AQP3在上皮型卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥中的作用

潘潔雪+葉龍?jiān)?/p>

[摘要] 目的 探索上皮型卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥的機(jī)制，為提高卵巢癌患者化療效果提供前期基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用CCK8方法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞對(duì)卡鉑的IC50濃度，用Western blot方法檢測(cè)卡鉑處理后細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）蛋白E-Cadherin和Vimentin表達(dá)情況，使用siRNA敲降A(chǔ)QP3后再觀察卡鉑對(duì)其作用。 結(jié)果 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3與A2780的卡鉑IC50分別為2.814 μg/mL與1.516 μg/mL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)卡鉑能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，基因芯片結(jié)果顯示水通道蛋白AQP3顯著上調(diào)，進(jìn)一步敲降A(chǔ)QP3基因后，能顯著減弱卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生EMT的效果。 結(jié)論 AQP3在卵巢癌細(xì)胞卡鉑耐藥機(jī)制中具有重要作用，降低AQP3的表達(dá)可以減弱卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的效果。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌；卡鉑；上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變；水通道蛋白

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）15-0027-03

[Abstract] Objective To discuss the mechanism of carboplatin resistance in epithelial ovarian cancer cells and to provide basis for improvement of chemotherapy effect in patients with ovarian cancer. Methods The IC50 concentration of ovarian cancer cells towards carboplatin was detected by CCK8， the expression of EMT proteins E-Cadherin and Vimentin after management of carboplatin was detected by Western blot， and the effect of carboplatin was observed again after AQP3 was knocked down by siRNA. Results The carboplatin IC50 was 2.814 μg/mL in SKOV3 ovarian cancer cell line and 1.516 μg/mL in A2780 line. Carboplatin could induce EMT in ovarian cancer cells. As to the result of gene chip， AQP3 was significantly up-regulated. When AQP3 gene was knocked down， EMT effect induced by carboplatin in ovarian cancer cells could be significantly reduced. Conclusion AQP3 has significant effect in the mechanisom of carboplatin resistance in ovarian cancer cells and reduction of the expression of AQP3 can reduce the EMT effect in ovarain cancer cells.

[Key words] Ovarian cancer； Carboplatin； Epithelial-mesenchymal transition； AQP

上皮型卵巢癌是女性生殖器最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，盡管近年來(lái)對(duì)卵巢癌的治療，包括手術(shù)、放化療及靶向治療已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但卵巢癌患者預(yù)后仍較差，其中化療耐藥導(dǎo)致卵巢癌患者化療效果差、早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是重要因素之一[2]?；熢诼殉舶┗颊咝g(shù)后綜合治療中有著舉足輕重的地位，鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療方案是卵巢癌患者的一線治療方案，但是大多數(shù)患者在經(jīng)歷了幾個(gè)治療療程后會(huì)產(chǎn)生耐藥，尤其是對(duì)常用的化療藥卡鉑耐藥[3]。因而為了進(jìn)一步提高卵巢癌患者根治術(shù)后的生存率，提高現(xiàn)有化療藥物的療效是治療關(guān)鍵。但對(duì)卡鉑化療耐藥更深入的機(jī)制仍不清楚，具有局限性，因而進(jìn)一步研究卵巢癌內(nèi)在調(diào)控化療耐藥的分子信號(hào)途徑，尋找新的化療藥物，逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有的化療耐藥現(xiàn)狀為我們制定新的卵巢癌治療方針提供了重要思路。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）廣泛參與人體細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)，在細(xì)胞膜上廣泛分布，在哺乳動(dòng)物中總共有13種AQP（AQP 0～12）[4]，而其中，AQP3被認(rèn)為可以使細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)[5]，但是在卵巢癌中的研究尚屬空白，基于此，本文觀察AQP蛋白在卵巢癌中的作用，為進(jìn)一步解決卡鉑耐藥奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株A2780和SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究院。使用RPMI-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清濃度為10%、1%青霉素/鏈霉素，均來(lái)自Gibco公司。細(xì)胞在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

采用Dojindo公司CCK8試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞的活性。將細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板后，待細(xì)胞貼壁，分別加入指定的卡鉑濃度，并培養(yǎng)48 h，加入CCK8試劑，并于490 nm處測(cè)OD值。

1.3 Real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞AQP3的表達(dá)

分別提取對(duì)照組與卡鉑組卵巢癌細(xì)胞的RNA，采用SYBR Premix Ex Taq Kit （TAKARA公司）進(jìn)行Real-time PCR 檢測(cè)AQP3的表達(dá)，將目的基因與內(nèi)參基因的CT值比較（△CT）后，再將卡鉑組與對(duì)照組比較（△△CT）。

1.4 Western blot檢測(cè)E-Cadherin、Vimentin、AQP3蛋白水平

RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后使用濕轉(zhuǎn)法，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜。之后封閉洗過(guò)，用E-Cadherin（CST，1∶1000）、Vimentin （CST，1∶1000）、AQP3（Abcam，1∶500）與GAPDH（CST，1∶2000）等一抗4℃過(guò)夜。取出膜，使用TBST液洗滌，再使用相應(yīng)的二抗4℃孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)印跡。使用Quantity One軟件進(jìn)行條帶灰度定量。

1.5基因芯片

將細(xì)胞提取RNA送上?？党缮锕?，使用Agilent表達(dá)譜基因芯片進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算和分析使用Graph Pad Prism 6軟件，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細(xì)胞系在卡鉑作用下發(fā)生EMT

首先檢測(cè)在SKOV3與A2780兩個(gè)卵巢癌細(xì)胞系中卡鉑的IC50，分別為2.814 μg/mL與1.516 μg/mL（封三圖1A），發(fā)現(xiàn)卡鉑細(xì)胞顯著誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系EMT，其E-Cadherin蛋白顯著下調(diào)，而Vimentin蛋白顯著上調(diào)（封三圖1B與封三圖1C），灰度定量提示其具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此認(rèn)為卡鉑具有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系發(fā)生EMT的能力。

2.2 水通道蛋白在卡鉑誘導(dǎo)的EMT中的作用

進(jìn)一步探索水通道蛋白AQP在卡鉑作用下卵巢癌細(xì)胞系中的作用，使用基因芯片篩查水通道蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)在水通道蛋白里，AQP 1、6、10、12a基本不變，而AQP 2、9、11表達(dá)稍有降低，而AQP 3、4、5、7、8表達(dá)上調(diào)，在這其中AQP3顯著上調(diào)（封三圖2A）。進(jìn)一步使用Western blot在蛋白水平確定了AQP3在卡鉑作用下的上調(diào)趨勢(shì)（封三圖2）。

2.3 敲降A(chǔ)QP3能抑制卡鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞系的EMT作用

進(jìn)一步使用AQP3 siRNA敲降A(chǔ)QP3在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，并與卡鉑聯(lián)合作用，發(fā)現(xiàn)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系形成EMT的作用被AQP3 siRNA明顯削弱，卡鉑不能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系的EMT表型產(chǎn)生，干擾AQP3后，Vimentin表達(dá)較卡鉑作用顯著下降，E-Cadherin則顯著上調(diào)（封三圖3A與封三圖3B）。因此推斷，卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系形成EMT的作用有可能是通過(guò)AQP3這條通路。

3討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康，其在全球女性患者的死亡原因中占第七位[6]。據(jù)報(bào)道，卵巢癌在美國(guó)將近有22 280例的新發(fā)病例，以及14 240例的死亡人數(shù)[6]，而我國(guó)卵巢癌患者的發(fā)生率以及死亡率也顯著上調(diào)，其死亡率達(dá)到3.31/10萬(wàn)[7]。卵巢癌患者術(shù)后化療的一線用藥以卡鉑為基礎(chǔ)，鉑類(lèi)藥物被廣泛用于全身各個(gè)臟器的上皮性惡性腫瘤中，包括膀胱癌、睪丸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等[8]。卵巢癌患者化療耐藥導(dǎo)致的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與其預(yù)后較差相關(guān)，因此卵巢癌患者耐藥問(wèn)題亟待解決。

鉑類(lèi)化療藥物耐藥涉及多種機(jī)制，包括DNA修復(fù)系統(tǒng)異常、機(jī)體對(duì)鉑類(lèi)-DNA復(fù)合物的耐藥性增強(qiáng)、腫瘤血流異常、鉑類(lèi)藥物攝取降低和排出增快、抗凋亡因子上調(diào)、腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變，以及多種耐藥相關(guān)蛋白上調(diào)等，而在這其中EMT轉(zhuǎn)變被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞鉑類(lèi)耐藥過(guò)程中占有重要作用[9-11]。EMT在乳腺癌、肺癌、腸癌與胰腺癌等腫瘤耐藥中起重要作用[12-15]。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞特點(diǎn)而轉(zhuǎn)向間質(zhì)性細(xì)胞，進(jìn)而具有更強(qiáng)的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，而且具有更強(qiáng)的耐藥特性，而其機(jī)制尚未明確。本文發(fā)現(xiàn)卡鉑在處理卵巢癌細(xì)胞后發(fā)生明顯的EMT轉(zhuǎn)變，E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）廣泛分布在機(jī)體的細(xì)胞膜上，在哺乳動(dòng)物中總共有13種水通道蛋白（AQP 0～12）[4，16]。AQP3在人體中廣泛分布于腎集合管、上皮組織、結(jié)膜與乳腺中。據(jù)報(bào)道AQP3蛋白可以通過(guò)對(duì)水與甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)從而形成細(xì)胞偽足，促進(jìn)細(xì)胞侵襲[17-19]，AQP3缺陷的老鼠可表現(xiàn)為尿液濃縮功能障礙、皮膚愈合功能障礙以及消化道功能異常。而AQP3的功能異常高表達(dá)，則有可能促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展[20]。本文從水通道蛋白（AQPs）入手，廣泛篩查AQP蛋白在卡鉑作用下的耐藥特點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)AQP3在卡鉑誘導(dǎo)EMT的過(guò)程中起重要作用，并且我們進(jìn)一步敲降A(chǔ)QP3，發(fā)現(xiàn)能逆轉(zhuǎn)卡鉑引起的EMT過(guò)程。

綜上，我們認(rèn)為卡鉑可能是通過(guò)AQP3這條通路引起卵巢癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而引起卵巢癌細(xì)胞耐藥，提示AQP3可以作為卵巢癌患者接受卡鉑治療后的預(yù)后指標(biāo)。這些結(jié)果可能揭示了一個(gè)解決卵巢癌細(xì)胞耐藥的新通路，為進(jìn)一步解決這個(gè)問(wèn)題打下了基礎(chǔ)，當(dāng)然需要更進(jìn)一步的研究揭示AQP3與EMT相關(guān)蛋白間具體如何作用。

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