雙黃連注射劑中黃芩苷致敏家兔后血清中特異性抗體的測定※

鄧穎穎 胡宗苗 周園里 陳世忠 劉繼平 張恩戶

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2015級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

雙黃連注射劑中黃芩苷致敏家兔后血清中特異性抗體的測定※

鄧穎穎 胡宗苗1周園里 陳世忠2劉繼平3張恩戶△

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2015級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

目的 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測雙黃連注射劑中小分子半抗原物質(zhì)黃芩苷致敏家兔后血清中特異性抗體效價。方法 取新西蘭種家兔10只，分為空白組、黃芩苷組，每組各5只。自家兔耳緣動脈采血10 mL，制備致敏前血清。將被液相色譜-質(zhì)譜-血清白蛋白結(jié)合系統(tǒng)檢測的黃芩苷與家兔血清體外孵育，制成黃芩苷-血漿蛋白完全抗原。將此完全抗原以皮下注射的方式對家兔進行免疫，免疫次數(shù)共5次。最后一次免疫結(jié)束后，間隔1周時間，將其麻醉，用采血針自家兔腹主動脈采血制備黃芩苷-血漿蛋白全抗原的抗血清。用ELISA法檢測抗血清的抗體效價(OD值)；間接競爭ELISA法測定家兔抗血清的特異性抗體；采用兔免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒檢測各組家兔抗血清中IgE抗體的含量。結(jié)果 黃芩苷的抗體效價(OD)與陰性對照組的(OD)比值>2，因此說明黃芩苷具有致敏性。家兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗血清中的抗體具有一定的特異性。家兔體內(nèi)明顯產(chǎn)生了外源性IgE型抗體。結(jié)論 黃芩苷對家兔具有致敏性。

黃芩苷；雙黃連注射劑；ELISA法；免疫球蛋白個體基因型；抗體

中藥注射劑是中醫(yī)藥現(xiàn)代化過程中取得的標志性重大成果，其突破了中藥傳統(tǒng)的給藥方式，并且吸收了西藥注射劑起效速度快、生物利用度高、使用方便等優(yōu)勢而在臨床中廣泛應(yīng)用。但是，其不良反應(yīng)的報道也隨之顯著遞增[1]。2010—2013年，在同期4 680例中藥注射劑不良反應(yīng)的調(diào)查統(tǒng)計中，高居首位的是雙黃連注射劑(藥物組成：金銀花、黃芩、連翹)引起的變態(tài)反應(yīng)，共計844例，約占其中的18.03%[2]。有關(guān)報道指出雙黃連注射劑中致敏成分的存在可能是引起其發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的主要原因之一[3]。黃芩苷是雙黃連注射劑中的主要成分之一，有關(guān)文獻表明其是一種小分子半抗原物質(zhì)可引發(fā)變態(tài)反應(yīng)[4-5]。但當(dāng)前有關(guān)黃芩苷與雙黃連注射劑變態(tài)反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性研究尚有待進一步探討和完善。因此，我們將運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)原理考證黃芩苷對家兔是否具有致敏性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 黃芩苷(含有量≥99.8%，由中國科學(xué)院成都生物研究所提供，生產(chǎn)批號為MUST-15011413)；Tween-20(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20150424)；鄰苯二胺(OPD)，上?？曝S實業(yè)有限公司；0.15 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)；金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白A交聯(lián)的辣根過氧化酶(HRP-SPA)；弗氏佐劑(美國SIGMA公司，10 mL，SLBD0736)；兔免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)等。

1.1.2 實驗動物 新西蘭白兔，雄性，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證號：NO.61000400000021，生產(chǎn)許可證號：SCXK-(軍)2012-0007。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 酶標儀(美國BioTek公司)；漩渦混合器(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH-S6型水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；低速離心機(江蘇省金壇市正基儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與黃芩苷特異性抗體的制備 取新西蘭種家兔10只，分為空白組、黃芩苷組，每組各5只。分別自每只家兔耳緣動脈采血10 mL，制備家兔致敏前血清。精密稱取黃芩苷2 mg，溶于0.6 mL 0.9%氯化鈉注射液中，制成3.3 mg/mL的黃芩苷0.9%氯化鈉注射液溶液，將0.4 mL的家兔致敏前血清與配制好的黃芩苷0.9%氯化鈉注射液溶液攪拌混勻，37 ℃溫育2 h后將1 mL弗氏佐劑加入此溶液中乳化混合。

使用弗氏完全佐劑乳化的抗原液進行首次免疫，將家兔背部脊中線距離脊柱3 cm處用剃毛機剃毛后，于脊柱兩側(cè)皮下多點注射，每點0.2 mL，共10處注射點，每處注射點間隔2 cm，注射完藥物后觀察注射點處有皮丘出現(xiàn)即為注射成功，家兔皮內(nèi)注射給藥后第2 d皮膚表面就會出現(xiàn)結(jié)痂，隨著時間的推后逐漸恢復(fù)。10 d后進行加強免疫，使用與首次免疫劑量相同的弗氏不完全佐劑乳化的抗原液，之后每隔7 d對免疫過的家兔再加強免疫1次，同種操作進行5次。最后一次免疫結(jié)束后隔1周時間，麻醉家兔，用采血針一頭扎入家兔腹主動脈，一頭插入5 mL抗凝管中取血，3 000 r/min離心15 min，用移液槍小心吸取上層血清，即得黃芩苷-血漿蛋白全抗原的抗血清[6]。

1.2.1.1 試劑的配制 ①碳酸鈉緩沖溶液的制備。稱取Na2CO31.465 g，NaHCO30.795 g置于50 mL量瓶中，加雙蒸水溶解且定容至刻度。②2%BSA的制備。稱取1 g BSA，加50 mL 0.15 mol/L pH 7.4 PBS攪拌使其充分溶解。③磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)的制備。量取50 μL Tween-20，加0.15 mol/L pH 7.4的PBS至100 mL，充分攪拌使其混合均勻。④HRP-SPA、底物液、終止液的制備參照文獻[7]。

1.2.1.2 抗體效價的檢測方法[8]①包被。將黃芩苷-血漿蛋白與碳酸鈉緩沖溶液按1∶4倍稀釋，以此作為包被原，每孔滴加110 μL后將96孔板置于濕盒內(nèi)，隨后將其放入4 ℃冰箱內(nèi)包被過夜；第2 d將96孔板中的液體傾盡，拍干殘留液體，然后用PBST每5 min洗滌1次，共洗滌3次，將2%BSA用移液槍每孔加入130 μL，此操作完成后將96孔板放入4 ℃冰箱中封閉過夜。②加抗血清。將96孔板中的液體傾盡，并甩去殘留液體，洗滌方法同上，洗滌后加入用0.15 mol/L pH 7.4 PBS 1∶1～1∶128每隔2倍稀釋的8個濃度抗血清各100 μL，37 ℃溫育2 h。③加酶標二抗。倒掉液體并拍干殘留液體，洗滌方法同上，洗滌后每孔加入100 μL HRP-SPA，37 ℃孵育1 h。④顯色、終止、測定方法參照文獻[7]。⑤判定陰性對照為加致敏前血清的孔，空白對照為不加血清的孔，每一樣品設(shè)5個平行孔，陽性的評判標準為:OD值大于或等于陰性對照孔2倍。

1.2.2 間接競爭ELISA測定抗體特異性 以1.00 mg/mL的黃芩苷-血漿蛋白作為包被原，每孔加入110 μL，封閉洗滌(洗滌的目的是：除去未結(jié)合的抗原和雜質(zhì))，將配置好的4.00 mg/mL黃芩苷0.9%氯化鈉注射液吸取一半放入2 mL EP管中加入等容積的0.9%氯化鈉注射液2倍稀釋，按此方法共稀釋得到5個不同濃度。然后用移液槍將上述不同濃度的黃芩苷0.9%氯化鈉注射液溶液每孔加入50 μL，之后每孔再加入用0.15 mol/L pH 7.4 PBS 1∶1稀釋的抗血清100 μL，37 ℃溫育2 h；用PBST洗滌3次后每孔加入按工作濃度稀釋的酶標抗體HRP-SPA 100 μL，37 ℃溫育1 h；洗滌、顯色、終止、測定[7]。將加稀釋液的孔作為空白對照，不加黃芩苷的孔看作0標準孔，為了減少誤差同時設(shè)置5個平行重復(fù)孔。計算黃芩苷的抑制率I(%)，應(yīng)用的公式是I=OD0-OD/(OD0-ODmin)×100%[9]，其中OD是指測定樣品的吸光值，OD0是指0標準孔的吸光值，ODmin是指空白對照孔的吸光值。繪制抑制曲線的依據(jù)為：黃芩苷濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標。通過回歸分析，建立回歸方程并計算相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.3 IgE型抗體濃度的測定 用兔免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒測定本實驗中家兔IgE的水平。具體操作步驟按說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1 不同稀釋倍數(shù)抗血清的OD值(效價)比較 見表1。

表1 不同稀釋倍數(shù)抗血清的OD值(效價)比較

與致敏前血清OD值比較，*P<0.01

由表1可見，家兔經(jīng)過黃芩苷-血漿蛋白全抗原多次免疫后的抗血清按1∶1到1∶128的倍數(shù)稀釋后結(jié)果仍為陽性，說明家兔血清中已經(jīng)產(chǎn)生了外源性抗體。黃芩苷的各稀釋抗血清組抗體效價與致敏前血清OD值(效價)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示黃芩苷具有致敏性。

2.2 黃芩苷對抗血清的特異性研究 見表2、圖1。

表2 黃芩苷對抗血清的特異性研究

通過回歸分析，建立回歸方程I=0.106lgC+0.769，R2=0.9 948，半數(shù)抑制濃度IC50=0.0 029 mg/mL，檢測限IC10為0.49 ng/mL。

圖1 黃芩苷抑制曲線

由表2、圖1可見，黃芩苷對抗血清的抑制率隨其濃度的增大而升高，表明抗血清中的抗體是針對其產(chǎn)生的，具有一定特異性。

2.3 黃芩苷抗血清中IgE型抗體濃度測定 見表3。

表3 黃芩苷抗血清中IgE型抗體濃度測定

與空白組比較，*P<0.01

通過回歸分析，建立曲線方程：Y=1.849X2+13.344X-0.30 878，r2=0.99 991，其中X為吸光度，Y為對應(yīng)IgE型抗體濃度。根據(jù)曲線方程可計算出各樣本的對應(yīng)IgE型抗體濃度及濃度提高率，提高率的計算公式=(OD-OD空白)/OD空白，OD空白是指未經(jīng)過免疫的正常家兔血清檢測出的OD值。由表3可知，黃芩苷抗血清中的IgE型抗體濃度提高率高于空白組的IgE型抗體濃度提高率，黃芩苷組IgE型抗體濃度與空白組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明經(jīng)過多次免疫后家兔體內(nèi)產(chǎn)生了外源性IgE型抗體。

3 討 論

ELISA法是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的一種敏感性很高的試驗技術(shù)，使抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體中進行，然后將其與酶對底物的高效催化作用充分相結(jié)合，最后定性、定量分析的依據(jù)是產(chǎn)物顏色的深淺。該方法以特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點而得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用[10]。

雙黃連注射劑是治療風(fēng)熱感冒的常用藥物之一，因此在臨床使用相當(dāng)廣泛。但伴隨著廣泛使用，其不良反應(yīng)也隨之增多，變態(tài)反應(yīng)所占比例最高。據(jù)有關(guān)《藥品不良反應(yīng)信息通報》統(tǒng)計分別在2011-11-19、2009-05-18、2009-09-16雙黃連注射劑引起的不良反應(yīng)(變態(tài)反應(yīng))病例報告和文獻報道頻繁，并有死亡病例[11]。其中致敏物質(zhì)存在引發(fā)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生率高、危害大，嚴重危害患者的生命健康，使多個已上市中藥注射劑在臨床中的安全使用受到人們的廣泛質(zhì)疑。因此，為了保障患者臨床用藥的安全性，分析、研究并闡明致敏性成分是解決中藥注射劑變態(tài)反應(yīng)問題的根本途徑。中藥注射劑的變態(tài)反應(yīng)主要是由IgE抗體介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)和無需IgE抗體介導(dǎo)的類變態(tài)反應(yīng)，兩者在臨床上的病理癥狀表現(xiàn)十分相似[12-13]。Ⅰ型超敏反應(yīng)由完全抗原或半抗原引發(fā)，其中半抗原分子量小，不具備抗原性，當(dāng)其進入血液后與血清白蛋白結(jié)合形成完全抗原時而獲得免疫原性，進而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)。血清白蛋白是血液中含量最高的蛋白質(zhì)，是藥物在體內(nèi)的主要轉(zhuǎn)運蛋白，也是研究具有半抗原特性藥物的常用蛋白[14]。

本實驗?zāi)M雙黃連注射劑進入體內(nèi)以后的致敏過程，將雙黃連注射劑中小分子半抗原物質(zhì)黃芩苷與家兔血清體外孵育，制成藥物-血漿蛋白完全抗原免疫家兔。經(jīng)過對ELISA法所測定的一系列數(shù)值進行分析得到黃芩苷具有致敏性。本實驗運用的ELISA法具有一定的通用性，為研究雙黃連注射劑乃至其他中藥注射劑中的致敏成分提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)方法。如若日后能將篩選出的中藥注射劑中的具體某一致敏成分制成過敏診斷試劑，通過用藥前對患者進行皮下注射判斷患者是否對該成分過敏而準確用藥，就可很大程度上減少變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，從而為患者的生命安全保駕護航。

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(本文編輯：董軍杰)

Determination of specific antibodies in serum of rabbits sensitized by baicalin in shuanghuanglian injection

DENG Yingying, HU Zongmiao, ZHOU Yuanli, et al.

2015-Grade Master of Pharmaceutical College in Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shaanxi, Xianyang 712046

Objective To detect the specific antibody titers by ELISA in the small molecular semi- antigenic baicalin components of shuanghuanglian injection in the rabbits sensitized by baicalin. Methods Total 10 New Zealand rabbits were randomized into the the blank group and baicalin group, 5 rabbits in each group. Blood (10 mL) was collected from auricular artery for serum preparation befroe sensitization. The serum was incubated in vitro with baicalin which detected by lc-ms-serume albumin binding system, preparing baicalin-serum protein complete antigen. Rabbits were immunized by subcutaneous injuection of complete antigen 5 times. The antiserum of baicalin-serum protein complete antigen was collected from abdominal aorta at a one week interval after the last immunizations. ELISA was used to determine the specific antibody titers (OD value) of antiserum. The indirect competitive ELISA was used to determine the antiserum specificity. ELISA kit was used to detect the level of rabbit immunoglobulin (IgE) antibody in serum. Results The antibody titers ratio of baicalin and nagative control group was more than 2, so that the baicalin had sensitization. The antibody from antiserum in rabbits had somewhat specificity. The exogenous IgE antibody was produced in rabbits clearly. Conculsion Baicalin has sensitization to rabbits.

Baicalin; Shuanghuanglian injection; ELISA;Immunoglobulin Antibody idiotypes

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.06.019

北京市自然科學(xué)基金資助項目(編號：7142088)

鄧穎穎(1991—)，女，學(xué)士，碩士研究生在讀。研究方向：中藥藥理。

R-332;R284.1;R287；R392.11

A

1002-2619(2017)06-0880-04

2017-03-17)

△ 通訊作者：陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室，陜西 咸陽 712046

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2014級碩士研究生，陜西 咸陽 712046

2 北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，北京 100083

3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室，陜西 咸陽 712046