柱后衍生—HPLC測定與分析沉香中黃曲霉毒素

唐健新+區(qū)桂姍+蘇章軒+徐萬幫+梁生旺

【摘要】目的：對沉香中黃曲霉毒素進行測定。方法：采用柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術，測定沉香中黃曲霉毒素的含量，了解所獲沉香中黃曲霉毒素污染情況。結果：按照《中國藥典》2015版的要求與指導原則， 69批次沉香樣品均未檢出黃曲霉毒素。結論：柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術測定沉香中黃曲霉毒素方法可行，我國沉香黃曲霉毒素未受到黃曲霉毒素污染。

【關鍵詞】沉香；黃曲霉；柱后衍生-HPLC

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）11-0031-05

黃曲霉毒素是真菌毒素中毒性最強的一種真菌毒素，具有極強的毒性和致癌性。在自然界中，無論是土壤、腐爛有機質物品與植物纖維、農產品或者其他食品上都有黃曲霉毒素存在。黃曲霉最適宜生存在相對濕度 85%左右的熱帶、亞熱帶地區(qū)并產生黃曲霉毒素。我國地域十分遼闊以及氣候的多樣性和復雜性導致我國中藥材和中藥飲片在加工、貯藏、運輸?shù)倪^程中，很容易發(fā)生霉變而導致被黃曲霉毒素污染。因此，檢測中藥材中黃曲霉毒素具有極其重要的意義[1-4]。

目前2015版《中國藥典》僅僅對少數(shù)幾種中藥材規(guī)定有關黃曲霉毒素含量的限度標準，如陳皮，胖大海等。沉香是我國的名貴中藥材之一，2016年廣東省通過立法保護廣東八種道地中藥材，沉香為其中之一。由于沉香主產越南、海南和廣東等熱帶和亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)的環(huán)境條件極易被黃曲霉等真菌類污染而產生黃曲霉毒素。因此，筆者擬采用柱后衍生與高效液相色譜聯(lián)用技術[5-8]，通過對沉香進行黃曲霉毒素測定，建立沉香中黃曲霉毒素含量測定的方法，為監(jiān)管部門提供技術支持。

1儀器與材料

11儀器Waters 2695/2475高效液相色譜儀及柱后衍生系統(tǒng)；色譜柱：Shim-pack CLC-ODS C18（150mm×6mm，5μm）、phenomenex gemini C18（250mm×46mm，5μm）、Thermo ODS-2 HYERSIL（200mm×46mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×46mm，5μm）； 離心機：Thermo Scientific Multifuge X1R

12材料黃曲霉素混合對照品（批號：46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2純度分別為990%、990%、997%、995% ，Supelco Analitical）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為試驗室自制去離子水。005%碘溶液：取05g碘，溶解在100mL甲醇中，用水稀釋至1000mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）。樣品：69批沉香樣品，來源于國家評價性抽驗，所有樣品均經(jīng)過本單位教授鑒定。

2方法與結果

21色譜條件以甲醇-乙腈-水（22∶18∶60）為流動相，流速為10mL/min；衍生溶液為005%的碘溶液，衍生化泵流速03mL/min，衍生化溫度70℃。熒光檢測器激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm。供試品溶液進樣量50μL。

22樣品的制備

221對照品溶液的制備精密量取黃曲霉素混合對照品（B1、B2、G1、G2濃度分別為10μg/mL、03μg/mL、10μg/mL、03μg/mL）05mL，用甲醇定容至10mL，作為儲備液。精密量取儲備液1mL，用70%甲醇定容至25mL，搖勻，即得。

222供試品溶液的制備取沉香藥材粉末2份，每份10g，于錐形瓶中，精密稱定，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇75mL，超聲20min，離心5min（10000rpm），精密量取上清液15mL，于50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。離心5min（10000rpm），用045μm孔徑的濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液20mL，通過免疫親和層析柱，流速2d/s，用20mL水分2次洗脫，棄去洗脫液，并通過約2mL空氣。用15mL甲醇分次洗脫，收集洗脫液，置2mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

223回收溶液的制備取沉香藥材粉末6份（批號：120921YF03），每份10g，于錐形瓶中，精密稱定，加入02mL黃曲霉素混合對照品儲備液（B1、B2、G1、G2濃度分別為00495μg/mL、001485μg/mL、004985μg/mL、0014925μg/mL）外，其余同試驗供試品溶液的制備方法。

224空白溶液的制備精密量取2份經(jīng)檢驗無黃曲霉毒素的沉香樣品，每份10g，于錐形瓶中，其余同試驗供試品溶液的制備方法，制備空白溶液。

225測定按2015版《中國藥典》四部中，黃曲霉毒素測定法項下所述內容進行操作和檢測。

23方法學驗證

231加樣回收率試驗根據(jù)《中國藥典》四部有關要求可知：

y回收率=測得量-樣品中本底含量對照品加入量×100%

試驗將133中所獲得的回收溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標準曲線法獲得沉香中黃曲霉毒素加樣回收率。如圖1所示。

從表1可知，黃曲霉毒素B1、G1回收率在70%～110%之間，黃曲霉毒素B2、G2回收率在75%～110%之間，符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

232精密度以混合對照黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2溶液為參照指標，對其進行精密度考察，精密吸取對照品溶液25μL，注入液相色譜儀，重復測定6次，即得。結果見表2。

從表2可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下精密度良好，相關的RSD為分別為101%、087%、109%和092%，符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

233專屬性考察以制備的空白溶液為參照指標，對其進行專屬性考察，分別精密吸取空白溶液、對照品溶液和樣品溶液25μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。如圖2～4所示。

從圖2～4可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下空白無干擾，四種有效成分的分離度良好符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

234線性關系采用逐步稀釋法，獲取系列不同濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的混合對照溶液25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)色譜峰面積和相應的稀釋倍數(shù)（濃度），根據(jù)waters高效液相色譜儀自帶的處理程序，獲得相應的線性關系。見表3。

從表3可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在指定的濃度范圍內，線性關系良好，相關系數(shù)均大于099，符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

24耐用性的考察

241不同色譜柱的考察由于在測定的沉香樣品中沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣品，故采用對照溶液對不同色譜柱進行考察。照含量測定項下方法操作，采用四根不同規(guī)格的色譜柱測定對照溶液中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，為了更好的體現(xiàn)色譜柱的性能比較，本次試驗以黃曲霉毒素B1為代表，分別從測定的含量、理論塔板數(shù)、分離度以及對稱因子四個方面對色譜柱進行比較，結果見表4。

可知，四根不同的色譜柱均能有效分離與準確測定黃曲霉毒素B1。說明該方法的色譜柱要求不高，大部分色譜柱均能滿足對沉香樣品中黃曲霉毒素的測定。

242穩(wěn)定性試驗取精密吸取黃曲霉毒素B1濃度為00198μg/mL的對照溶液25μL注入液相色譜儀，分別在0、8、13、18、25、30小時測定其含量，結果表明，樣品在30h內穩(wěn)定。

243方法檢出限取對照品溶液（黃曲霉毒素B1濃度為000198μg/mL），采用逐步稀釋法，并將逐步稀釋后的溶液，精密量取25μL注入色譜儀，記錄色譜圖。如圖5所示。

試驗以黃曲霉毒素B1的值為基準，用儀器自帶的計算軟件，當黃曲霉毒素B1信噪比約33：1，以此計算方法檢出限，符合儀器分析中儀器檢測限的相關要求。此時，以黃曲霉毒素B1計，沉香中黃曲霉毒素的檢測限約為02μg/kg。

25樣品中黃曲霉毒素含量測定采用上述方法，分別對所有69批次的沉香樣品進行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測定，結果均沒有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染。

3結論

建立柱后衍生法測定沉香中黃曲霉毒素的方法，并對其進行方法學驗證，結果該表明方法良好。分別對所獲得的69批沉香樣品進行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測定，均沒有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染，說明我國沉香藥材受到黃曲霉毒素污染的風險較小。

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（收稿日期：2017-03-24編輯：梁志慶）