制作木質(zhì)纖維材料超薄切片的軟化及固定技術(shù)

鄧立紅

北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100083

制作木質(zhì)纖維材料超薄切片的軟化及固定技術(shù)

鄧立紅

北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100083

將木質(zhì)纖維材料樣品制作成超薄切片，再利用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察分析，是研究木質(zhì)纖維材料超微結(jié)構(gòu)的重要手段，過程中超薄切片的質(zhì)量至關(guān)重要。由于木質(zhì)纖維材料結(jié)構(gòu)性質(zhì)的特異性，其超薄切片樣品的制作過程也有相應(yīng)的要求。經(jīng)過詳細(xì)調(diào)研近些年國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對木質(zhì)纖維材料樣品超薄切片制作過程中軟化和固定過程的原理、方法及應(yīng)用情況進(jìn)行了闡述和總結(jié)，為相關(guān)研究提供技術(shù)參考。

透射電子顯微鏡；木質(zhì)纖維；軟化；固定

木質(zhì)纖維植物細(xì)胞壁主要組分為纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素，三者有機(jī)結(jié)合在一起，形成相對穩(wěn)定而又復(fù)雜的細(xì)胞骨架。觀察分析各組分在細(xì)胞壁層中的發(fā)育、分布及細(xì)胞壁層內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，歷來是植物學(xué)、木材化學(xué)、制漿化學(xué)的重要內(nèi)容。1932年Ruska發(fā)明的以電子束為光源的透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，簡稱TEM)，具有光學(xué)顯微鏡所不能及的高分辨率，能夠觀察到小于0.2 um的超微結(jié)構(gòu)，被廣泛使用于生物材料的超微結(jié)構(gòu)研究當(dāng)中。由于電子的穿透能力有限，在使用透射電子顯微鏡觀察樣品前，必須先將樣品經(jīng)過一系列前處理后，用超薄切片機(jī)切割成厚度不超過100 nm(50 nm以下更適宜)的超薄切片，才能得到滿足研究要求的電鏡照片。

一般木質(zhì)纖維材料樣品切片前的處理過程包括軟化、固定、沖洗脫水、滲透以及包埋這幾個步驟。由于取材及研究目的差異，前處理過程也有差異。有些樣品必須軟化而無須固定，有些樣品不能進(jìn)行軟化而必須固定。本文將根據(jù)以往的文獻(xiàn)報道，對木質(zhì)纖維材料制作超薄切片的軟化及固定處理技術(shù)進(jìn)行總結(jié)介紹。

1 軟化

相比其他生物材料，木質(zhì)纖維材料有一些特性：細(xì)胞種類多，經(jīng)常含有硅質(zhì)細(xì)胞、栓質(zhì)細(xì)胞或石細(xì)胞；細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞壁中含結(jié)晶結(jié)構(gòu)。這使得材料樣品質(zhì)地堅硬粗糙，容易損傷超薄切片機(jī)昂貴的鉆石刀刃。為了避免這一現(xiàn)象發(fā)生，在不影響實驗結(jié)果的情況下，可以對樣品進(jìn)行軟化處理。

1.1 軟化機(jī)理

木質(zhì)纖維材料是由40%～50%的纖維素、15%～30%的半纖維素、20%～40%的木質(zhì)素為三大主要組分的天然復(fù)合材料。軟化處理采用物理或化學(xué)方法處理材料，使材料變?nèi)彳?，以利于切片，減少對刀片的磨損。軟化機(jī)理主要包括兩點。第一，利用三大主要組分的軟化性質(zhì)。三大組分的分子結(jié)構(gòu)特征使其具有向玻璃化轉(zhuǎn)變的性質(zhì)[1]。在熱作用下，能向玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化，使材料具有黏彈性而變得柔軟[2,3]，尤其是木素的黏彈性更顯著[4]；濕熱耦合作用還可以降低木材半纖維素和木質(zhì)素的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[5]。第二，利用水、有機(jī)溶劑、酸、堿對纖維素非結(jié)晶區(qū)、半纖維素及木質(zhì)素產(chǎn)生潤脹或輕微降解，為分子劇烈運動提供自由體積空間，使材料各組分間的結(jié)合力減弱而軟化[6,7]。在具體軟化過程中，這兩種機(jī)理經(jīng)常同時起作用。

1.2 軟化方法

基于以上兩種軟化機(jī)理，研究得到了很多種用于切片的軟化處理方法，可粗分為化學(xué)法和物理法兩種。主要包括水熱法、氨水-醋酸法、聚乙二醇法、醋酸法、過氧化氫-冰醋酸法、氫氟酸法、三甘醇法、酒精乙醇法等。操作時一般是在加熱或室溫條件下，用水、水蒸氣或以上試劑浸泡處理樣品數(shù)小時至數(shù)天，再將樣品清洗干凈進(jìn)行后續(xù)處理。表1匯集了近年文獻(xiàn)中所用的一些軟化方法。

表1 木質(zhì)纖維材料超薄切片軟化處理示例

軟化對材料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或多或少有改變，當(dāng)研究材料為活體取樣時，為了維持樣品的原始形態(tài)結(jié)構(gòu)，就一定不能軟化樣品。因此軟化往往是針對風(fēng)干材進(jìn)行的。另外在個別情況下，例如實驗過程與制作超薄切片的軟化過程基本一致，則不需要對實驗材料進(jìn)行軟化。Cordt等曾采用透射電鏡觀察針葉木木熱處理過程中細(xì)胞壁的變化情況[16]。他們將歐洲赤松經(jīng)過有機(jī)溶劑抽提和熱水抽提，然后在不同溫度下進(jìn)行熱處理，研究不同熱處理溫度對細(xì)胞壁的影響。這個處理過程實際已經(jīng)起到軟化的作用，所以熱處理后材料直接經(jīng)滲透包埋用于切片觀察。各種材料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性有差異，因此軟化過程最好在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上適當(dāng)改進(jìn)，才能獲得理想的結(jié)果。

2 固定

對于從活體上取下的新鮮材料，為了維持細(xì)胞和組織的原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，必須對樣品進(jìn)行固定。否則，離體的組織會出現(xiàn)干枯和萎縮，外界的微生物也會浸入組織進(jìn)行破壞。同時，細(xì)胞內(nèi)各種酶還有活力，會使細(xì)胞壁自溶解體，材料結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[17]。而固定時所采用的固定劑通過凝固、生成化合物等使蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使酶失活，達(dá)到阻止內(nèi)源性溶酶體酶對自身組織和細(xì)胞的自溶、抑制細(xì)菌和霉菌的生長的目的。

新鮮樣品取下來后，需要隨即投入置于具塞小試管或干凈蠟版上的固定液中，使樣品細(xì)胞快速失去活性。如果材料漂浮于固定液上，可以用真空泵進(jìn)行減壓抽氣，排除材料內(nèi)部空氣，以利固定液滲入，材料下沉[17]。

但是，對于風(fēng)干的木質(zhì)纖維材料，因為細(xì)胞早已木質(zhì)化，失去水分和活性，不容易被微生物污染而改變形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以不進(jìn)行固定處理，這也是植物纖維材料樣品相對于其他生物材料樣品的一個特征。此時如果進(jìn)行固定處理，是為了增加切片的反差[18]。

2.1 常用固定劑及固定原理

影響固定過程最重要的因素是固定液的類型。常用于超薄切片制作的固定劑有鋨酸(四氧化鋨，OsO4)、醛類、高錳酸鉀等。

鋨酸可以與脂類、糖類和蛋白質(zhì)反應(yīng)而起到固定作用。其對脂類的固定作用可以補(bǔ)充醛類固定劑對脂類固定不足的缺點。同時能增加膜的反差，起到“電子染色”作用，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)比較清晰。但鋨酸滲透力弱，所以樣品塊要小。

醛類固定劑主要有甲醛、戊二醛和多聚甲醛。固定原理在于醛基能與蛋白質(zhì)的氨基作用，產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)而起固定作用，但具體的反應(yīng)過程迄今尚未完全探清[19]。戊二醛是經(jīng)常使用的固定劑，在植物切片中使用更多。戊二醛與蛋白質(zhì)反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑。但它的滲透速度較慢，必要時配合甲醛或鋨酸使用效果更佳。戊二醛起作用時經(jīng)常需要氧氣參與，由于大塊樣品內(nèi)部氧氣供應(yīng)不足，戊二醛在樣品內(nèi)部無法形成穩(wěn)定的產(chǎn)物，導(dǎo)致樣品內(nèi)部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時，小塊的樣品固定效果較理想。電鏡固定通常用市售的25%的戊二醛水溶液，用緩沖液稀釋成需要的濃度，最常用的濃度為3%～4%。

高錳酸鉀可以與脂類反應(yīng)而固定磷脂膜的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)的反差，如細(xì)胞質(zhì)膜、高爾基體、線粒體的嵴突和葉綠體的片層等，但不能保存細(xì)胞的許多其他成分。其穿透性強(qiáng)，因而較適用于有厚細(xì)胞壁的竹木材樣品。

2.2 固定過程

各種固定劑都有優(yōu)缺點，為了使固定效果更完全，普遍采用雙重固定法。表2整理介紹了近年文獻(xiàn)中介紹的木質(zhì)纖維材料的固定過程。

表2 木質(zhì)纖維材料超薄切片固定處理示例

表2 (續(xù))

由表2可以看出，對于木質(zhì)纖維材料，用得最普遍的固定劑是戊二醛和鋨酸，一般將它們配合使用，即戊二醛作為前固定劑，鋨酸作為后固定劑。磷酸緩沖溶液用得較多。差異主要體現(xiàn)在固定劑濃度及固定時間，這兩個因素的水平最好在實驗基礎(chǔ)上確定。

也有不對樣品進(jìn)行固定的情況。尤華明等研究了竹材和馬尾松材的切片技術(shù)，在沒有固定過程的情況下也取得了理想的透射電鏡效果[14]。Adya等將脲醛樹脂黏合輻射松木木片，通過透射電鏡研究樹脂在輻射松管胞中的滲透過程。并沒有經(jīng)過軟化、固定處理，利用樹脂對木片的黏合過程中直接滲透、包埋樣品，切片，切片經(jīng)染色后，也得到了滿足實驗要求的透射電鏡照片[36,37]。

3 結(jié)束語

(1)任何軟化過程都會在一定程度上改變細(xì)胞原始結(jié)構(gòu)，所以對于新鮮活體取下的材料一定能進(jìn)行軟化處理。對于已經(jīng)失去活性的材料，也應(yīng)盡可能選擇條件溫和、軟化效果又能達(dá)到要求的軟化過程，合適的軟化過程應(yīng)該在實驗基礎(chǔ)上得到。

(2)固定處理對于活體取樣一般是必需的，大多數(shù)風(fēng)干材為了提高切片質(zhì)量也進(jìn)行固定處理。多數(shù)文獻(xiàn)以戊二醛作為前固定劑，鋨酸作為后固定劑。固定劑濃度、時間也需要在實驗基礎(chǔ)上得到。但目前并未見專門研究木質(zhì)纖維材料固定技術(shù)的報道。

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Softening and Fixation for Preparing Ultrathin Section of Lignocellulosic Meterials

Deng Lihong
Collge of Material Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing, 100083, China

Using transmission electron microscopy observation is an important means to study the ultrastructure of lignocellulosic materials, and the effect depends largely on the quality of the ultrathin section. Because of the special structure and property of the lignocellulosic materials, the preparing of their ultrathin section owns speci fi city itself. This paper investigates the related literatures in recent years to summarize the principles, methods and application of softening and fi xation process during preparing ultrathin section of lignocellulosic materials, to provide technical reference for related research.

transmission electron microscopy; lignocellulose; softening; fi xation

鄧立紅，博士，高級實驗師。

質(zhì)檢公益性行業(yè)科技專項：竹木及水果等植物檢驗處理裝備與技術(shù)研究—熏蒸處理對竹木制品材料理化性狀影響的研究(編號：201410054-04)。