熱休克蛋白47在日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化病程的動(dòng)態(tài)變化

鄧菊紅，陶 然，焦云桃，李 蘭，范翔雪，黃加權(quán)

·論 著·

熱休克蛋白47在日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化病程的動(dòng)態(tài)變化

鄧菊紅，陶 然，焦云桃，李 蘭，范翔雪，黃加權(quán)

目的觀(guān)察熱休克蛋白47（heat shock protein 47, HSP47）在日本血吸蟲(chóng)病患者肝臟組織中的表達(dá)情況及其在日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化小鼠動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)變化。方法收集2008—2012年期間同濟(jì)醫(yī)院門(mén)診和住院部日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝穿標(biāo)本72例。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP47表達(dá)；Masson染色觀(guān)察膠原增生情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HSP47、I型膠原、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor, CTGF）及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）mRNA水平的表達(dá)。構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化小鼠模型，分別于感染后第6、8、12周取小鼠肝組織，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP47表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)HSP47的mRNA和蛋白水平表達(dá)及I型膠原纖維增生情況。結(jié)果日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝組織中的HSP47主要表達(dá)在肝臟間質(zhì)細(xì)胞及蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)周?chē)㈦S纖維化程度進(jìn)展顯著增多（P均＜0.01），與I型膠原增生趨勢(shì)平行。各纖維化分期患者肝組織膠原及纖維化相關(guān)因子CTGF及TGF-β1 mRNA表達(dá)均明顯高于S0期無(wú)纖維化患者（P均＜0.01）。在肝纖維化模型小鼠中HSP47隨纖維化進(jìn)展其表達(dá)亦顯著升高，感染后第6、8、12周，HSP47及I型膠原的表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照小鼠（P均＜0.01），同血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者的表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)論HSP47在日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者和日本血吸蟲(chóng)病動(dòng)物模型肝組織中表達(dá)均上調(diào)，且隨I型膠原、CTGF、TGF-β1增多呈相同趨勢(shì)，其有望成為肝纖維化新的診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)。

HSP47；肝纖維化；日本血吸蟲(chóng)??；Ⅰ型膠原；CTGF；TGF-β1

日本血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的寄生蟲(chóng)病，該病廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲，中國(guó)共有日本血吸蟲(chóng)病患者約36萬(wàn)人[1]。日本血吸蟲(chóng)病引起的肝纖維化有其獨(dú)特之處，即蟲(chóng)卵肉芽腫纖維化后導(dǎo)致纖維組織在肝臟中的積累，形成干線(xiàn)型肝硬化，阻塞通往肝臟的血流，最終形成門(mén)脈高壓[2-4]。作為膠原特異性分子伴侶的熱休克蛋白47（heat shock protein 47, HSP47），主要存在于肝臟膠原合成細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，因參與前膠原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中修飾、折疊、裝配等整個(gè)加工過(guò)程，其合成與前膠原產(chǎn)量有密切關(guān)系而備受關(guān)注[5-7]。既往對(duì)HSP47的研究主要局限于非病原體感染模型中，而其在血吸蟲(chóng)肝纖維化中的作用鮮有報(bào)道。本研究根據(jù)文獻(xiàn)建立血吸蟲(chóng)卵（病原體感染）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型[8]，以此探討HSP47在日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化病程中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2008—2016年期間在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院門(mén)診及住院部收治的日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織標(biāo)本共72例。血吸蟲(chóng)病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《血吸蟲(chóng)病診斷標(biāo)準(zhǔn)WS261-2006》。入組條件：有明顯的疫水接觸史；糞檢中曾找到蟲(chóng)卵或毛蚴，或血清學(xué)檢查陽(yáng)性；血清學(xué)HBsAg和HBeAg均陰性；無(wú)嗜酒史。主要臨床表現(xiàn)為乏力、納差、腹脹、腹瀉或便秘、肝臟腫大。本研究臨床標(biāo)本的采集均征得患者本人知情同意，并由醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

患者經(jīng)肝臟B超定位后行肝組織穿刺活檢，部分肝組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋并切片，行HE及Masson染色和免疫組織化學(xué)（免疫組化）檢測(cè)，剩余組織用于肝組織總RNA及蛋白的提取。HE及Masson染色切片光鏡下病理學(xué)檢查采用Scheuer法，該法將肝纖維化分為S0～S4期。S0期：無(wú)纖維化。S1期：匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限竇周及小葉內(nèi)纖維化。S2期：匯管區(qū)周?chē)w維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留。S3期：纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化。S4期：早期肝硬化。炎癥活動(dòng)度分為G0～G4級(jí)。包括匯管區(qū)及匯管區(qū)周?chē)装Y與小葉內(nèi)炎癥兩項(xiàng)，當(dāng)兩項(xiàng)程度不一致以炎癥活動(dòng)度高者為準(zhǔn)。G0級(jí)：無(wú)炎癥。G1級(jí)：匯管區(qū)炎癥或小葉內(nèi)變性及少數(shù)點(diǎn)狀壞死。G2級(jí)：匯管區(qū)輕度碎屑樣壞死或小葉內(nèi)變性，點(diǎn)、灶狀壞死，嗜酸性小體。G3級(jí)：匯管區(qū)中度碎屑樣壞死或小葉內(nèi)融合壞死。G4級(jí)：匯管區(qū)重度碎屑樣壞死或小葉內(nèi)廣泛橋接壞死，累及多個(gè)小葉。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取6周齡，體質(zhì)量為（20±5）g的雌性SPF級(jí)Balb/c J小鼠（購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物房），12/12 h晝夜循環(huán)條件下自由攝取食物和飲水。日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染性野生釘螺購(gòu)自江西省血吸蟲(chóng)病防治研究所。

1.2 日本血吸蟲(chóng)肝纖維化小鼠模型構(gòu)建 將50只雌性Balb/c J小鼠隨機(jī)分成感染前和感染后6、8、10、12 周，共5組，每組10只。感染組每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴（16±1）條，對(duì)照組以不含尾蚴的去氯水處理。脫頸處死小鼠，無(wú)菌留取肝組織，一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于提取小鼠肝臟總RNA；一部分置于4%多聚甲醛固定，用于免疫組化檢測(cè)。

1.3 免疫組化檢測(cè) 取血吸蟲(chóng)病患者及感染前和感染后6、8、12周小鼠肝組織，經(jīng)固定、包埋、切片后，按兔二步法免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HSP47免疫組化檢測(cè)。操作步驟：切片（厚4 μm）常規(guī)脫蠟水化，高溫修復(fù)20 min，3%過(guò)氧化氫室溫孵育30 min，PBS振洗，滴加山羊血清封閉30 min，傾去液體，滴加抗HSP47抗體（1∶200），4 ℃過(guò)夜。次日先用PBS振洗，滴加二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，PBS再次振洗，滴加DBA，顯微鏡下控制顯色，并以去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染20 s左右，流水沖洗1次，鹽酸乙醇分化5 s，再次流水沖洗5 min返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 Masson膠原染色 選取S1～S4期患者肝活檢組織，石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木素、Masson復(fù)合染色液、苯胺藍(lán)染料行染色處理后，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化及Masson染色切片均由2名資深病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立觀(guān)察評(píng)估。免疫組化檢測(cè)以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽(yáng)性顯色。Masson染色以藍(lán)染部分表示膠原纖維。分別從患者及小鼠肝組織的每張切片中隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行半定量計(jì)算分析，按視野中棕褐色顆粒面積或藍(lán)染面積占該視野面積的百分比（%）表示。

1.6 RNA抽提和熒光定量PCR檢測(cè) 取肝組織100 mg，于液氮預(yù)冷的研缽中研磨后加入1 ml Trizol裂解液，提取肝臟總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算人HSP47、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor, CTGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）、Ⅰ型膠原α1鏈（collagen typeⅠalpha 1, COL1A1）RNA和小鼠HSP47、COL1A1 RNA濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。運(yùn)用Oligo 6軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)（引物序列見(jiàn)表1）。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，主循環(huán)30個(gè)，72 ℃終延伸10 min。通過(guò)管家基因 GAPDH（或β-actin）對(duì)目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行校正。

1.7 Western blot測(cè)定 取冰凍肝臟標(biāo)本，在冰浴下剪取少許，放入玻璃勻漿器，按照組織蛋白提取試劑盒說(shuō)明操作。上樣前用二喹啉甲酸法測(cè)定待測(cè)樣品蛋白濃度。先進(jìn)行SDS-PAGE，每孔加蛋白樣品80 μg，電泳分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用0.5%脫脂奶粉封閉30 min，加抗HSP47抗體（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜，分別加入抗兔二抗（1∶5000），室溫振搖孵育1 h，TBST洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液1 min，暗室顯影2～5 min，沖洗膠片。采用Tanon2500凝膠成像分析系統(tǒng)攝像并分析各條帶吸光度值（目的蛋白相對(duì)值=目的條帶吸光度值/β-actin吸光度值）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，以±s表示，多組計(jì)量資料間比較采用單因素方差分析（組間方差齊），多重比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primer

2 結(jié) 果

2.1 日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝組織中HSP47及膠原表達(dá) 將患者肝活檢組織行免疫組化染色及Masson膠原染色。HSP47表達(dá)的主要集中在間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕褐色顆粒，且隨纖維化進(jìn)展，HSP47陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著增多（圖1，表2）。同時(shí)，Masson染色顯示膠原（呈藍(lán)色）含量與肝纖維化分級(jí)趨勢(shì)相同（圖1，表2）。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)半定量分析，肝組織HSP47及膠原表達(dá)在S1～S4各期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。HSP47陽(yáng)性表達(dá)率在S2～S4期肝纖維化患者肝組織中明顯高于S1期肝組織（P均＜0.01），以S4期肝組織HSP47表達(dá)水平最高，且顯著高于S2期（P=0.000）、S3期（P=0.001）。肝組織膠原沉積量在S2～S4期較S1期明顯增多（P均＜0.01），其中以S4期最高。

圖1 日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝組織HSP47及膠原表達(dá)A～D. 日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝組織HSP47免疫組化染色（×400）；E～H. 日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝組織Masson染色（×200）；A、E. S1期患者肝組織；B、F. S2期患者肝組織；C、G. S3期患者肝組織；D、H. S4期患者肝組織Figure 1 HSP47 and collagen expression in liver tissue from patients with Schistosoma japonicum-induced hepatic fibrosis

2.2 日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者肝組織HSP47 mRNA水平 S0～S4期患者肝組織HSP47 mRNA表達(dá)隨肝纖維化進(jìn)展顯著增加（表3），且各期表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。HSP47 mRNA水平在肝纖維化S1～S4期均明顯高于S0期（P均＜0.01），于S3期升至峰值（P均＜0.01），但S2期與S4期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.147）。另將患者肝活檢組織按炎癥活動(dòng)度分級(jí)統(tǒng)計(jì)HSP47 mRNA表達(dá)（表4），肝炎G3級(jí)患者肝組織HSP47 mRNA水平顯著高于G1級(jí)和G2級(jí)（P＜0.01），但G1級(jí)與G2級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 不同纖維化分期患者肝組織膠原及纖維化相關(guān)因子mRNA表達(dá) 肝組織COL1A1、CTGF及TGF-β1 mRNA在S0～S4期肝纖維化患者中表達(dá)水平見(jiàn)表5，各期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。COL1A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量以S4期最高，其次為S3、S2、S1期（P均＜0.05）。CTGF mRNA隨S0～S4期呈持續(xù)增加，S4期顯著高于S0～S3期（P均＜0.01），但S0期與S1期比較，CTGF mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.155）。TGF-β1 mRNA在S0期即有表達(dá)，其趨勢(shì)亦與肝纖維化分期程度趨勢(shì)相同，S1～S4期均顯著高于S0期（P均＜0.01），以S3期最高，但與S2期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.847）。

表2 日本血吸蟲(chóng)病患者不同肝纖維化分期肝組織HSP47和Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)率（±s，%）Table 2 Positive expression rates of HSP47 and collagen type I in liver tissue from different stages of hepatic fibrosis in patients with Schistosomiasis japonica(±s, % )

表2 日本血吸蟲(chóng)病患者不同肝纖維化分期肝組織HSP47和Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)率（±s，%）Table 2 Positive expression rates of HSP47 and collagen type I in liver tissue from different stages of hepatic fibrosis in patients with Schistosomiasis japonica(±s, % )

注：多重比較采用q檢驗(yàn)。a. 與S1期比較，P＜0.01；b. 與S2期比較，P＜0.01；c. 與S3期比較，P＜0.01

肝纖維化分期 例數(shù) HSP47 Ⅰ型膠原S1期 18 1.97±0.82 1.76±0.52 S2期 15 5.76±4.53a 8.39±1.58aS3期 17 18.34±2.15ab 20.31±2.28abS4期 14 22.34±1.82abc 25.91±1.93abcF值 219.700 679.800 P值 0.000 0.000

表3 不同肝纖維化分期日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)水平（±s）Table 3 The relative expression of HSP47 mRNA in liver tissue from different pathological stages of hepatic fibrosis in patients with Schistosomiasis japonica(±s)

表3 不同肝纖維化分期日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)水平（±s）Table 3 The relative expression of HSP47 mRNA in liver tissue from different pathological stages of hepatic fibrosis in patients with Schistosomiasis japonica(±s)

注：多重比較采用q檢驗(yàn)。a. 與S0期比較，P＜0.01；b.與S1期比較，P＜0.01；c. 與S2期比較，P＜0.01；d. 與S3期比較，P＜0.01

肝纖維化分期 例數(shù) HSP47 mRNA(與β-actin比值) S0期 8 0.10±0.01 S1期 18 0.64±0.07aS2期 15 1.10±0.13abS3期 17 2.05±0.40abcS4期 14 0.91±0.16abdF值 143.600 P值 0.000

表4 不同炎癥分級(jí)日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)水平（±s）Table 4 The relative expression of HSP47 mRNA in liver tissue from different pathological grades of hepatitis in patients with Schistosomiasis japonica(±s)

表4 不同炎癥分級(jí)日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)水平（±s）Table 4 The relative expression of HSP47 mRNA in liver tissue from different pathological grades of hepatitis in patients with Schistosomiasis japonica(±s)

注：多重比較采用q檢驗(yàn)；a. 與G1級(jí)比較，P＜0.01；b. 與G2級(jí)比較，P＜0.05

炎癥分級(jí) 例數(shù) HSP47 mRNA(與β-actin比值) G1級(jí) 43 0.87±0.11 G2級(jí) 13 0.90±0.17 G3級(jí) 16 1.19±0.33abF值 17.030 P值 0.000

表5 日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織COL1A1、CTGF、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Table 5 The relative expression of COL1A1, CTGF, TGF-β1 mRNA in liver tissue from patients with Schistosoma japonicum(±s)

表5 日本血吸蟲(chóng)病患者肝組織COL1A1、CTGF、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Table 5 The relative expression of COL1A1, CTGF, TGF-β1 mRNA in liver tissue from patients with Schistosoma japonicum(±s)

注：多重比較采用q檢驗(yàn)。a. 與S0期比較，P＜0.01；b. 與S1期比較，P＜0.01；c. 與S2期比較，P＜0.01；d. 與S3期比較，P＜0.01

化分期 例數(shù) COL1A1 mRNA (與β-actin比值)肝纖維TGF-β mRNA (與β-actin比值) S0期 8 0.08±0.01 0.17±0.03 0.23±0.05 S1期 18 0.28±0.03 0.24±0.02 0.47±0.05aS2期 15 0.54±0.08ab 0.41±0.07ab 0.79±0.16abS3期 17 0.89±0.23abc 0.58±0.08abc 1.06±0.16abcS4期 14 1.39±0.20abcd 0.91±0.11abcd 1.01±0.18abcF值 166.400 227.500 82.830 P值 0.000 0.000 0.000 CTGF mRNA (與β-actin比值)

2.4 日本血吸蟲(chóng)小鼠模型血清生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化 小鼠肝臟行HE及Masson染色，鏡下可見(jiàn)蟲(chóng)卵及蟲(chóng)卵周?chē)庋磕[，肉芽腫內(nèi)膠原纖維含量隨著纖維化進(jìn)展逐漸增多，提示日本血吸蟲(chóng)肝纖維化小鼠模型構(gòu)建成功。

2.5 HSP47及膠原纖維在日本血吸蟲(chóng)纖維化小鼠模型肝組織中的表達(dá) 免疫組化染色顯示，感染第6、8、12周小鼠肝組織均有不同程度HSP47表達(dá)（圖2），且HSP47陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于蟲(chóng)卵周?chē)依w維化明顯區(qū)域，并隨纖維化程度加重表達(dá)量增加。感染不同時(shí)間點(diǎn)HSP47 mRNA及COL1A1 mRNA水平與正常對(duì)照組比較（表6），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSP47 mRNA于感染第6、8、12周均顯著高于正常對(duì)照組（P均＜0.01），感染第8周表達(dá)水平最高，但與感染第12周比較，HSP47 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.356）。Western blot結(jié)果表明HSP47蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與HSP47 mRNA相同（見(jiàn)表7）。感染血吸蟲(chóng)釘螺后肝臟COL1A1 mRNA則均明顯高于正常對(duì)照組（P均＜0.01），以感染第12周表達(dá)水平最高，其次為感染第8周和感染第16周（P均＜0.01）。

3 討 論

肝纖維化是慢性持續(xù)性肝損傷后的一種瘢痕性修復(fù)反應(yīng)，可進(jìn)展為肝硬化，也可由于肝臟本身具有再生能力，逐漸吸收瘢痕而具有逆轉(zhuǎn)的潛能[9]。肝纖維化的發(fā)生機(jī)制主要是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）合成與降解失衡，尤其是ECM中膠原纖維大量沉積[10]。研究發(fā)現(xiàn)HSP47與膠原過(guò)度沉積、組織纖維化密切相關(guān)，主要表達(dá)在纖維間隔和HSCs中[11]。本研究將臨床血吸蟲(chóng)病患者肝活檢組織進(jìn)行肝纖維化分期及炎癥活動(dòng)度分級(jí)，HSP47 mRNA表達(dá)水平隨肝纖維化的加重而逐漸上調(diào)，S3期達(dá)高峰后，S4期有所下降。S4期HSP47表達(dá)水平的下降可能與肝內(nèi)HSCs數(shù)目的減少有關(guān)，肝纖維化進(jìn)展至早期肝硬化后，肝臟內(nèi)的各種代償功能減弱，同樣HSCs的數(shù)目增加受到限制，最終導(dǎo)致HSP47的表達(dá)較S3期有所下降。此結(jié)果也說(shuō)明，HSP47表達(dá)高低不僅與單個(gè)活化HSC的HSP47表達(dá)量有關(guān)，還與HSCs的數(shù)目密切相關(guān)[12]。此外，根據(jù)炎癥活動(dòng)度分級(jí)，在各級(jí)炎癥均可發(fā)現(xiàn)HSP47 mRNA高表達(dá)，提示HSP47在血吸蟲(chóng)肝纖維化中可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥促進(jìn)組織纖維化[13]?；颊吒位顧z組織行HSP47免

表6 HSP47及COL1A1 mRNA在日本血吸蟲(chóng)纖維化小鼠模型肝組織中的相對(duì)表達(dá)量（±s）Table 6 The relative expression of HSP47 and COL1A1 mRNA in liver tissue from mice with Schistosoma japonicuminduced hepatic fibrosis(±s)

表6 HSP47及COL1A1 mRNA在日本血吸蟲(chóng)纖維化小鼠模型肝組織中的相對(duì)表達(dá)量（±s）Table 6 The relative expression of HSP47 and COL1A1 mRNA in liver tissue from mice with Schistosoma japonicuminduced hepatic fibrosis(±s)

注：多重比較采用q檢驗(yàn)。a. 與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b. 與感染6周組比較，P＜0.01；c. 與感染8周組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) HSP47 mRNA（與β-actin比值） COL1A1 mRNA（與β-actin比值）正常對(duì)照組 10 0.23±0.04 19.87±2.46感染6周組 10 0.86±0.03a 117.32±6.06a感染8周組 10 1.20±0.20ab 196.01±3.19ab感染12周組 10 0.78±0.06ab 226.12±4.78abcF值 140.200 4485.000 P值 0.000 0.000

圖3 日本血吸蟲(chóng)小鼠肝纖維化模型肝組織HSP47蛋白水平表達(dá)變化Figure 3 The protein expression levels of HSP47 in the liver tissue of mice with Schistosoma japonicum-induced hepatic fibrosis

表7 日本血吸蟲(chóng)小鼠肝纖維化模型肝組織HSP47蛋白水平相對(duì)表達(dá)變化（±s）Table 7 The relative protein expression of HSP47 in liver tissue of mice with Schistosoma japonicum-induced hepatic fibrosis(±s)

表7 日本血吸蟲(chóng)小鼠肝纖維化模型肝組織HSP47蛋白水平相對(duì)表達(dá)變化（±s）Table 7 The relative protein expression of HSP47 in liver tissue of mice with Schistosoma japonicum-induced hepatic fibrosis(±s)

注：多重比較采用q檢驗(yàn)。a. 與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b. 與感染6周組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) HSP47 mRNA(與β-actin比值)正常對(duì)照組 10 0.05±0.01感染6周組 10 0.25±0.16a感染8周組 10 0.50±0.03ab感染12周組 10 0.47±0.01abF值 66.250 P值 0.000

疫組化染色及Masson染色，S1～S4期均有HSP47表達(dá)，主要集中在間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)，且隨纖維化進(jìn)展，HSP47陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)顯著增多。同時(shí)，肝組織切片Masson染色顯示膠原的沉積也隨纖維化病理級(jí)別加重而增多。因此，日本血吸蟲(chóng)病患者在肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中，HSP47水平與Ⅰ型膠原表達(dá)量平行相關(guān)。在血吸蟲(chóng)肝纖維化小鼠模型中，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)驗(yàn)證了從臨床組織中觀(guān)察到的現(xiàn)象：HSP47主要集中于蟲(chóng)卵周?chē)依w維化明顯區(qū)域，且隨膠原纖維表達(dá)增多，其水平顯著增高。血吸蟲(chóng)肝纖維化膠原沉積在門(mén)脈周?chē)鷮?dǎo)致干線(xiàn)狀纖維化，主要由結(jié)締組織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，CTGF作為T(mén)GF-β1下游因子及纖維結(jié)締組織特異性的生長(zhǎng)因子，是一個(gè)重要纖維化相關(guān)因子[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著肝纖維化的持續(xù)進(jìn)展，CTGF mRNA水平與血吸蟲(chóng)肝纖維化病理程度呈正比增加，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。正常生理狀態(tài)下，TGF-β具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，但若其過(guò)度表達(dá)，則會(huì)誘發(fā)肝組織纖維化，且與纖維化程度呈正相關(guān)。本研究中，患者TGF-β1在肝纖維化中明顯上調(diào)，且其變化趨勢(shì)與前期研究中血吸蟲(chóng)肝纖維化小鼠模型TGF-β1表達(dá)趨勢(shì)一致[15]。隨著肝纖維化的進(jìn)展，HSP47在血吸蟲(chóng)肝纖維化患者和血吸蟲(chóng)動(dòng)物模型肝組織中表達(dá)均上調(diào)，多表達(dá)在膠原增加部位，并與CTGF及TGF-β1促纖維化因子有相似增高趨勢(shì)，有望成為肝纖維化新的診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)。

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（2016-06-21收稿 2017-05-26修回）

（本文編輯 閆晶晶）

Dynamic change of heat shock protein 47 in Schistosoma japonicum-induced hepatic fibrosis

DENG Ju-hong, TAO Ran, JIAO Yun-tao, LI Lan, FAN Xiang-xue, HUANG Jia-quan*Department of Internal Medicine, Liyuan Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430077, China *Corresponding author, E-mail: huangjiaquan21@aliyun.com

ObjectiveTo assess the expression of heat shock protein 47 (HSP47) from the liver tissues in patients with Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis, and to observe the dynamic changes of HSP47 expression in a rodent model of Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis.MethodsLiver biopsy specimens from 72 outpatients and inpatients with Schistosoma japonicuminduced liver fibrosis were collected from Tongji Hospital from 2008 to 2012. Immunohistochemical and Masson staining were performed to assess the expression of HSP47 and collagen proliferation, respectively. The mRNA expression levels of HSP47, collagen type I, connective tissue growth factor (CTGF) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were measured by real-time PCR. Experimental mouse model of schistosomiasis liver fibrosis was established, liver tissue was harvested at the 6th, 8th, 12th week after infected. Immunohistochemistry was used to detect HSP47 expression. Real-time PCR and western blot analysis were performed to detect the expression of HSP47 and collagen typeⅠ at transcriptional and protein level.ResultsHSP47-positive cells of liver biopsy samples were mainly localized in interstitial areas and the periphery of egg granulomas. The number of HSP47-positive cells was significantly increased with the aggravation of liver fibrosis (P＜0.01), in parallel with collagen typeⅠ deposition. The relative expression levels of HSP47, collagen type I, CTGF and TGF-β1 mRNA were significantly increased from fibrosis stage 1 to stage 4, as compared to stage 0 (P＜0.01). In rodent model of Schistosoma japonicum-induced hepatic fibrosis, the expression of HSP47 and collagen type Ⅰ was significantly higher than that in normal control mice at the 6th week, the 8th week and the 12th week after they were infected (P＜0.01), which was consistent with the expression change in patients with Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis.ConclusionsThe expression of HSP47 is increased in patients with Schistosoma-induced fibrosis, as well as in animal models, and is raised with the expression increased of CTGF, TGF-β1 and collagen type Ⅰ. HSP47 may be a new diagnostic marker and a potential therapeutic target for liver fibrosis.

HSP47; hepatic fibrosis; Schistosomiasis japonica; collagen type Ⅰ; CTGF; TGF-β1

R512.91

A

1007-8134(2017)03-0156-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.03.008

湖北省血吸蟲(chóng)病防治項(xiàng)目基金（XF2010-15，XF2012-17）；國(guó)家“十二五”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX10005001）

430077 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院內(nèi)科（鄧菊紅）；430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科（陶然、焦云桃、李蘭、范翔雪、黃加權(quán)）

黃加權(quán)，E-mail： huangjiaquan21@aliyun.com