合成生物學(xué)的里程碑：釀酒酵母基因組合成

段艷芳 (本刊記者)

科學(xué)聚焦

合成生物學(xué)的里程碑：釀酒酵母基因組合成

段艷芳 (本刊記者)

每一個(gè)物種都擁有一套獨(dú)一無(wú)二的遺傳信息，哪怕是結(jié)構(gòu)和功能最簡(jiǎn)單的生命體，想要在實(shí)驗(yàn)室里“創(chuàng)造”出來(lái)，也曾經(jīng)被認(rèn)為幾乎是不可能的。盡管如此，科學(xué)家從未停止對(duì)生命奧秘的探索。近年來(lái)，以“通過(guò)創(chuàng)造來(lái)理解”為核心理念的合成生物學(xué)快速興起，其中一個(gè)方向即通過(guò)大規(guī)模的工程化設(shè)計(jì)和遺傳操作，將人工合成的DNA序列組合拼接在一起，組裝成有功能的基因組，從而創(chuàng)造全新的生命體[1]。

釀酒酵母基因組合成計(jì)劃(Sc2.0計(jì)劃)是目前正在進(jìn)行中的首個(gè)真核生物基因組全合成計(jì)劃，旨在重新設(shè)計(jì)并完整地合成釀酒酵母的16條染色體，并將其作為系統(tǒng)地研究真核生物染色體結(jié)構(gòu)與功能的平臺(tái)。該計(jì)劃被稱為Sc2.0計(jì)劃，以區(qū)別于野生型酵母，其中“Sc”是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的簡(jiǎn)寫。2017年3月，美國(guó)《科學(xué)》雜志以?？男问綀?bào)道了該項(xiàng)目的最新進(jìn)展：新合成5條完整的酵母染色體(synII、synV、synVI、synX、synXII)和一條完成一半的染色體(synIXR)，合成任務(wù)已完成1/3，從而將“Sc2.0計(jì)劃”向前推進(jìn)了一大步。

1 Sc2.0計(jì)劃：國(guó)際合作的大科學(xué)計(jì)劃

Sc2.0計(jì)劃是繼人類基因組計(jì)劃后基因組學(xué)方面的另一項(xiàng)國(guó)際合作的大科學(xué)計(jì)劃，也是人類首次嘗試改造并從頭合成真核生物的計(jì)劃。該計(jì)劃由紐約大學(xué)朗格尼醫(yī)學(xué)中心的酵母遺傳學(xué)家杰夫?伯克(Jef Boeke)發(fā)起，來(lái)自美國(guó)、中國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、澳大利亞、新加坡等多國(guó)研究機(jī)構(gòu)的200多位科學(xué)家共同參與并分工協(xié)作。

釀酒酵母是一種單細(xì)胞真核生物，也是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室最常用的實(shí)驗(yàn)材料和生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的模式生物之一。作為首個(gè)完成測(cè)序的真核生物，早在1996年，包含16條染色體、約1 200萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)、約6 000個(gè)基因的釀酒酵母基因組序列就已全部測(cè)序完成，為人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施奠定了基礎(chǔ)。2014年，在歷經(jīng)長(zhǎng)達(dá)7年的研究后，Sc2.0計(jì)劃研究團(tuán)隊(duì)成功地合成了第一條能正常行使功能的釀酒酵母3號(hào)染色體(synIII)，標(biāo)志著構(gòu)建完整的真核生物基因組的歷史階段已經(jīng)開(kāi)啟。

2017年3月，酵母基因組的重新設(shè)計(jì)工作已經(jīng)全部完成，染色體合成和組裝任務(wù)完成1/3。圖1列出了Sc2.0計(jì)劃的任務(wù)分配和完成進(jìn)度，全球多家研究機(jī)構(gòu)共同參與了該研究計(jì)劃。根據(jù)計(jì)劃，研究團(tuán)隊(duì)將在2017年年內(nèi)完成酵母全部染色體的合成任務(wù)。

2 Sc2.0計(jì)劃：中國(guó)科學(xué)家由“跟跑”到“并跑”

值得關(guān)注的是，在“Sc2.0計(jì)劃”這項(xiàng)國(guó)際合作研究中，中國(guó)科學(xué)家發(fā)揮了重要的作用。《科學(xué)》?？袌?bào)道的研究進(jìn)展包括synII、synV、synVI、synX和synXII在內(nèi)的5條完整酵母染色體的人工合成以及synIX染色體右臂(synIXR)的合成，其中中國(guó)科學(xué)家負(fù)責(zé)了大部分研究，即完成4條染色體的合成并且開(kāi)發(fā)了一些新技術(shù)。

天津大學(xué)元英進(jìn)教授帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)完成了5號(hào)(synV)和10號(hào)(synX)染色體的化學(xué)合成。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)共轉(zhuǎn)化策略和CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)了合成過(guò)程中的點(diǎn)突變，使得長(zhǎng)為536 kb的synV合成序列與設(shè)計(jì)序列“完美”地保持一致。在人工合成長(zhǎng)約707 kb的synX過(guò)程中，元英進(jìn)團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了高效的染色體缺陷靶點(diǎn)定位技術(shù)——庫(kù)RCR標(biāo)簽圖譜(PoPM)。該技術(shù)可以鑒定出影響細(xì)胞適應(yīng)度的遺傳突變，并且可以推廣到任何含有水印標(biāo)簽的人工合成基因組。

圖1 Sc2.0計(jì)劃染色體合成的任務(wù)分配[2]。圖中標(biāo)識(shí)出了釀酒酵母染色體(羅馬數(shù)字所示)及其相對(duì)大小(千堿基對(duì))，以及進(jìn)行染色體合成、組裝和調(diào)試的主要研究機(jī)構(gòu)。黑點(diǎn)：染色體著絲粒的位置。藍(lán)色：完成合成；黃色：完成設(shè)計(jì)，正在合成或組裝。I和VIII紐約大學(xué)；II和VII愛(ài)丁堡大學(xué)+華大基因；III和IX約翰·霍普金斯大學(xué)；IV紐約大學(xué)+美國(guó)能源部聯(lián)合基因組研究所；V和X天津大學(xué)；VI約翰·霍普金斯大學(xué)+紐約大學(xué)+金思瑞公司；XI倫敦帝國(guó)理工學(xué)院；XII清華大學(xué)；XIII華大基因；XIV麥考瑞大學(xué)+澳大利亞葡萄酒研究所；XV新加坡國(guó)立大學(xué)；XVI麥考瑞大學(xué)；tRNA新染色體：愛(ài)丁堡大學(xué)

清華大學(xué)戴俊彪研究員帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)完成了目前已合成的最長(zhǎng)的真核線性染色體——全長(zhǎng)為976 kb的12號(hào)染色體(synXII)的設(shè)計(jì)與合成。天然的釀酒酵母16條染色體中，12號(hào)染色體長(zhǎng)度最長(zhǎng)，功能最為特殊，其長(zhǎng)約為2.5 Mb(百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì))，含有一個(gè)約由150個(gè)重復(fù)單元組成的長(zhǎng)約1.5 Mb的核糖體DNA(rDNA)區(qū)域。該區(qū)域形成了細(xì)胞核內(nèi)一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)——核仁，是核糖體形成和組裝的場(chǎng)所。由于synXII太長(zhǎng)，在合成過(guò)程中，研究團(tuán)隊(duì)采取了分級(jí)組裝策略：在6個(gè)菌株中分別完成了對(duì)染色體不同區(qū)域內(nèi)源DNA的逐步替換；然后，利用酵母減數(shù)分裂過(guò)程中同源重組的特性，將多個(gè)菌株中的合成序列進(jìn)行合并，從而獲得完整的人工合成染色體。在synXII的組裝過(guò)程中，rDNA區(qū)域首先被完整地保留下來(lái)，接著在合成染色體上被完全去除，最后在基因組3個(gè)不同的位置上利用修飾過(guò)的rDNA進(jìn)行再生。

深圳華大基因研究院楊煥明院士團(tuán)隊(duì)聯(lián)合英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)團(tuán)隊(duì)完成了長(zhǎng)為770 kb的2號(hào)染色體(synII)的設(shè)計(jì)、合成和鑒定，并對(duì)synII進(jìn)行了深度基因型－表型關(guān)聯(lián)分析。通過(guò)一系列的表型測(cè)試、結(jié)構(gòu)和功能基因組分析發(fā)現(xiàn)，盡管存在細(xì)微差別，包含synII的菌株能夠像天然菌株那樣，表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境的高度適應(yīng)性。

從“人類基因組計(jì)劃”時(shí)承擔(dān)1%的測(cè)序任務(wù)，到在“Sc2.0計(jì)劃”中承擔(dān)重要研究工作，中國(guó)科學(xué)家更深入地參與國(guó)際科技合作。中國(guó)科學(xué)家已經(jīng)由“跟跑”到“并跑”，成為該國(guó)際科技合作項(xiàng)目的研究主力之一。

3 Sc2.0計(jì)劃：從設(shè)計(jì)到組裝

基因組是指一套染色體中完整的DNA序列，既包含編碼基因又包括大量非編碼序列。在漫長(zhǎng)的生物演化過(guò)程之中，作為最終調(diào)控所有生命活動(dòng)的遺傳物質(zhì)，基因組一直處于動(dòng)態(tài)變化中?；蚩赡軙?huì)被刪除、復(fù)制和插入到別的位置，能夠發(fā)生重組和重排，也可能會(huì)因轉(zhuǎn)座子的入侵而喪失功能。這些變化又受制于變幻莫測(cè)的自然選擇，使得基因組在排列組織上并非基于空間上的有效性和經(jīng)濟(jì)性，而是可能基于生物演化歷史中的一系列偶然事件。即便是研究最為深入的酵母，人們對(duì)其基因組的認(rèn)知依然十分有限。

隨著DNA合成與分析技術(shù)的迅猛發(fā)展，合成生物學(xué)正在快速興起，從而為更深刻、更全面地了解生命提供一種全新的思路。Sc2.0計(jì)劃對(duì)酵母這一研究最為透徹的真核生物的基因組藍(lán)圖進(jìn)行重新組織和設(shè)計(jì)，既能深入分析染色體的結(jié)構(gòu)與功能，解答生物學(xué)基本問(wèn)題，同時(shí)也能夠得到在醫(yī)藥、能源、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域有重要應(yīng)用潛力的酵母菌株。

對(duì)釀酒酵母基因組進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，是Sc2.0計(jì)劃開(kāi)始階段的關(guān)鍵所在。野生型釀酒酵母基因組序列是設(shè)計(jì)的起點(diǎn)，通過(guò)BioStudio軟件對(duì)基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。一些通用的設(shè)計(jì)原則主要包括：①刪除重復(fù)序列和絕大部分內(nèi)含子序列；②將TAG終止密碼子置換為TAA終止密碼子；③將轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)基因移動(dòng)至“新染色體”；④在全部染色體上非必需基因的3′末端引入對(duì)稱型loxP位點(diǎn)；⑤引入可與天然DNA進(jìn)行區(qū)分的PCR標(biāo)簽。

這些設(shè)計(jì)，力求在精簡(jiǎn)基因組、保持基因組的正常生理功能和賦予基因組一定的可變性之間取得平衡。通過(guò)刪除重復(fù)或冗余序列，對(duì)酵母基因組進(jìn)行了精簡(jiǎn)；為了便于大規(guī)模的工程操作而引入必需的標(biāo)簽序列，以便區(qū)分人工合成染色體與天然染色體；利用Cre/loxP重組系統(tǒng)，在人工合成染色體中引入突變和篩選機(jī)制。Cre重組酶是源于噬菌體P1的一種酶蛋白，能專一性催化兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的DNA進(jìn)行特異性重組，導(dǎo)致DNA序列倒置或缺失。這樣的設(shè)計(jì)，意在探索染色體重組和修飾對(duì)酵母活性和功能的影響，相當(dāng)于在實(shí)驗(yàn)室里建立酵母快速演化的模型，體現(xiàn)出Sc2.0計(jì)劃對(duì)酵母演化基本問(wèn)題的探索。

野生型酵母基因組大小為12 071 kb。按照設(shè)計(jì)，人工合成的16條酵母染色體共有11 353 kb，刪減了約6%的基因組。雖然有刪減和替換，但總體上來(lái)說(shuō)，依然屬于對(duì)基因組比較“溫和”的改變，這也是保證人工合成染色體能夠具有正常生理功能的重要因素。

在組裝階段，通過(guò)一步操作將整條酵母染色體置換為人工合成的染色體太困難，因此研究團(tuán)隊(duì)采用逐步的、分層次的組裝策略。以約750 bp的寡核苷酸為起點(diǎn)，將其裝配成2～3 kb的小片段，再進(jìn)一步裝配成約10 kb的大片段。3～6個(gè)這樣的片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶的酶切和連接過(guò)程組裝成30～60 kb的巨區(qū)段(megachunk)。最后，利用酵母的同源重組機(jī)制，每次將長(zhǎng)為30～60 kb的野生型基因組大片段用相對(duì)應(yīng)的人工合成的區(qū)段置換出來(lái)。這樣操作的好處是可以對(duì)每次同源重組的效果進(jìn)行評(píng)估，若出現(xiàn)致死表型或者可檢測(cè)到的適應(yīng)缺陷可以及時(shí)糾錯(cuò)。即按照“設(shè)計(jì)—構(gòu)建—組裝—測(cè)試—學(xué)習(xí)”的循環(huán)逐步完成人工染色體的構(gòu)建。每個(gè)巨區(qū)段(除了最末端一個(gè)區(qū)段)都攜帶一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，通過(guò)交替使用URA3和LEU2兩個(gè)篩選標(biāo)記，逐步完成整條染色體的裝配過(guò)程。

Sc2.0計(jì)劃運(yùn)用工程化的手段重新裝配和構(gòu)建酵母的16條染色體。每條構(gòu)建完成的人工染色體開(kāi)始時(shí)都分散于不同的酵母菌株中，若將不同的酵母人工合成染色體整合至同一個(gè)酵母菌株，需要利用酵母的特點(diǎn)：不同結(jié)合型的單倍體酵母可以雜交形成二倍體，二倍體酵母在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可以形成單倍體的孢子。然而，由于減數(shù)分裂過(guò)程發(fā)生多次染色體同源重組，人工合成染色體中往往含有很多天然染色體的區(qū)段，篩選含有多條完整人工合成染色體的子代細(xì)胞更是困難。為此，研究人員建立了“核內(nèi)再?gòu)?fù)制雜交”(endoreduplication intercross)的方法，成功獲得同時(shí)含有多條人工合成染色體的酵母菌株。圖2展示了運(yùn)用該方法將synIII和synIXR整合至同一酵母菌株的過(guò)程。

圖2 運(yùn)用核內(nèi)再?gòu)?fù)制雜交方法將synIII和synIXR兩條人工合成染色體整合至同一酵母菌株[2]。首先改造III和IXR兩條野生型染色體的著絲粒，使著絲粒的功能既可以保持又可以被抑制；分別含有synIII和synIXR的兩個(gè)酵母菌株雜交，并同時(shí)抑制III和IXR著絲粒的功能，相當(dāng)于雜交后的二倍體酵母含有“2n-2”條染色體；通過(guò)酵母的核內(nèi)再?gòu)?fù)制現(xiàn)象，兩條人工合成的染色體再次復(fù)制，即形成synIII/synIII和synIXR/synIXR同源染色體，酵母染色體重新回復(fù)到2n條。含有多個(gè)合成染色體的酵母單倍體菌株通過(guò)孢子制備和分離獲得

目前，研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)將synII、synIII、synV、synVI、synX和synXII共六條人工合成染色體的酵母整合至同一酵母菌株，而且該酵母菌株可以像野生型酵母那樣具有正常的表型和生理功能(圖3)。距離構(gòu)建完整真核生物基因組已經(jīng)不再遙遠(yuǎn)。

圖3 同時(shí)包含6條人工合成染色體的酵母具備與野生型酵母一樣的正常生理功能[3]

4 Sc2.0計(jì)劃：首個(gè)人造真核生物

在Sc2.0計(jì)劃之前，人工合成生命體僅限于簡(jiǎn)單的細(xì)菌。2010年，克雷格?文特爾研究所合成大小為1 078 kb的絲狀支原體(Mycoplasma mycoides)精簡(jiǎn)版本的基因組，并將其植入細(xì)胞，成功構(gòu)建世界上首個(gè)完全人工合成生命體——JCVI-syn1.0的細(xì)菌。支原體是能夠自主生活的最小的原核生物。2016年，該團(tuán)隊(duì)在syn1.0的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成了有最小基因組的自主生活生命體——僅包含473個(gè)基因的syn3.0，成為合成生物學(xué)的標(biāo)志性成果之一。

Syn3.0的合成，旨在探索能夠支持生命活動(dòng)的最小基因組的內(nèi)容是什么，而“Sc2.0計(jì)劃”為在真核生物中揭示同樣的問(wèn)題打開(kāi)了一扇門。

釀酒酵母作為單細(xì)胞的真核生物，體積比原核生物大得多，基因組信息更為龐大復(fù)雜，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也復(fù)雜得多。Sc2.0計(jì)劃在復(fù)雜程度和技術(shù)難度上都非細(xì)菌人工合成可比擬的，這是科學(xué)家首次嘗試改造并從頭合成真核生物，成為合成生物學(xué)發(fā)展的新階段?！案淖兓蚪M就像賭博。一個(gè)錯(cuò)誤的變化，就可能殺死細(xì)胞，”Sc2.0計(jì)劃的發(fā)起人伯克說(shuō)，“而我們的酵母仍然活著，這非常重要，說(shuō)明我們的合成染色體生命力頑強(qiáng)，賦予酵母新的屬性?！?“如果說(shuō)基因組測(cè)序是‘讀懂生命密碼’，基因組合成就是在‘編寫生命密碼’，從讀到寫，是一個(gè)巨大飛躍。”華大基因理事長(zhǎng)楊煥明院士評(píng)價(jià)說(shuō)。同濟(jì)大學(xué)傅繼梁教授認(rèn)為：“Sc2.0計(jì)劃是非常有意義的一項(xiàng)研究，其設(shè)計(jì)體現(xiàn)了一種新的研究思路，在合成過(guò)程中能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，并且在產(chǎn)業(yè)方面有極大的應(yīng)用潛力，可以大大加快在醫(yī)藥、能源或環(huán)境等領(lǐng)域有重要應(yīng)用的酵母新菌株的開(kāi)發(fā)，無(wú)疑是合成生物學(xué)發(fā)展的一個(gè)里程碑，也標(biāo)志著合成生物學(xué)從理論到現(xiàn)實(shí)的轉(zhuǎn)變。”

在Sc2.0計(jì)劃從設(shè)計(jì)到組裝的不斷試錯(cuò)過(guò)程中，加深對(duì)基因組的理解與認(rèn)識(shí)。酵母中揭示的復(fù)雜而保守的調(diào)控機(jī)制，對(duì)其他高等生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的研究具有重要的借鑒意義。另外，大量對(duì)稱型loxP位點(diǎn)的插入是極具創(chuàng)新性的研究方法。它可以通過(guò)基因組重排實(shí)現(xiàn)快速演化，為深入分析或者改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)與功能提供無(wú)限的可能性，也為產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

(2017年4月25日收稿)

[1] 傅繼梁. 基因: 探究、思辨與創(chuàng)新[M].上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2016.

[2] RICHARDSON S M, MITCHELL L A, STRACQUADANIO G, et al. Design of a synthetic yeast genome [J]. Science, 2017, 355: 1040-1044.

[3] KANNAN K, GIBSON D G. Yeast genome, by design. Scientists are inching closer to generating a synthetic eukaryotic cell [J]. Science, 2017, 355: 1024-1025.

（編輯：溫文）

Milestone of synthetic biology: the synthetic yeast genome project

DUAN Yanfang

10.3969/j.issn.0253-9608.2017.03.010

?通信作者，E-mail: yfduan@shu.edu.cn