艾比湖濕地土壤纖維素降解菌篩選及酶活測(cè)定

白旭明

摘要：篩選了采自新疆艾比湖濕地的土壤中的纖維素降解菌，并測(cè)定了其中具有較高降解效率的8株菌的纖維素酶活。結(jié)果表明：經(jīng)過初篩分離純化后，共得到纖維素降解菌74株菌，屬26個(gè)種，篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌最多，有14個(gè)種，菌株13C12（Bacillus aquimaris）的纖維素酶活最高，濾紙酶（FPase）活為21.4 U/mL，內(nèi)切葡聚糖酶酶活達(dá)37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）為19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為24.6 U/mL，Bacillus aquimaris可嘗試作為工業(yè)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：艾比湖；纖維素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株

中圖分類號(hào)：S182

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16749944（2017）10011304

1 引言

新疆艾比湖濕地國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)是中國(guó)內(nèi)陸荒漠物種最為豐富的區(qū)域之一，由于其特殊的地理位置，使得該地形成了沼澤、灘涂、鹽湖、沙漠、石漠、礫漠、鹽漠等多種土壤類型。依此而生的土壤微生物資源經(jīng)歷了長(zhǎng)期的進(jìn)化演變，成為我國(guó)干旱區(qū)重要的種質(zhì)基因庫，具有典型性和較高的保護(hù)價(jià)值[1]。纖維素是地球上最豐富的碳質(zhì)資源之一，由于難以被大量分解利用，而被人們大量堆積或燃燒，從而對(duì)環(huán)境造成極大的污染和資源浪費(fèi)。如果能通過纖維素水解酶轉(zhuǎn)化利用，必將產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[2]。纖維素酶是由一系列酶系組成，濾紙是純纖維素材料，其聚合度和結(jié)晶度都比較適中，降解濾紙的濾紙酶（FPase）活性所代表的是纖維素酶的總活力，體現(xiàn)了纖維素酶系內(nèi)的協(xié)同能力。濾紙酶活力的測(cè)定主要依據(jù)纖維素酶水解濾紙產(chǎn)生還原糖的數(shù)量[3]。研究中試圖通過分離和篩選具有較高纖維素酶活性的菌株，為開發(fā)具有應(yīng)用前景的工業(yè)菌種做出貢獻(xiàn)。

2 材料與方法

2.1 供試土壤

試驗(yàn)土壤采自新疆北部艾比湖濕地國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的蘆葦?shù)睾图t柳地。采取距表層0～20 cm土壤約200 g，去除土壤中可見的動(dòng)植物殘?bào)w和石子，用自封袋封裝帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm篩，立即進(jìn)行篩菌測(cè)酶活。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 纖維素降解菌篩選

稱取1.0 g 土樣到10 mL離心管中，加入無菌水9.0 mL 和幾粒無菌鋼珠，經(jīng)高速振蕩混勻后靜置，取上清液1 mL稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個(gè)濃度梯度。取100 μL涂布于培養(yǎng)基上，30℃ 恒溫倒置培養(yǎng)24 h后，用牙簽挑取形態(tài)有差異的單菌落，接種到固體平板培養(yǎng)基上，用于純化后測(cè)序鑒定。

另取上清液1 mL加入液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床120轉(zhuǎn)/min，30℃富集三代后，劃線接種在固體培養(yǎng)基上，24 h后，用牙簽挑取形態(tài)有差異的單菌落（產(chǎn)外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌落周圍有黑圈），接種到固體平板培養(yǎng)基上，用于純化后測(cè)序鑒定。

注意：液體培養(yǎng)基不加顯色劑和瓊脂。

2.2.2 纖維素酶活測(cè)定

（1）濾紙酶（FPase）。取100±0.5 mg濾紙與1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值為4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液l mL，50℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫。

（2）內(nèi)切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫。

（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纖維素溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫。

（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水楊苷溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應(yīng)1 h后取出，迅速冷卻至室溫[4]。

酶促反應(yīng)結(jié)束之后，立即加入0.8 mL DNS 試劑，沸水浴5 min之后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容10 mL。在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度OD 值，對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖量P。以高溫滅活的粗酶液為對(duì)照組。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸餾水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS試劑0.8 mL，混勻后煮沸5 min，取出立即用冷水冷卻，用水定容至10 mL，搖勻，530 nm測(cè)吸光度OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活定義：底物在一定反應(yīng)條件（pH值為4.8，50℃，恒溫l h）下，與1 mL粗酶液反應(yīng)1 min生成1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

計(jì)算：酶活力（U/mL）=P×K×1000/時(shí)間*體積，其中K為稀釋倍數(shù)。

2.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003，Origin 8.0和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析及繪圖。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的篩選結(jié)果

采用3種培養(yǎng)基和常規(guī)的分離技術(shù)對(duì)土樣中的纖維素降解菌進(jìn)行初步篩選，分離。然后對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，獲得序列后，在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，經(jīng)過比對(duì)的結(jié)果如表1。

經(jīng)過初篩分離純化后，共得到74株菌，屬26個(gè)種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌最多有14個(gè)種。Bacillus是一類好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生抗逆性孢子的桿狀細(xì)菌。多數(shù)為腐生菌，主要分布于土壤、動(dòng)植物體表及水體中。由于芽孢桿菌屬的細(xì)菌可以產(chǎn)生多種有用代謝產(chǎn)物，芽孢又是菌體度過不良環(huán)境的休眠體，因此，在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有較高的應(yīng)用價(jià)值[5]。例如枯草芽孢桿菌是工業(yè)上生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的主要菌種，蘇云金芽孢桿菌用于生產(chǎn)生物農(nóng)藥，巨大芽孢桿菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillus aquimaris能利用羧甲基纖維素鈉，水解淀粉，耐鹽[6]。Bacillus aryabhattai可以利用纖維二糖，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有溶磷作用、產(chǎn)植物激素。Bacillus litoralis采自海水淤泥，利用纖維二糖和醋酸纖維素，水解淀粉。Bacillus oceanisediminis具有硝酸鹽還原作用，還能利用纖維二糖、醋酸纖維素。Bacillus firmus能富集鉻、砷，或用于生物修復(fù)[7]。Bacillus vietnamensis中等耐鹽、產(chǎn)氧化酶，抗溶菌酶（區(qū)別于B.firmus）。可在pH值為4.5和9.0的環(huán)境生長(zhǎng)，不同于B.aquimaris。Altererythrobacter xinjiangensis能水解酪蛋白和纖維素，可利用葡聚糖。Arthrobacter nicotianae降解尼古丁，脫硫，聚磷。Planococcus rifietoensis產(chǎn)纖維素酶、脫氨酶，促進(jìn)植物生長(zhǎng)（固氮，溶磷作用，產(chǎn)吲哚乙酸）[8]。Microbacterium amylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomyces coelicoflavus能降解纖維素，還原硝酸鹽[9]。

3.2 纖維素酶酶活測(cè)定

選取其中水解圈較大的8株菌進(jìn)行纖維素酶活測(cè)定（表2）。分別測(cè)定了濾紙酶（FPase）、內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（Avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。

由圖1可知，菌株13C12、03C5、05B2的濾紙酶活顯著高于其它，其中13C12的酶活最高達(dá)21.4 U/mL。菌株MZ2、03C9、13C3的酶活次之，約為3.2 U/mL。菌株132和13A4的濾紙酶活最低。

4 結(jié)論與討論

（1）經(jīng)過初篩分離純化后，共得纖維素降解菌到74株菌，屬26個(gè)種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌最多，有14個(gè)種。

（2）菌株13C12的纖維素酶活最高。濾紙酶（FPase）活為21.4 U/mL，內(nèi)切葡聚糖酶酶活達(dá)37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）為19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為24.6 U/mL。

（3）接種量的多少會(huì)影響產(chǎn)纖維素酶菌株在發(fā)酵液中的生長(zhǎng)、代謝和繁殖速度。選擇較大的接種量可以縮短發(fā)酵液內(nèi)菌體密度達(dá)到高峰的時(shí)間，有利于產(chǎn)物的形成以及培養(yǎng)基質(zhì)的利用，并減小被雜菌污染的概率。然而接種量過大則會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧不足，限制產(chǎn)物的合成，菌體易老化；接種量過小則會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，影響產(chǎn)率。

（4）由于許多土壤細(xì)菌生活力較差，樣本采集回來后應(yīng)盡快篩菌，否則，擱置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重影響篩菌的效率和成功率。此外，土壤細(xì)菌大多數(shù)不可培養(yǎng)，通過傳統(tǒng)篩菌方法篩到的菌落有限，所以探尋新的實(shí)驗(yàn)方法具有重要意義。

致謝：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周杰民博士對(duì)本實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)過程中的支持；感謝新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第五師農(nóng)科所的工作人員在采樣過程中的幫助。

參考文獻(xiàn)：

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