Raf—1、MEK—2、ERK—1在胃癌組織中的表達(dá)及其意義

姜浩+孫治國

[摘要] 目的 探討Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中的表達(dá)形式及其意義，并分析此種信號途徑與胃癌的臨床病理特征之間是否存在聯(lián)系，并為胃癌抗EGFR靶向治療的分子標(biāo)志物篩選提供依據(jù)。 方法 通過免疫組化中SP法檢測60例胃癌患者標(biāo)本胃癌組織和正常的胃組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)水平并進(jìn)行比對。 結(jié)果 經(jīng)統(tǒng)計60例胃癌組織當(dāng)中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)率分別為88.33%（53/60）、85.00%（51/60）、78.33%（47/60）。而正常的胃組織當(dāng)中Raf-1、MEK-2、ERK-1均未見到陽性表達(dá)。被胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的陽性表達(dá)率更為顯著，分別高達(dá)95.12 %（39/41），90.24 %（37/41），87.80 %（36/41）。未見癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中Raf-1、MEK-2、ERK-1均無表達(dá)。實驗證實Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)水平與胃癌的臨床特征中的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有明顯相關(guān)性（P<0.05）。 結(jié)論 （1）人體胃癌組織當(dāng)中存在Raf/MEK/ERK信號通路的激活；（2）人體胃癌組織中Raf/MEK/ERK信號通路的活化程度與胃癌組織的臨床病理特征相關(guān)，此信號通路活化程度越高的胃癌組織，其分化的程度越低，TNM分期越高。三者聯(lián)合檢測可為研究胃癌的生物學(xué)行為乃至對靶向治療胃癌提供十分重要的參考依據(jù)及指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；Raf-1；MEK-2；ERK-1；Raf/MEK/ERK；免疫組化

[中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）15-0030-04

[Abstract] Objective To investigate the expression pattern and significance of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in gastric carcinoma and analyze whether there is a link between this signaling pathway and the clinicopathological features of gastric cancer，and to provide the basis for the screening of molecular markers for gastric cancer anti-EGFR targeted therapy. Methods The expression levels of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in gastric cancer tissues and normal gastric tissueswere detected by SP immunohistochemical method and compared in 60 patientswith gastric cancer. Results The expression rates of Raf-1， MEK-2 and ERK-1were 68.33% （53/60）， 85.00% （51/60） and 78.33% （47/60） respectively in 60 cases of gastric cancer. However， the positive expressions of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were not observed in normal gastric tissues. The positive expression rates of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 in lymph node metastasis of gastric cancer cells were 95.12%（39/41）， 90.24%（37/41）， 87.80%（36/41）， which were significantly higher. Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were not expressed in lymph nodes without lymph node metastasis. The expression levels of Raf-1， MEK-2 and ERK-1 were significantly correlated with the degree of tumor differentiation， depth of invasion，lymph node metastasis and TNM staging in the clinical features of gastric cancer（P<0.05）. Conclusion （1） The activation of Raf/MEK/ERK signaling pathway is existed in human gastric cancer tissues； （2）The activation degree of Raf/MEK/ERK signaling pathway in human gastriccancer tissue is related to clinicopathological features of gastric cancer tissue. The higher the degree of activation of this signal pathway in gastric cancer tissues， the lower the degree of differentiation， and the higher the TNM staging. The combined detection of the three can provide a very important reference and indicator for the study of the biological behavior and the targeted treatment of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer； Raf-1； MEK-2； ERK-1； Raf/MEK/ERK； Immunohistochemistry

胃癌是最常見的惡性腫瘤，目前死亡率很高，居世界第三位[1]。全世界范圍內(nèi)胃癌預(yù)后欠佳，其原因是發(fā)現(xiàn)病灶較晚，以致晚期胃癌比例較大。而且晚期胃癌對所有傳統(tǒng)治療效果均欠佳，包括化學(xué)治療、手術(shù)切除、以及放化療聯(lián)合等[2]。近些年，以肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌為代表的實體腫瘤，已經(jīng)進(jìn)入分子靶向治療的新時代。目前，探索和研究胃癌的分子靶向治療有很大發(fā)展前景。其中EGFR（表皮生長因子受體）是目前研究的主要靶點(diǎn)之一，它與腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管形成有關(guān)[3]，但直至目前，世界范圍內(nèi)還沒有公認(rèn)的預(yù)測胃癌抗EGFR靶向治療的分子標(biāo)志物[4]，Raf/MEK/ERK信號通路是目前已經(jīng)明確的EGFR調(diào)節(jié)通路中十分重要的一個，在胃癌組織的代謝、增殖、生長、分化、凋亡過程中起到重要的作用。國內(nèi)外對Raf/MEK/ERK信號通路的研究和報道很少，本文通過研究Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中的表達(dá)情況，以此判斷胃癌的生物學(xué)特性，為尋找胃癌中抗EGFR靶向治療的腫瘤分子標(biāo)記物進(jìn)行初步探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取我院2012年1月～2014年12月行胃癌手術(shù)的患者60例，男45例，女15例，年齡31～78歲，中位年齡55歲。所有患者均為首次手術(shù)，且手術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療，臨床和病理資料均完整。

1.2 試劑

第一抗體為濃縮型兔抗人多克隆抗體Raf-1、MEK-2、ERK-1，工作濃度1∶400（美國GeneTex生物技術(shù)公司）。第二抗體為即用型生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

60例胃癌標(biāo)本分為癌組織、正常胃組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)共四組，其中正常胃組織60例、胃癌組織60例、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)41例、未見癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)19例。每組實驗標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林浸泡固定，后以石蠟包埋，分別制成4 μm厚切片5張，其中一張標(biāo)本行常規(guī)HE染色，供組織學(xué)觀察并且行病理診斷和分型，另外一張采用PBS法取代第一抗體行免疫組化染色作為陰性對照片，陽性對照采用已知陽性片為標(biāo)準(zhǔn)，剩余3張按抗體試劑說明書染色，步驟采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。

1.4 結(jié)果判斷[5]

由兩位資深病理科醫(yī)師分別觀察每張標(biāo)本切片后進(jìn)行綜合分析判斷。光學(xué)顯微鏡下觀察，首先根據(jù)細(xì)胞的染色程度進(jìn)行計分，細(xì)胞無顯色計0分；淺黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。再在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野，記錄其中陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，取其平均值，根據(jù)陽性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比值記分：0：0分；≤25%：1分；26%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%：4分。標(biāo)本細(xì)胞的染色程度記分與陽性細(xì)胞比例計分的和為每例標(biāo)本的最終積分。0分陰性（-），2～3分弱陽性（+），4～5分中度陽性（++），6～7分強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)采用精確概率檢驗、χ2檢驗與Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及正常的胃組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)

Raf-1、MEK-2、ERK-1染色主要都位于細(xì)胞漿中，呈現(xiàn)出淺黃色、棕黃色及棕褐色的著色，以團(tuán)簇狀或散在進(jìn)行分布，（見封三圖4分別為A、B、C），60例胃癌組織標(biāo)本中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)均呈陽性，表達(dá)率分別為88.33%（53/60）、85.00%（51/60）、78.33%（47/60），而正常的胃組織中三種蛋白均無表達(dá)。

2.2 淋巴結(jié)中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)

Raf-1、MEK-2、ERK-1染色位同樣位于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細(xì)胞的細(xì)胞漿中，呈現(xiàn)出淡黃色至棕黃色及棕褐色的著色，以團(tuán)簇狀或散在進(jìn)行分布，（見封三圖4分別為D、E、F），癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1的陽性表達(dá)率分別為95.12%（39/41），90.24%（37/41），87.80%（36/41），無癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中均未表達(dá)。

2.3 Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

見表1。

2.4 Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)

60例胃癌患者中，男45例，Raf-1陽性表達(dá)40例，陰性表達(dá)5例，Mek-2陽性表達(dá)38例，陰性表達(dá)7例，Eek-1陽性表達(dá)36例，陰性表達(dá)9例。女性15例，Raf-1陽性表達(dá)13例，陰性表達(dá)2例，Mek-2陽性表達(dá)13例，陰性表達(dá)2例，Eek-1陽性表達(dá)11例，陰性表達(dá)4例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。年齡>55歲的37例，Raf-1陽性表達(dá)32例，陰性表達(dá)5例，Mek-2陽性表達(dá)32例，陰性表達(dá)5例，Eek-1陽性表達(dá)29例，陰性表達(dá)8例。年齡≤55歲的23例，Raf-1陽性表達(dá)21例，陰性表達(dá)2例，Mek-2陽性表達(dá)19例，陰性表達(dá)4例，Eek-1陽性表達(dá)18例，陰性表達(dá)5例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。腫瘤位于胃底/賁門的16例，Raf-1陽性表達(dá)14例，陰性表達(dá)2例，Mek-2陽性表達(dá)13例，陰性表達(dá)3例，Eek-1陽性表達(dá)12例，陰性表達(dá)4例。腫瘤位于胃竇/胃體的44例，Raf-1陽性表達(dá)39例，陰性表達(dá)5例，Mek-2陽性表達(dá)38例，陰性表達(dá)6例，Eek-1陽性表達(dá)35例，陰性表達(dá)9例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。60例癌組織中，Raf-1陽性表達(dá)53例，陰性表達(dá)7例，Mek-2陽性表達(dá)51例，陰性表達(dá)9例，Eek-1陽性表達(dá)47例，陰性表達(dá)13例，60例正常胃組織中，Raf-1、Mek-2、Eek-1均未表達(dá)，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。中分化34例，Raf-1陽性表達(dá)28例，陰性表達(dá)6例，Mek-2陽性表達(dá)26例，陰性表達(dá)8例，Eek-1陽性表達(dá)23例，陰性表達(dá)11例。低分化26例，Raf-1陽性表達(dá)24例，陰性表達(dá)2例，Mek-2陽性表達(dá)22例，陰性表達(dá)4例，Eek-1陽性表達(dá)21例，陰性表達(dá)5例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。腫瘤浸潤深度T1/T2期27例，Raf-1陽性表達(dá)21例，陰性表達(dá)6例，Mek-2陽性表達(dá)20例，陰性表達(dá)7例，Eek-1陽性表達(dá)18例，陰性表達(dá)9例。腫瘤浸潤深度T3/T4期33例，Raf-1陽性表達(dá)32例，陰性表達(dá)1例，Mek-2陽性表達(dá)31例，陰性表達(dá)2例，Eek-1陽性表達(dá)29例，陰性表達(dá)4例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。TNM分期I+II 21例，Raf-1陽性表達(dá)16例，陰性表達(dá)5例，Mek-2陽性表達(dá)14例，陰性表達(dá)7例，Eek-1陽性表達(dá)12例，陰性表達(dá)9例。TNM分期Ⅲ+Ⅳ39例，Raf-1陽性表達(dá)37例，陰性表達(dá)2例，Mek-2陽性表達(dá)35例，陰性表達(dá)4例，Eek-1陽性表達(dá)33例，陰性表達(dá)6例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，Raf-1陽性表達(dá)39例，陰性表達(dá)2例，Mek-2陽性表達(dá)37例，陰性表達(dá)4例，Eek-1陽性表達(dá)34例，陰性表達(dá)7例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，Raf-1、Mek-2、Eek-1均未表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

Raf/MEK/ERK是我們已經(jīng)知道的EGFR最重要的調(diào)節(jié)傳導(dǎo)通路之一[6-10]。Raf/MEK/ERK通路可以通過磷酸化的活化方式將多種細(xì)胞外信號逐級傳遞至細(xì)胞核，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化、生長抑制乃至細(xì)胞凋亡中都起著尤為重要的調(diào)控作用[11]。本實驗采用免疫組織化學(xué)SP法檢測60例胃癌患者標(biāo)本中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表達(dá)水平，實驗結(jié)果表明Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于正常胃組織，并且三者之間的陽性表達(dá)趨勢完全一致，呈正相關(guān)性，充分證明了Raf/MEK/ERK信號通路在人體胃癌組織中被激活，并且提示它們在誘導(dǎo)人體胃癌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，及在促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移過程中存在承擔(dān)信號傳導(dǎo)的協(xié)同作用，其具體聯(lián)系機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

在被胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1明顯升高，而未被胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中無表達(dá)。Tan等[12]對人和倉鼠的胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞島狀集落解離時，胰腺癌細(xì)胞中ERK蛋白的表達(dá)也明顯升高，所以推斷MEK/ERK信號通路可能起到誘發(fā)人或倉鼠胰腺癌細(xì)胞解離、促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Viala等[13]則認(rèn)為激活后的ERK信號通路能起到增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Raf-1、MEK-2、ERK-1的陽性表達(dá)與人體胃癌細(xì)胞的分化程度、浸潤深度及TNM分期都顯著相關(guān)（P<0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤生長部位尚無相關(guān)性（P>0.05）。在侵及胃漿膜層的胃細(xì)胞癌中，Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達(dá)率要明顯高于未侵及胃漿膜層者（P<0.05），病理分型為低分化的人胃癌組織細(xì)胞中Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達(dá)率高于分型為中分化的人胃癌組織（P<0.05），臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的人胃癌組織中Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達(dá)率均高于Ⅰ期和Ⅱ期（P<0.05），研究證明人胃癌組織細(xì)胞中Raf/MEK/ERK信號通路的活化程度與人體胃癌組織的臨床及病理特征存在關(guān)聯(lián)，Raf-1、MEK-2、ERK-1陽性表達(dá)率越高的胃癌組織分化程度越低，其侵襲性越大，引起淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向越高，TNM分期也越高，足以證明被激活的Raf/MEK/ERK信號通路參與人體胃癌組織的浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而隨著腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)和病情的進(jìn)展，Raf-1、MEK-2、ERK-1表達(dá)也增強(qiáng)，這與Meng等[14]關(guān)于Raf-1在人體胃癌組織細(xì)胞中導(dǎo)致腫瘤分化、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移的研究結(jié)果相一致。James等[15]研究發(fā)現(xiàn)ERK阻斷劑PD98059抑制ERK活化后，細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化明顯抑制，針對性的抑制Raf/MEK/ERK傳導(dǎo)通路的活化將有助于抑制腫瘤細(xì)胞的異常表達(dá)，達(dá)到及早控制腫瘤的目的，進(jìn)一步輔助胃癌的早期治療。

同時我們還發(fā)現(xiàn)，Raf-1、MEK-2、ERK-1三者在胃癌組織中高表達(dá)的同時，其陽性表達(dá)率有逐步衰減趨勢，可能在EGFR/Raf/MEK/ERK傳導(dǎo)通路中有其他因素發(fā)揮抑制其表達(dá)的作用，Steelman等[16]研究證明抗白血病治療時，通過藥物抑制劑作用于Raf/MEK/ERK傳導(dǎo)通路中作用點(diǎn)之間通路，可以有效地控制這一途徑表達(dá)，提高白血病療效。我們下一步研究計劃準(zhǔn)備尋找這些因素，并將其抑制作用擴(kuò)大，有針對性地抑制Raf/MEK/ERK信號通路的傳導(dǎo)，阻止或延緩腫瘤的發(fā)生，針對胃癌抗EGFR的靶向治療研究正逐步興起，對Raf/MEK/ERK信號通路進(jìn)行探索，這些因素極有可能為胃癌抗EGFR靶向治療的分子標(biāo)志物篩選提供依據(jù)，也可能成為治療胃癌的新靶點(diǎn)。

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