乳雙歧桿菌Probio-M8和副干酪乳桿菌PC-01對(duì)發(fā)酵乳微流變學(xué)特性及穩(wěn)定性的影響

苗壯壯，楊淑娟，劉凱龍，武 婷，郭 帥，白 梅，王記成，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

人體內(nèi)的微生物群落獨(dú)特而復(fù)雜，腸道菌群形成多樣而穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，可調(diào)節(jié)宿主穩(wěn)態(tài)，對(duì)人體健康非常重要[1]。2001年，世界衛(wèi)生組織（WHO）和糧農(nóng)組織（FAO）提出一個(gè)定義：“當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí)，需要對(duì)宿主產(chǎn)生足夠益處的活性微生物，稱(chēng)為益生菌”[2-4]。2020年，中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)發(fā)布了益生菌科學(xué)共識(shí)，提出益生菌需要具備3 個(gè)特征，第一需要足夠的數(shù)量，第二需要對(duì)人體健康產(chǎn)生益處，第三必須是活性的微生物[5]。

雙歧桿菌是人體的胃腸道中具有代表性的一類(lèi)有益的微生物，其具有免疫調(diào)節(jié)，改善腸道、生物性屏障和抗腫瘤等多種重要的生理功能，對(duì)人體的健康具有重要的作用[6]。本研究所用乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）Probio-M8，分離自?xún)?nèi)蒙古呼和浩特市健康婦女母乳[7]。Liu 等[8]在2020年研究了乳雙歧桿菌Probio-M8 具有良好的胃腸消化耐受特性。2020年，翟云等[9]對(duì)免疫抑制模型大鼠灌服乳雙歧桿菌Probio-M8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以提高大鼠的特異性和非特異性免疫應(yīng)答調(diào)控的能力，說(shuō)明灌服益生菌對(duì)免疫抑制大鼠的免疫調(diào)節(jié)有一定的促進(jìn)作用。熊濤等[10]發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬的酪乳桿菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和人體胃腸道中，不僅具有十分良好的耐酸耐膽鹽的能力及較強(qiáng)的黏附功能；而且還能耐受人體胃腸道的防御機(jī)制并可在腸道內(nèi)定殖。本研究用副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）PC-01分離自西藏拉薩地區(qū)當(dāng)雄縣龍仁鄉(xiāng)酸牦牛奶[11]。發(fā)酵乳是將益生菌傳遞到人體胃腸道的理想載體，是益生菌在功能食品領(lǐng)域的重要應(yīng)用形式[12]。

本文研究益生菌發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中的微流變學(xué)特性，微流變的靈敏度較高，通過(guò)對(duì)發(fā)酵乳體系中粒子運(yùn)動(dòng)的追蹤來(lái)表征該樣品的黏彈性變化，在不破壞發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)的情況下研究發(fā)酵乳樣品的流變特性。測(cè)定發(fā)酵過(guò)程和貯藏期間的活菌數(shù)、pH 值、滴定酸度、黏度和持水性，評(píng)價(jià)添加益生菌對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌種和培養(yǎng)基 本研究所用基礎(chǔ)發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌ND02 和嗜熱鏈球菌ND03）、乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 直投式發(fā)酵劑，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試驗(yàn)材料 牛乳，蒙牛乳業(yè)有限公司；白砂糖，廣西鳳糖有限公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基，英國(guó)Oxoid 公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽，北京酷來(lái)搏科技有限公司；萬(wàn)古霉素，陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 黏度計(jì)DV-2T 型，Brookfield 公司；pH 計(jì)FE28 型，梅特勒（上海）有限公司；微流變儀Rheolaser Master，法國(guó)Formulaction 公司；超凈工作臺(tái)（SJ-CJ-2FDQ），蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)SPXAPV1000型，上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司；水浴鍋，一恒科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳制備 將6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 白砂糖溶解于94%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛乳中，加熱至65 ℃，均質(zhì)（20 MPa）后，于95 ℃、5 min 殺菌，冷卻到37 ℃接種益生菌和發(fā)酵劑。各試驗(yàn)組發(fā)酵劑接種情況如表1。將樣品于37 ℃恒溫發(fā)酵至pH 4.50 為終點(diǎn)，冰水浴冷卻，置于4 ℃后熟24 h 和貯藏28 d，發(fā)酵過(guò)程中每間隔2 h 取發(fā)酵乳樣檢測(cè)，貯藏期間每隔7 d 取樣品進(jìn)行貯藏指標(biāo)的檢測(cè)。

表1 試驗(yàn)分組明細(xì)Table 1 Experiment grouping details

1.2.2 微流變特性的測(cè)定 取接種發(fā)酵劑后的乳樣品20 mL，倒入無(wú)菌微流變儀專(zhuān)用玻璃管（內(nèi)徑27.5 mm），迅速將玻璃管轉(zhuǎn)移至測(cè)定槽中，流變儀設(shè)置為37 ℃。每1 min 測(cè)量1 次，至發(fā)酵終點(diǎn)。原始數(shù)據(jù)的收集和分析在儀器上的軟件進(jìn)行。

1.2.3 活菌數(shù)的測(cè)定 本試驗(yàn)采用的是平板傾注法計(jì)活菌數(shù)。發(fā)酵乳樣品中乳雙歧桿菌Probio-M8采用ML 固體培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)72 h；副干酪乳桿菌PC-01 采用固體培養(yǎng)基MRS-V（萬(wàn)古霉素10 mg/L） 進(jìn)行選擇培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)72 h；均在厭氧條件下培養(yǎng)[13]。

1.2.4 酸度的測(cè)定 采用FE28 型pH 計(jì)直接測(cè)定pH 值；滴定酸度根據(jù)GB 5413.34-2010 中“乳和其它乳制品酸度的測(cè)定”的方法，每個(gè)樣品測(cè)定3 組平行[14]。

1.2.5 黏度的測(cè)定[15]將發(fā)酵乳樣品放置室溫后，利用DV-2T 黏度計(jì)測(cè)發(fā)酵乳樣品，3 次平行。測(cè)定條件：選擇4#轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min，扭矩為10%～100%，測(cè)定時(shí)間是30 s。

1.2.6 持水性的測(cè)定 稱(chēng)取20 g 發(fā)酵乳樣品，放置在有定量濾紙的玻璃漏斗中，室溫下靜置120 min 后收集濾液，立即稱(chēng)取濾液的質(zhì)量[16]。計(jì)算公式：

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 本試驗(yàn)的樣品每組均至少測(cè)定3 次平行，結(jié)果用“平均值±方差”表示，采用SPSS分析各樣本間的差異，P<0.05 表示差異顯著；作圖采用Origin 2018 軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 固液平衡值的檢測(cè)結(jié)果

本研究采用多頻擴(kuò)散波譜法對(duì)添加不同益生菌發(fā)酵乳的凝膠過(guò)程進(jìn)行了微流變學(xué)特征分析。隨著時(shí)間的推移，EI 與彈性模量成正比，MVI 與黏性模量成正比，F(xiàn)I 反映微觀粒子運(yùn)動(dòng)的快慢，SLB 與發(fā)酵乳產(chǎn)品的黏彈性性能成正比，并給出了類(lèi)固液比[17]。固液平衡值（SLB）直接表現(xiàn)了產(chǎn)品偏向于固態(tài)或者液態(tài)與時(shí)間對(duì)應(yīng)的函數(shù)關(guān)系，當(dāng)0

圖1 發(fā)酵過(guò)程中固液平衡值的變化Fig.1 Changes of solid liquid balance （SLB）during fermentation

2.2 彈性因子的檢測(cè)結(jié)果

彈性因子（EI）作為時(shí)間的函數(shù)可直接反映彈性模量，即儲(chǔ)能模量在一定時(shí)間內(nèi)的變化性，可快速、簡(jiǎn)便地表征一個(gè)樣品的彈性模量。EI 值越大，說(shuō)明發(fā)酵乳樣品的凝膠結(jié)構(gòu)就越強(qiáng)，樣品也就會(huì)越穩(wěn)定[20]。發(fā)酵過(guò)程中彈性因子變化如圖2所示，發(fā)酵乳樣品的彈性因子在最初4.5 h 內(nèi)保持了穩(wěn)定，但FI、SLB 和MVI 值在此期間處于較大程度的波動(dòng)狀態(tài)，因?yàn)槔业鞍讻](méi)有形成凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，樣品表現(xiàn)為高流動(dòng)性的低彈性、低黏度的不穩(wěn)定狀態(tài)[21]。4.5 h 開(kāi)始Probio-M8 組和Probio-M8+PC-01 組EI 出現(xiàn)拐點(diǎn)迅速垂直上升，到達(dá)凝膠點(diǎn)。PC-01 組和對(duì)照組5 h 左右呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，這進(jìn)一步說(shuō)明添加益生菌提前了EI 的變化。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵乳中酪蛋白完全解離并迅速聚集形成凝膠結(jié)構(gòu)，EI 值達(dá)到最大[22]。添加Probio-M8 和Probio-M8+PC-01 組EI 值迅速上升，EI 值變化顯著快于PC-01 組和對(duì)照組，各組EI值迅速達(dá)到最高后略微下降直至發(fā)酵終點(diǎn)，這可能是因?yàn)樾纬刹环€(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。對(duì)照組的EI 值最大，Probio-M8+PC-01 組EI 值最小，這可能是添加益生菌在一定程度上降低了發(fā)酵乳的彈性，與蔡淼等[23]的研究結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中彈性因子（EI）的變化Fig.2 Changes of elasticity index （EI）during fermentation

2.3 黏性因子的檢測(cè)結(jié)果

黏性因子（MVI）反映樣品在微米尺度的黏性特征[24]。黏性因子作為一個(gè)時(shí)間的函數(shù)能直接表示黏性模量，黏性因子可以顯示發(fā)酵乳黏度的變化[18]。發(fā)酵過(guò)程中黏性因子的變化如圖3所示，從發(fā)酵開(kāi)始到4.5 h 左右，各組MVI 值在同一時(shí)期保持在一定水平波動(dòng)，這是因?yàn)槟z網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)沒(méi)有形成，為低黏度的初始停滯階段[25]。Probio-M8組和Probio-M8+PC-01 組在4.5 h 后，樣品MVI呈迅速上升趨勢(shì)，這可能是酪蛋白膠粒開(kāi)始逐漸的解離，乳液中凝膠逐漸開(kāi)始形成，因此發(fā)酵乳進(jìn)入了黏度快速變化的階段，隨后各組發(fā)酵乳樣品的黏性因子快速的增加到最大，進(jìn)入了高黏度階段[26]；PC-01 組和對(duì)照組在5 h 左右出現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。Probio-M8 組、PC-01 組和Probio-M8+PC-01組產(chǎn)黏速度相對(duì)更快，說(shuō)明添加益生菌可以加快產(chǎn)黏速度。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成后各組最終形成了穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，發(fā)酵乳樣品的黏稠度無(wú)明顯差異。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中黏性因子（MVI）的變化Fig.3 Changes of macroscopic viscosity index （MVI）during fermentation

2.4 流動(dòng)因子的檢測(cè)結(jié)果

流動(dòng)因子（FI）的變化能反映發(fā)酵乳樣品中微觀粒子運(yùn)動(dòng)的快慢，高流動(dòng)因子（約10 Hz）表明此時(shí)樣品為液態(tài)性質(zhì)，低流動(dòng)因子（約10-2Hz）表明樣品為固態(tài)性質(zhì)，F(xiàn)I 值越大則粒子運(yùn)動(dòng)越快，流動(dòng)性越強(qiáng)[27]。發(fā)酵過(guò)程中流動(dòng)因子的變化由圖4可知，從發(fā)酵開(kāi)始到4.5 h，各組FI 值處于波動(dòng)狀態(tài)屬于液態(tài)性質(zhì)，4.5 h 后Probio-M8 組和Probio-M8+PC-01 組出現(xiàn)拐點(diǎn)，F(xiàn)I 值由102Hz 直線下降至10-1Hz 后平緩下降，達(dá)到10-2Hz 后基本保持不變，樣品具有較高的黏性液體性質(zhì)，PC-01 組和對(duì)照組在5 h 后也出現(xiàn)相同的趨勢(shì)。到發(fā)酵終點(diǎn)，對(duì)照組的FI 最低，與MVI 結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中流動(dòng)因子（FI）的變化Fig.4 Changes of fluidity index （FI）during fermentation

2.5 活菌數(shù)的變化

發(fā)酵過(guò)程及貯藏期間活菌數(shù)的變化由表2所示，發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵中的活菌數(shù)均呈上升趨勢(shì)（P<0.05），在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)Probio-M8 組活菌數(shù)達(dá)到（7.89±0.01）lg （CFU/mL），PC-01 組副干酪乳桿菌PC-01 的活菌數(shù)達(dá)到 （7.28±0.01）lg（CFU/mL）；Probio-M8+PC-01 組兩種益生菌的活菌數(shù)與Probio-M8 組和PC-01 組的活菌數(shù)差異不顯著。在貯藏1～14 d 時(shí)，Probio-M8 的活菌基本保持不變，14 d 后呈下降趨勢(shì)（P<0.05），在貯藏28 d 時(shí)活菌數(shù)達(dá)到（7.34±0.05）lg（CFU/mL）；值得關(guān)注的是：PC-01 在貯藏1～28 d 中活菌數(shù)在持續(xù)上升（P<0.05），在貯藏28 d 時(shí)活菌數(shù)達(dá)到 （7.75±0.02）lg（CFU/mL），PC-01 的活菌數(shù)顯著高于Probio-M8，這可能是因?yàn)镻C-01 具有更好的耐酸特性，在貯藏過(guò)程中副干酪乳桿菌PC-01 保持更好的活力。本試驗(yàn)證明應(yīng)用乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 在發(fā)酵乳中保持益生菌活力的穩(wěn)定性，可以充分保證益生功效的發(fā)揮。

表2 發(fā)酵及貯藏過(guò)程中發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化Table 2 During storage and fermentation viable count changes of fermented milk

2.6 酸度的變化

pH 值和滴定酸度影響益生菌在發(fā)酵及貯藏過(guò)程中的生存能力，影響發(fā)酵乳制品的質(zhì)量，產(chǎn)酸是酸奶發(fā)酵劑的主要功能[28]。由圖5所示，pH 值在發(fā)酵期間各組均呈快速下降的趨勢(shì) （P<0.05）。在發(fā)酵初期（0～2 h），生長(zhǎng)速度緩慢，酸度變化不大。發(fā)酵2 h 后，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增長(zhǎng)速度加快，酸度變化明顯，由于乳酸菌代謝乳糖，產(chǎn)生大量乳酸，促進(jìn)pH 值加速下降[29]。各組達(dá)到發(fā)酵乳發(fā)酵終點(diǎn)pH 4.5 所用的時(shí)間，由快到慢分別是Probio-M8 組和Probio-M8+PC-01 組（7.5 h）、PC-01 組（8 h）和對(duì)照組（8.5 h），在貯藏期間按各組pH 值在4.2～4.3 之間，變化不明顯；在發(fā)酵過(guò)程中TA 迅速上升（P<0.05），發(fā)酵終點(diǎn)滴定酸度平均值為85.25 °T，發(fā)酵酸度適中。在4 ℃貯藏期間，TA稍有下降，但變化幅度小，最終穩(wěn)定在100°T 以?xún)?nèi)。研究表明，添加益生菌株縮短發(fā)酵時(shí)間、產(chǎn)酸速率變快，貯藏期間添加益生菌發(fā)酵乳的pH 值和滴定酸度沒(méi)有顯著變化，未增加后酸，說(shuō)明益生菌適宜在發(fā)酵乳中生產(chǎn)應(yīng)用。

圖5 發(fā)酵及貯藏過(guò)程中發(fā)酵乳酸度的變化Fig.5 Acidity changes of fermented milk during fermentation and storage

2.7 黏度的變化

發(fā)酵乳是不可逆的凝膠，黏度是反映發(fā)酵乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，適當(dāng)?shù)酿ざ饶軌虍a(chǎn)生良好的感官品質(zhì)[30]。貯藏過(guò)程中發(fā)酵乳黏度的變化如圖6所示，在貯藏期間，加益生菌組的黏度均高于對(duì)照組（P<0.05），隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，黏度首先上升后下降。Probio-M8 組在貯藏期間黏度明顯高于其它3 組，貯藏7 d 時(shí)黏度最大，最大黏度為1 140 mPa·s，在貯藏28 d 時(shí)黏度為1 000 mPa·s。添加Probio-M8 和PC-01 可顯著提高貯藏過(guò)程中發(fā)酵乳的黏度，從而改善產(chǎn)品品質(zhì)。

圖6 貯藏期間發(fā)酵乳黏度的變化Fig.6 Viscosity changes of fermented milk during storage

2.8 持水性的變化

貯藏期間發(fā)酵乳持水性的變化如圖7所示，發(fā)酵乳持水性的強(qiáng)弱與發(fā)酵乳的組織狀態(tài)有關(guān)，持水能力強(qiáng)，則發(fā)酵乳的組織狀態(tài)好，可以防止乳清析出。貯藏期間，添加益生菌的發(fā)酵乳持水性顯著升高（P<0.05），Probio-M8 組最高，平均持水性為54.5%±0.58%。研究表明添加益生菌Probio-M8和PC-01 有利于發(fā)酵乳產(chǎn)品凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有利于提高產(chǎn)品品質(zhì)。

圖7 貯藏期間發(fā)酵乳持水性的變化Fig.7 Water capacity of fermented milk during storage

3 結(jié)論

本文通過(guò)分析益生菌乳雙歧桿菌Probio-M8和/或副干酪乳桿菌PC-01 發(fā)酵乳在發(fā)酵及貯藏過(guò)程中的微流變特性、酸度、持水力、pH 值、活菌數(shù)和黏度的變化。研究表明添加乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 均可加快發(fā)酵乳的凝乳速度，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間。添加益生菌后發(fā)酵乳凝膠具有較高的固液平衡值和較低的彈性因子，對(duì)微觀黏度因子和流動(dòng)因子沒(méi)有影響。乳雙歧桿菌Probio-M8 和/或副干酪乳桿菌PC-01 在貯藏28 d 時(shí)的活菌數(shù)均大于107CFU/mL，具有良好穩(wěn)定性。貯藏期間添加益生菌的發(fā)酵乳pH 值和滴定酸度沒(méi)有顯著變化，但黏度和持水性顯著升高。因此，乳雙歧桿菌Probio-M8 和副干酪乳桿菌PC-01 應(yīng)用于發(fā)酵乳加工中具有良好的應(yīng)用前景。