大鼠部分肝切除后肝細(xì)胞生長因子激活因子抑制因子1，2的表達(dá)

席 銳，李曉濤，王 璐，王麗娟

大鼠部分肝切除后肝細(xì)胞生長因子激活因子抑制因子1，2的表達(dá)

席 銳，李曉濤，王 璐，王麗娟

目的探討肝細(xì)胞生長因子激活因子抑制因子（hepatocyte growth factor activator inhibitor, HAI）1、HAI-2在部分肝切除后的表達(dá)特點，分析HAI-1和HAI-2在肝再生中的作用。方法隨機將健康雄性SD大鼠分成對照組和肝切除組，各30只。在肝切除手術(shù)前和手術(shù)后3 h、12 h、24 h以及48 h時，對比2組HAI-1和HAI-2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果手術(shù)前2組HAI-1、HAI-2的 mRNA及蛋白均呈顯著低表達(dá)，組間無明顯差異（P＞0.05）；與手術(shù)前相比，術(shù)后對照組HAI-1、HAI-2的mRNA及蛋白均無明顯變化（P＞0.05）；而肝切除組HAI-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平先顯著升高再逐漸下降，同時間點與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HAI-2 mRNA和蛋白則無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論HAI-1在部分肝切除肝細(xì)胞再生過程中呈持續(xù)高表達(dá)，其可能參與了肝細(xì)胞再生過程，而HAI-2對肝再生過程無明顯影響。

肝切除；肝再生；肝細(xì)胞生長因子激活因子抑制因子

肝細(xì)胞具有極強的再生能力，在肝臟發(fā)生損傷或切除后，肝細(xì)胞能夠立即啟動再生過程以滿足肝細(xì)胞功能代償性需要。因此，積極研究肝再生機制具有重要意義?，F(xiàn)有研究表明肝細(xì)胞再生過程極為復(fù)雜，不僅與血管形成過程相關(guān)，而且與多種細(xì)胞因子水平具有密切關(guān)系[1]。肝細(xì)胞生長因子激活因子抑制因子（hepatocyte growth factor activator inhibitor, HAI）作為肝細(xì)胞生長因子激活因子（hepatocyte growth factor activation factor, HGFA）的抑制性因素[2-4]，被證實能夠影響基于惡性腫瘤、組織缺損情況下的肝細(xì)胞、組織生長分化過程[5-6]。本文通過觀察HAI-1和HAI-2在肝再生過程中的表達(dá)情況，旨在初步分析HAI對肝再生的影響效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級別SD大鼠60只，體質(zhì)量為180～210 g，周齡為10～12周，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，滬檢證第SCXK2008 0002號。處理方法符合實驗動物處理原則[7]。

1.2 主要儀器和試劑 超低溫冰箱（德國Heraeus公司）；TGL高速離心機（中國上海離心機械研究所）；PCR定量擴增儀、Real-time PCR試劑（美國Applied Biosystems公司）；Trizol試劑、 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑等（美國Invitrogen公司）。

1.3 建立肝再生動物模型 將SD大鼠于常溫（25±2） ℃、恒濕（50%～60%）環(huán)境中喂養(yǎng)3 d，自由飲食和喂水，光暗接受比例為12 h∶12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)后將大鼠隨機分成對照組和肝切除組，各30只。參照文獻(xiàn)[8]，將肝切除組大鼠切除部分肝組織（約70%）建立部分肝切除再生模型，具體方法如下：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，于腹部正中作一長2.0 cm切口，依次銳性分離進入腹腔，利用攝子將整個肝臟輕輕提起，完全切除肝臟中葉和左葉，剩余肝組織止血、沖洗、還納腹腔，確認(rèn)無活動性出血后依次縫合切口，手術(shù)結(jié)束。對照組大鼠接受假手術(shù)，術(shù)中不切除任何組織。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 組織獲取 對照組和肝切除組在手術(shù)前、手術(shù)后3 h、12 h、24 h以及48 h各時間段分別取6只SD大鼠，通過剖殺方式獲取全脾組織作為檢測標(biāo)本。

1.3.2 RT-PCR 將對照組和肝切除組脾組織分別進行無菌研磨后，提取1.0 g組織作為檢測標(biāo)本，添加細(xì)胞裂解溶液，經(jīng)貼壁培養(yǎng)，DEPC處理，核蛋白復(fù)合物解離等處理后用Trizol溶液一步法提取脾組織RNA，添加氯仿并用手甩脫震蕩15 s后，在室溫下進行孵育，提取經(jīng)過孵育的RNA 1.0 μg，利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶提取cDNA（具體條件為42 ℃下15 min→95 ℃下5 min→4 ℃下終止反應(yīng)5 min），將cDNA產(chǎn)物放置到-20 ℃冰箱中留存。利用Beacon designer軟件設(shè)計HAI-1和HAI-2的引物序列，由上海歌凡生物設(shè)計公司合成。完成引物合成、PCR反應(yīng)液配置后將HAI-1和HAI-2反應(yīng)液分別放置到96孔微孔板中，添加對應(yīng)cDNA模板（5.0 μl），完成封膜后，將微孔板放置到定量PCR分析儀完成RT-PCR擴增反應(yīng)，勾畫溶解曲線，讀取吸光值，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.3.3 Western blot 分別取對照組和肝切除組脾組織1.0 g進行蛋白裂解和超聲勻漿，抽提細(xì)胞總蛋白，調(diào)整樣品蛋白濃度為2 μg/μl，配置分離膠和濃縮膠。提出1.0 μl樣品總蛋白量，添加2.0倍體積loading溶液，放置到沸水中煮5 min后冷卻放置到4 ℃冰箱中備用。將蛋白樣本緩慢加入到反應(yīng)玻璃孔板中并做好標(biāo)記，將樣品放置到配置好的電泳中進行電泳反應(yīng)（上層80 V作用約20 min，下層120 V作用約40 min，待溴酚藍(lán)至分離膠底部為宜），完成電泳后，取下玻璃板進行常規(guī)切膠、PVDF轉(zhuǎn)膜、封閉后，添加一抗（即HAI-1抗體和HAI-2抗體，比例均為1∶10 000）并在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌后添加二抗孵育，制備ECL化學(xué)發(fā)光劑A和B等體積工作液，將印跡膜和工作液共同放置并孵育5 min后，吸除多余工作液和氣泡，將待測品轉(zhuǎn)移到暗室中拍攝X線片并進行顯影定影，通過圖像分析軟件進行分析，將待測品與β-actin積分光密度比作為相對蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用CHISS 2004進行統(tǒng)計分析。計量資料呈正態(tài)分布，用±s表示。多組間比較用F檢驗（組間方差齊），多重比較用q檢驗。2組間比較用成組t檢驗（組間方差齊）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HAI-1 mRNA和HAI-2 mRNA表達(dá)變化 手術(shù)前2組SD大鼠的脾組織中均有HAI-1 mRNA和HAI-2 mRNA表達(dá)，但是2組均為低表達(dá)，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

肝切除組HAI-1 mRNA術(shù)后3 h即顯著升高，12 h達(dá)峰值，然后開始逐漸下降，48 h下降到術(shù)后3 h水平，但術(shù)后各時間點均高于術(shù)前水平（P均＜0.05）。對照組HAI-1 mRNA水平術(shù)后各時間點無明顯上升，與術(shù)前保持在相同水平（P均＞0.05）。在術(shù)后各時間點，肝切除組HAI-1 mRNA均高于對照組（P均＜0.05）。見表1。2組術(shù)后HAI-2 mRNA均無明顯升高（P均＞0.05）。在術(shù)后各時間點，2組間HAI-2 mRNA差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 2組手術(shù)后不同時間點HAI-1 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of HAI-1 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表1 2組手術(shù)后不同時間點HAI-1 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of HAI-1 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

注：a. 與手術(shù)前比較，P＜0.05； b. 與手術(shù)后3 h比較，P＜0.05；c. 與手術(shù)后12 h比較，P＜0.05；d. 與手術(shù)后24 h比較，P＜0.05

手術(shù)時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術(shù)前 8.554±0.315 8.548±0.325 0.032 0.975術(shù)后3 h 11.426±0.295a 8.534±0.266 17.834 0.000術(shù)后12 h 31.157±2.583ab 8.565±0.513 19.091 0.000術(shù)后24 h 18.425±2.809abc 8.545±0.153 8.603 0.000術(shù)后48 h 12.471±0.432acd 8.555±0.298 18.277 0.000 F值 147.964 0.007 P值 0.000 0.999

表2 2組手術(shù)后不同時間點HAI-2 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of HAI-2 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表2 2組手術(shù)后不同時間點HAI-2 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of HAI-2 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

手術(shù)時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術(shù)前 1.098±0.276 1.095±0.253 0.020 0.984術(shù)后3 h 1.115±0.243 1.118±0.494 -0.013 0.990術(shù)后12 h 1.135±0.263 1.109±0.163 0.206 0.841術(shù)后24 h 1.128±0.215 1.113±0.232 0.116 0.910術(shù)后48 h 1.123±0.234 1.102±0.153 0.184 0.858 F值 0.020 0.006 P值 0.999 1.000

2.2 HAI-1蛋白和HAI-2蛋白表達(dá)變化 手術(shù)前2組SD大鼠的脾組織中均有HAI-1蛋白和HAI-2蛋白表達(dá)，但是2組均為低表達(dá)，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

肝切除組術(shù)后HAI-1蛋白水平3 h即顯著升高，12 h達(dá)峰值，然后開始逐漸下降，但術(shù)后各時間點HAI-1蛋白水平均高于術(shù)前水平（P均＜0.05）。對照組術(shù)后各時間點無明顯上升，與術(shù)前保持在相同水平（P均＞0.05）。在術(shù)后各時間點，肝切除組HAI-1蛋白水平均高于對照組（P均＜0.05）。見表3。 2組術(shù)后HAI-2蛋白水平均無明顯升高（P均＞0.05）。在術(shù)后各時間點，2組間HAI-2蛋白水平差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表3 2組手術(shù)后不同時間點HAI-1蛋白水平比較（±s）Table 3 Comparison of HAI-1 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表3 2組手術(shù)后不同時間點HAI-1蛋白水平比較（±s）Table 3 Comparison of HAI-1 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

注：a. 與手術(shù)前比較，P＜0.05；b. 與手術(shù)后3 h比較，P＜0.05；c. 與手術(shù)后12 h比較，P＜0.05；d. 與手術(shù)后24 h比較，P＜0.05

手術(shù)時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術(shù)前 8.565±0.315 8.553±0.324 0.065 0.949術(shù)后3 h 12.146±0.278a 8.586±0.268 22.583 0.000術(shù)后12 h 30.206±0.269ab 8.515±0.218 153.452 0.000術(shù)后24 h 17.253±0.298abc 8.542±0.396 43.054 0.000術(shù)后48 h 13.861±0.214abcd 8.565±0.355 31.296 0.000 F值 5422.784 0.041 P值 0.000 0.997

表4 2組手術(shù)后不同時間點HAI-2蛋白水平比較（±s）Table 4 Comparison of HAI-2 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表4 2組手術(shù)后不同時間點HAI-2蛋白水平比較（±s）Table 4 Comparison of HAI-2 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

手術(shù)時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術(shù)前 1.096±0.254 1.083±0.265 0.087 0.933術(shù)后3 h 1.113±0.245 1.132±0.492 -0.085 0.934術(shù)后12 h 1.145±0.238 1.165±0.182 -0.164 0.873術(shù)后24 h 1.123±0.256 1.115±0.333 0.047 0.964術(shù)后48 h 1.085±0.268 1.084±0.278 0.006 0.995 F值 0.052 0.067 P值 0.995 0.991

3 討 論

在生理性條件下，肝細(xì)胞主要呈靜息狀態(tài)，但是在病理性肝損傷發(fā)生后，肝臟超強的代謝和再生能力就會被即刻激活。肝細(xì)胞的再生能力作為肝部分切除術(shù)、肝臟移植術(shù)治療的生理學(xué)基礎(chǔ)，一直是臨床研究的熱點。由于肝臟再生過程受到肝臟細(xì)胞、肝外器官、蛋白基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子激活等諸多因素影響[9-10]，目前關(guān)于肝再生機制仍有諸多難解之謎，一直是再生醫(yī)學(xué)中最受關(guān)注的熱點方向。由于倫理道德的限制，目前關(guān)于肝細(xì)胞再生性研究仍處于動物實驗水平。

HGFA作為調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長因子生物學(xué)活性的關(guān)鍵性因子，能夠通過活化前體肝細(xì)胞生長因子而促進肝組織再生，而一旦HGFA活性受到抑制，則肝再生過程將受到嚴(yán)重影響。HAI作為首次發(fā)現(xiàn)于胃癌中的HGFA表面抑制因子，隨著研究的不斷深入，國內(nèi)外研究相繼發(fā)現(xiàn)其對于HGFA具有蓄積效應(yīng)，能夠通過膜結(jié)合形式將HGFA進行定位和聚集，并且通過活化細(xì)胞周圍的生長因子活性而加快細(xì)胞生長增殖。目前有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤生長過程中HAI-1和HAI-2發(fā)揮了重要作用，但是截至目前關(guān)于肝再生過程中HAI的作用價值研究仍極為少見[11-12]。

鑒于目前已經(jīng)證實在肝再生過程中主要為脾源性HAI表達(dá)[13]，且肝組織中HAI幾乎不表達(dá)，因此，本實驗在建立部分肝切除肝再生動物模型基礎(chǔ)上，以健康小鼠作為對照，旨在研究在肝再生過程中脾源性HAI-1和HAI-2的表達(dá)情況。經(jīng)過實驗觀察發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)前，SD大鼠體內(nèi)脾源性HAI-1和HAI-2表達(dá)水平均較為低下，說明在正常情況下，動物體內(nèi)脾源性HAI-1和HAI-2幾乎不表達(dá)。在手術(shù)后，對照組大鼠HAI-1和HAI-2表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著改變，說明假手術(shù)雖然也屬于應(yīng)激性反應(yīng)，但是由于未對肝組織造成損失，因此對HAI-1和HAI-2表達(dá)并無明顯影響，間接證實了HAI-1和HAI-2表達(dá)可能僅在肝再生過程中發(fā)生明顯變化。進一步對2組SD大鼠HAI-1和HAI-2表達(dá)情況進行分析發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)后，肝切除組HAI-2未出現(xiàn)明顯變化，而HAI-1先顯著上升到峰值后逐漸下降，說明在肝再生過程中HAI-2未發(fā)揮明顯影響，而HAI-1表達(dá)則與肝再生過程密切相關(guān)，同時直接證實了在肝切除后短期內(nèi)肝再生即可啟動，且HAI-1能夠參與調(diào)節(jié)肝再生過程，HAI-2雖然與HAI-1具有同源性，但是并未參與肝再生過程，說明二者生物學(xué)作用仍存在一定差別。國內(nèi)學(xué)者在實驗中通過對肝再生過程中HAI-1和HAI-2 mRNA表達(dá)水平進行分析也發(fā)現(xiàn)二者生物學(xué)作用存在相異之處[14-16]。HAI-1和HAI-2作為同源性代表因子，是目前研究最為廣泛的HAI家族成員，HAI-1作為Kunitz型抑制因子，能夠通過調(diào)節(jié)HGFA和Matriptase活性而調(diào)控HGF/ c-Met信號傳導(dǎo)通路，其表達(dá)水平能夠直接影響靶蛋白酶活性，從而對細(xì)胞生長增殖、組織損傷修復(fù)過程產(chǎn)生影響，其表達(dá)水平與肝再生過程中細(xì)胞生長周期、體內(nèi)HGFA合成分泌出現(xiàn)匱乏、肝細(xì)胞生長因子活性明顯不足、肝再生活性間歇期等有關(guān)。HAI-2作為II型跨膜型抑制劑，對組織形態(tài)形成具有重要作用，但是對于靶蛋白酶活性無明顯干預(yù)作用，因此對肝細(xì)胞再生無明顯影響。由于實驗條件有限，對于HAI具體作用通路和機制研究仍不完全，且對于肝臟疾病對肝再生的影響未予納入，因此，關(guān)于HAI在肝再生中生物學(xué)效應(yīng)仍有待臨床完善。綜上所述，部分肝切除肝再生過程中HAI-1顯著高表達(dá)，提示HAI-1參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生能力，而HAI-2并不干預(yù)肝細(xì)胞再生過程，考慮不同類型HAI因子間生物學(xué)作用存在差異，建議臨床深入研究。

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（2017-02-01收稿 2017-04-11修回）

（本文編輯 閆晶晶）

Study on the expressions of hepatocyte growth factor activator inhibitor -1, -2 after partial hepatectomy in rats

XI Rui, LI Xiao-tao, WANG Lu, WANG Li-juan*
Department of Hepatobiliary Surgery, Hanzhong Central Hospital, 723000, China *Corresponding author, E-mail: 344291852@qq.com

ObjectiveTo investigate the expressions of hepatocyte growth factor activator inhibitor (HAI-1 and HAI-2) expression after partial hepatectomy, to analyze the functions of HAI-1 and HAI-2 in liver regeneration. Methods Sixty healthy male SD rats were randomly divided into control group and hepatectomy group. Before operation and at 3 h, 12 h, 24 h and 48 h after operation, the expressions of HAI-1, HAI-2 mRNA and protein in the 2 groups were compared. Results Before operation, HAI-1, HAI-2 mRNA and protein expression levels were significantly low in the 2 groups, there were no significant differences between 2 groups (P＞0.05); When compared with the data before operation, there were no obvious changes on the HAI-1, HAI-2 mRNA and protein expressions of the control group (P＞0.05). However, the levels of HAI-1 mRNA and protein expression increased at first and then decreased gradually in the hepatectomy group after operation. When compared with the control group at the same time point, the difference was statistically significant (P＜0.05), but there were no significant changes in HAI-2 mRNA and protein (P＞0.05). Conclusions HAI-1 is highly expressed in the regeneration process after partial hepatectomy, it may be involved in the process of hepatocyte regeneration. But HAI-2 has no significant effect on liver regeneration.

liver resection; liver regeneration; HAI

R333.4

A

1007-8134(2017)03-0161-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.03.009

723000，漢中市中心醫(yī)院肝膽外科（席銳、李曉濤、王璐、王麗娟）

王麗娟，E-mail： 344291852@qq.com