敲除TPX2基因可以降低乳腺癌干細(xì)胞活性及增加放療敏感性

黃超有，吳德華，韓 錚，朱珊珊廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，廣東 廣州 5400；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科，廣東 廣州5055

敲除TPX2基因可以降低乳腺癌干細(xì)胞活性及增加放療敏感性

黃超有1，吳德華2，韓 錚1，朱珊珊11廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，廣東 廣州 511400；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科，廣東 廣州510515

目的研究TPX2基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞活性及放療敏感性的影響。方法使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TPX2基因在乳腺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況。使用RT-PCR檢測(cè)TPX2基因在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異。使用慢病毒干擾載體建立穩(wěn)定低表達(dá)TPX2蛋白的乳腺癌細(xì)胞。平板克隆、MTT試驗(yàn)驗(yàn)證TPX2對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲除TPX2之后對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡比率的影響。檢測(cè)CD44陽性細(xì)胞比例、腫瘤球形成能力以及側(cè)群細(xì)胞比例，驗(yàn)證敲除TPX2之后對(duì)乳腺癌干細(xì)胞活性影響。結(jié)果TPX2基因在乳腺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。敲除TPX2之后，可以使乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)能力減弱并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TPX2敲除后，可以降低乳腺癌干細(xì)胞活性及提高放療敏感性。結(jié)論TPX2為促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)癌基因，其可通過提高乳腺癌干細(xì)胞活性來影響乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性。

TPX2；腫瘤干細(xì)胞；放療敏感性；乳腺癌

近年來，隨著乳腺外科手術(shù)技術(shù)和婦科腫瘤學(xué)的不斷發(fā)展，乳腺癌的預(yù)后仍不容樂觀，目前常規(guī)手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療，其5年生存率只有54.5%[1]。惡性乳腺癌中的一小群乳腺腫瘤干細(xì)胞（BTSC）具有自我更新功能并呈現(xiàn)顯著的放射抵抗性，是放射抵抗性的根源。CD44+作為乳腺腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志物，在不同惡性級(jí)別的乳腺癌中比例不同，已有研究證實(shí)CD44+細(xì)胞是放療抵抗的根源之一[2-3]。此外，還可以使用腫瘤球形成能力以及側(cè)群細(xì)胞的比率來衡量BTSC的活性[4-7]。

TPX2是近年來研究比較熱的一個(gè)基因，研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤，如食管癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、人腦膠質(zhì)瘤、唾液腺癌及卵巢癌中均有高表達(dá)，并且其高表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，阻斷其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8-10]。TPX2的下調(diào)在許多腫瘤細(xì)胞系中均導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡[11]，但是TPX2在乳腺癌的表達(dá)情況、其與BTSC及乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性關(guān)系，尚未充分明確。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞株及永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購買至上海中科院。所有細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），放置于含5%CO2的37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法試驗(yàn)

提取細(xì)胞RNA使用TRIzol試劑法（Invitrogen）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑盒（qSYBR-green-containing PCR kit）購自上海吉?jiǎng)P。

提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平。TPX2以及GAPDH抗體購自santa cruz。二抗購自中杉金橋。ECL顯色發(fā)光試劑盒購自康維世紀(jì)。

1.3 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒（FITC-PI雙染色）購自凱基公司。細(xì)胞染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)凋亡情況。

1.4 構(gòu)建低表達(dá)TPX2基因的乳腺癌細(xì)胞

根據(jù)TPX2基因（NM-1003620）序列，設(shè)計(jì)合成已證實(shí)能穩(wěn)定沉默TPX2基因的片段（shTPX2）。使用PCR技術(shù)，將shTPX2基因片段構(gòu)建到慢病毒載體（pLK0.1）中。包裝慢病毒，使用慢病毒上清感染MCF7細(xì)胞。根據(jù)綠色熒光蛋白篩選出穩(wěn)定感染的細(xì)胞。

1.5 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

將裸鼠隨機(jī)分成4組，每組5只。將1×106個(gè)細(xì)胞接種于裸鼠皮下，接種后5 d，按以下方式處理：第1組為空白對(duì)照組，第2組為單純放療組，第3組為sh-TPX2組，第4組為放療+sh-TPX2組。腫瘤體積每3 d監(jiān)測(cè)1次。腫瘤體積使用V=π/6（高度×長(zhǎng)度×寬度）公式計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間的差異使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組之間的差異使用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPX2在乳腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)

本研究使用蛋白質(zhì)印跡法試驗(yàn)檢測(cè)TPX2在一系列乳腺癌細(xì)胞以及永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A表達(dá)的差異。結(jié)果提示，乳腺癌細(xì)胞株中TPX2的表達(dá)水平顯著高于非癌細(xì)胞MCF-10A（圖1，P＜0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果提示：與癌旁組織相比，乳腺癌組織中TPX2顯著升高。

圖1 TPX2在乳腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)

2.2 敲除TPX2可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡

由于TPX2可能作為乳腺癌的一個(gè)促癌基因，本研究驗(yàn)證敲除TPX2之后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的相關(guān)功能變化。首先使用慢病毒感染MCF-7細(xì)胞，建立低表達(dá)TPX2蛋白的細(xì)胞株（圖2A）。平板克隆試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：敲除TPX2蛋白后，MCF-7細(xì)胞形成克隆的數(shù)目和大小較空白對(duì)照組明顯減弱（圖2B，P＜0.05）。MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除TPX2蛋白后，細(xì)胞生長(zhǎng)的速度明顯減慢（圖2C）。凋亡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除TPX2蛋白后，可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡（圖2D）。

圖2 敲除TPX2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡

2.3 敲除TPX2可以減低乳腺癌干細(xì)胞活性及提高放療敏感性

進(jìn)一步研究TPX2基因是否可以影響乳腺癌干細(xì)胞活性及放療敏感性，發(fā)現(xiàn)敲除TPX2基因之后，MCF7細(xì)胞中CD44+細(xì)胞的比例明顯下降（圖3A）。同時(shí)，MCF7細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例（圖3B），以及形成腫瘤球的能力（圖3C）也是顯著下降的。

研究TPX2基因是否可以影響乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除了TPX2基因之后，MCF7細(xì)胞對(duì)放療的敏感性升高（圖3D）。

2.4 體內(nèi)試驗(yàn)

使用裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)，驗(yàn)證敲除了TPX2基因之后，乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)能力及對(duì)放療敏感性的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TPX2基因敲除后，MCF7細(xì)胞皮下成瘤的能力下降。與對(duì)照相及單純放療組相比，敲除了TPX2基因之后可使放療的敏感性增加（圖4）。

圖3 敲除TPX2減低乳腺癌干細(xì)胞活性及提高放療敏感性

圖4 敲除TPX2基因增加放療敏感性

3 討論

腫瘤干細(xì)胞能促使腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，從而導(dǎo)致腫瘤形成和無限生長(zhǎng)。腫瘤干細(xì)胞能夠耐受傳統(tǒng)的細(xì)胞毒化療和放射治療，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐受的根本原因。腫瘤干細(xì)胞和放療抵抗密切相關(guān)：腫瘤干細(xì)胞對(duì)放療產(chǎn)生抵抗的原因可以歸結(jié)為以下幾點(diǎn)：①放射通過引起DNA雙鏈斷裂和DNA-蛋白交聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此DNA的修復(fù)能力是影響細(xì)胞存活或者死亡的重要因素。腫瘤干細(xì)胞比普通腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力，所以在相同的放療劑量下，能夠更好地存活[12]。②細(xì)胞周期可影響細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。一般而言，處于有絲分裂期（M期）的細(xì)胞對(duì)放療相對(duì)敏感。腫瘤干細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間處于G0靜滯期，相對(duì)處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞周期的推進(jìn)較為緩慢，這導(dǎo)致了CSC對(duì)放療的敏感性大大降低[13]。

乳腺癌細(xì)胞中存在一定比例的BTSC，這類細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞活性。BTSC可能是乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生放療抗性的根本原因，阻斷BTSC的活性能夠使乳腺癌患者對(duì)治療更好的獲益。目前，可以使用CD44表明抗原標(biāo)記物，腫瘤球形成能力以及側(cè)群細(xì)胞的比率來衡量BTSC的活性[14]。TPX2基因在很多實(shí)體瘤里面被普遍認(rèn)為是一個(gè)促癌基因，比如：TPX2蛋白高表達(dá)和晚期透明細(xì)胞腎癌具有正相關(guān)性，是該類腎癌患者根治術(shù)后的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)之一[15]。TPX2蛋白高表達(dá)還可以通過活化AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲水平[16]。在胃癌中，TPX2蛋白可作為患者預(yù)后的指標(biāo)，其水平升高預(yù)示患者預(yù)后不佳[17]。TPX2還可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，并通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的侵襲[18]。但TPX2在乳腺癌中的表達(dá)情況及作用尚未充分明確。本研究發(fā)現(xiàn)，TPX2基因在乳腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平都是升高的，其可能作為一個(gè)促癌基因。進(jìn)一步的細(xì)胞功能發(fā)現(xiàn)，TPX2基因可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。而敲除TPX2基因之后，可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果充分表明TPX2可以通過促進(jìn)生長(zhǎng)，抑制凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。有意思的是，敲除TPX2基因之后，還可以使乳腺癌干細(xì)胞的活性下調(diào)，從而使乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性增加。裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果與體外試驗(yàn)一致，充分肯定了TPX2基因可增加BTSC活性，及導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生放療抗性。

基于TPX2在乳腺癌中的重要作用，本研究認(rèn)為：靶向TPX2基因的治療，有可能為克服臨床上乳腺癌細(xì)胞的放療抗性提供新的治療思路。

[1]Wu SG, He ZY, Zhou J, et al. Serum levels of CEA and CA15-3 in different molecular subtypes and prognostic value in Chinese breast cancer[J]. Breast, 2014, 23(1)： 88-93.

[2]Ricardo S, Vieira AF, Gerhard R, et al. Schmitt F and paredes J.breast Cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1：expression distribution within intrinsic molecular subtype[J]. J Clin Pathol, 2011, 64(11)： 937-46.

[3]Weng D, Song B, Koido S. Immunotherapy of radioresistant mammary tumors with early metastasis using molecular chaperone vaccines combined with ionizing radiation[J]. J Immun, 2013,191(2)： 755-63.

[4]Britton KM, Kirby JA. Cancer stem cells and side population cells in breast cancer and metastasis[J]. Cancers, 2011, 3(2)： 2106-30.

[5]Hiraga T, Ito S, Nakamura H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential[J]. Oncology reports,2011, 25(1)： 289-96.

[6]Cao L, Zhou Y, Zhai B, et al. Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines[J].BMC Gastroent, 2011, 23(11)： 71-6.

[7]Lombardo Y, de Giorgio A, Coombes CR. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines[J]. J Vis Exp,2015, 9(7)： 12-8.

[8]Wei P, Zhang N, Xu Y, et al. TPX2 is a novel prognostic marker for the growth and metastasis of colon cancer[J]. J Transl Med, 2013,11(6)： 31-3.

[9]Neumayer G, Helfricht A, Shim SY, et al. Targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2 (TPX2) regulates gamma-Histone 2AX (gamma-H2AX) levels upon ionizing radiation[J]. J Biol Chem, 2012, 287(50)： 42206-22.

[10]Neumayer G, Belzil C, Gruss OJ, et al. TPX2： of spindle assembly,DNA damage response, cancer cellular and molecular life sciences[J]. CMLS, 2014, 71(16)： 3027-47.

[11]Yang Y, Li DP, Shen N, et al. TPX2 promotes migration and invasion of human breast cancer cells[J]. Asian Pacif J Trop Med,2015, 8(12)： 1064-70.

[12]Bao S, Wu Q, Mclendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J]. Nature, 2006, 444(20)： 756-60.

[13]Shima H. Acquisition of G(0) state by CD34-positive cord blood cells after bone marrow transplantation[J]. Exp Hematol, 2010,38(12)： 1231-40.

[14]Xun J, Wang DK, Shen L, et al. JMJD3 suppresses stem cell-like characteristics in breast cancer cells by downregulation of Oct4 independently of its demethylase activity[J]. Oncotarget, 2017,8(13)： 21918-29.

[15]Glaser ZA, Love HD, Guo S, et al. TPX2 as a prognostic indicator and potential therapeutic target in clear cell renal cell carcinoma[J]. Urol Oncol, 2017, 13(5)： 286-93.

[16]Gu JJ, Zhang JH, Chen HJ, et al. TPX2 promotes glioma cell proliferation and invasion via activation of the AKT signaling pathway[J]. Oncol Lett, 2016, 12(6, B)： 5015-22.

[17]Liang B, Zheng WJ, Fang L, et al. Overexpressed targeting protein for Xklp2 (TPX2) serves as a promising prognostic marker and therapeutic target for gastric cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2016,17(8)： 824-32.

[18]Liang B, Jia CH, Huang Y, et al. TPX2 level correlates with hepatocellular carcinoma cell proliferation, apoptosis and EMT[J]. Dig Dis Sci, 2015, 60(8)： 2360-72.

2017-02-06

黃超有，E-mail： cjbabay@126.com；