結(jié)果表明可利用本研究構(gòu)建的黃瓜線粒體指紋圖譜進(jìn)行黃瓜雜交1代種子純度的快速鑒定，這與李海梅等[27]利用線粒體基因組開發(fā)的4對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定的結(jié)果一致。與核基因組指紋圖譜相比，基于黃瓜線粒體基因組父系遺傳特性構(gòu)建的指紋圖譜，F(xiàn)1種子純度僅需檢測(cè)父本條帶即可。根據(jù)已有報(bào)道，黃瓜線粒體DNA表現(xiàn)為嚴(yán)格的父系遺傳[12-13]，未出現(xiàn)母系滲漏現(xiàn)象。因此，本文利用引物mtSSR4對(duì)‘南水3號(hào)’的70粒商品種子進(jìn)行檢測(cè)，該標(biāo)記的準(zhǔn)確率達(dá)到了100%。擴(kuò)大樣本容量后，理論上準(zhǔn)確率仍能達(dá)到100%。但在實(shí)際操作過程中，由于試驗(yàn)誤差等原因，準(zhǔn)確率可能會(huì)降低。筆者利用13對(duì)線粒體基因組開發(fā)的引物構(gòu)建了21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜，利用在親本中具有多態(tài)性的引物mtSSR4對(duì)雜交種‘南水3號(hào)’進(jìn)行快速的純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，說明利用黃瓜線粒體指紋圖譜進(jìn)行黃瓜雜交1代種子純度快速鑒定的可靠性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高。它不僅能為種子純度鑒定提供技術(shù)支持，還可以為黃瓜新品種審定和保護(hù)提供重要依據(jù)。

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Construction of mitochondrial DNA fingerprinting on cucumber and its application in purity identification of hybrid varieties

ZHAO Yu，SHEN Jia，LI Ji，ZHANG Lu，LOU Qunfeng，CHEN Jinfeng

(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,Jiangsu,China)

For the purpose of cucumber hybrid seed identification rapidly,molecular markers technology was used to establish mitochondrion DNA fingerprinting for 21 cucumber accessions included‘Changchun Mici’.The results showed that out of the 69 pairs of primers,13 pairs exhibited polymorphism among the 21 cucumber accessions were screened.Additional,using primer mtSSR 4 for purity identification of‘Nanshui3’,the result indicated that the purity was 95.7%,which were consistent with testing results in the field.The constructed mitochondrion DNA fingerprinting of the cucumber variety would not only provide a new technical guidance for the purity identification of the hybrid such as‘Nanshui 3’,but also provide a new method for the identification and genetic relationship analysis of cucumber varieties.

Cucumber;Purity identification;Molecular markers;Mitochondrial;DNA fingerprinting

2016-11-17；

2017-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“CsWHY2基因調(diào)控黃瓜線粒體父系遺傳的作用和機(jī)制研究”（31572134）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“長(zhǎng)三角地區(qū)設(shè)施蔬菜高產(chǎn)高效關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201403032）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［CX（15）1019］；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0100204-25）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD01B04-10）

趙 宇，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù)。Tel：025-84396279；E-mail：981225346@qq.com

陳勁楓，男，教授，博導(dǎo)，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù)。Tel：025-84396279；E-mail：jfchen@njau.edu.cn