脂蟾毒配基PLGA-TPGS納米粒的體外細(xì)胞攝取及毒性研究Δ

徐 紅，高 萌，褚秋辰，董 浩，陳 雨，徐榮謙，張成鴻，田 燕#（.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 6044；.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 6044；.大連醫(yī)科大學(xué)八年制06級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，遼寧大連 6044）

脂蟾毒配基PLGA-TPGS納米粒的體外細(xì)胞攝取及毒性研究Δ

徐 紅1＊，高 萌2，褚秋辰2，董 浩2，陳 雨3，徐榮謙3，張成鴻1，田 燕2#（1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)八年制2016級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，遼寧大連 116044）

目的：研究脂蟾毒配基（RBG）乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E（PLGA-TPGS）納米粒（RPTN）體外被人肝癌HepG2細(xì)胞、小鼠腹水型高淋巴道轉(zhuǎn)移腫瘤HCa-F細(xì)胞的攝取情況和對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性。方法：制備包載RBG和熒光標(biāo)記物香豆素6的PLGA-TPGS納米粒（RCPTN），熒光倒置顯微鏡觀(guān)察HepG2、HCa-F細(xì)胞對(duì)RCPTN的體外攝取情況。將試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、空白PLGA-TPGS納米粒（EPTN）組、5-氟尿嘧啶溶液（FS）組、RBG溶液（RS）組、RBG/PLGA納米粒（RPN）組、RPTN組，采用水溶性四氮唑（WST-1）法考察不同終質(zhì)量濃度（1.25、2.5、5、10、20μg/m L）的FS、RS、RPN和RPTN作用24、48、72 h后HepG2細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的光密度，計(jì)算細(xì)胞存活率（CV）和半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果：RCPTN分布在HepG2、HCa-F細(xì)胞的細(xì)胞核周?chē)?。RPN組和RPTN組細(xì)胞的CV隨RBG濃度增加而減小，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而減?。慌cFS組比較，RPTN組細(xì)胞的CV均減?。≒＜0.05或P＜0.01）。FS、RS、RPN和RPTN作用于HepG2細(xì)胞的IC50隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，且IC50的大小依次為RS＞FS＞RPN＞RPTN；RPN和RPTN作用48、72 h的IC50明顯小于FS與RS（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：RPTN可將RBG帶入HepG2、HCa-F細(xì)胞內(nèi)部，其對(duì)HepG2細(xì)胞具有抑制作用，且作用強(qiáng)于RPN、RS和FS。

脂蟾毒配基；乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E；納米粒；肝癌HepG2細(xì)胞；腹水型高淋巴道轉(zhuǎn)移腫瘤HCa-F細(xì)胞；細(xì)胞攝??；體外細(xì)胞毒性

脂蟾毒配基（Resibufogenin，RBG）是中藥蟾酥的主要成分之一[1]，具有廣泛的生理、藥理活性，如強(qiáng)心、增強(qiáng)心肌收縮、升血壓、抗腫瘤等[2-5]。眾多的細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)均證明RBG是一種發(fā)展前景良好的天然抗癌藥物[6-8]，能作用于腫瘤發(fā)生的不同階段，促使癌細(xì)胞凋亡。但因其本身難溶于水，并且具有較強(qiáng)的心臟毒性，口服生物利用度非常低，影響了其在臨床上的應(yīng)用。

納米粒（Nanoparticles）是一種毒性相對(duì)較小、穩(wěn)定性好的靶向制劑，iv后能將包載的藥物靶向運(yùn)送到肝、脾、骨髓等，降低藥物在其他組織中的分布，從而提高療效、減輕毒副作用[9]。納米粒能否被腫瘤細(xì)胞直接攝取，對(duì)于納米粒給藥系統(tǒng)的研究與評(píng)價(jià)十分重要，較常用的方法是將納米粒載體材料進(jìn)行熒光標(biāo)記或?qū)晒鈽?biāo)記物包載到納米粒內(nèi)部后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察納米粒被細(xì)胞攝取的過(guò)程。香豆素6（Coumarin-6，C6）是近年來(lái)常用于納米粒給藥系統(tǒng)體內(nèi)示蹤、體外細(xì)胞攝取等研究的脂溶性熒光標(biāo)記物[10-11]，具有性能穩(wěn)定、熒光轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。

本研究用自制材料乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E（PLGA-TPGS）為載體，制備同時(shí)包載模型藥物RBG和熒光標(biāo)記物C6的RBG/C6-PLGA-TPGS納米粒（RCPTN），利用C6的綠色熒光直觀(guān)地研究人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠腹水型高淋巴道轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞HCa-F對(duì)RCPTN的攝取情況。同時(shí)以PLGA-TPGS為載體，制備只包載RBG的RBG/PLGA-TPGS納米粒（RPTN），并以市售材料PLGA為載體制備的RBG/PLGA納米粒（RPN）為對(duì)照[12]，采用水溶性四氮唑（WST-1）法考察RPTN和RPN對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以期為RPTN的體內(nèi)靶向性評(píng)價(jià)、藥效學(xué)研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；354型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；IX81倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Sorvall ST 16R臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司，離心半徑：13.5 cm）。

1.2 藥品與試劑

RBG原料藥（大連醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供，批號(hào)：20121120，純度：98%）；RCPTN[批號(hào)：20140110，規(guī)格：RBG 92 mg/g、C6 108 mg/g，粒徑：（154.6±3.6）nm]、RPTN[批號(hào)：20140109，規(guī)格：RBG 183mg/g，粒徑：（150.8±2.7）nm]、RPN[批號(hào)：20140109，規(guī)格：RBG 150 mg/g，粒徑：（342.1±2.9）nm]、空白PLGA-TPGS納米粒（EPTN，批號(hào)：20140110）均由大連醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室提供；5-氟尿嘧啶注射液（FS，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1402181，規(guī)格：25mg/m L）；WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、優(yōu)級(jí)胎牛血清（美國(guó)羅氏應(yīng)用科學(xué)公司，批號(hào)：M 1680、20120906）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20130110）；碘化丙啶（PI，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBC3518V，純度：94.0%）。

1.3 細(xì)胞株與動(dòng)物

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；小鼠腹水型高淋巴道轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞HCa-F由大連醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)教研室提供。健康昆明種小鼠，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，♀♂不限，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（遼）2008-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外細(xì)胞攝取試驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) （1）HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基中，于37、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）洗滌，0.25%胰酶消化液分散成單細(xì)胞懸液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。（2）常規(guī)方法復(fù)蘇凍存的HCa-F細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為3×107個(gè)/m L，取200μL的細(xì)胞懸液接種在小鼠腹腔，培養(yǎng)腹水。

2.1.2 HepG2細(xì)胞攝取試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行操作，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞加至24孔板，細(xì)胞密度為1× 105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。用含200μg/m L C6的RCPTN（RBG為170.4μg/m L，下同）在37下孵育4 h，冷PBS洗3次，75%乙醇固定10m in，吸走乙醇，冷PBS再洗3次，每次5m in。將200 ng/m L的DAPI加至樣品孔中，染色15m in，冷PBS洗3次，每次5m in，用熒光倒置顯微鏡觀(guān)察。結(jié)果顯示，RCPTN分布在HepG2細(xì)胞核周?chē)?，顯微鏡圖見(jiàn)圖1。

圖1 HepG2細(xì)胞攝取RCPTN的顯微鏡圖（×400）Fig 1 M icroscopy images of RCPTN by HepG2 cell up take（×400）

2.1.3 HCa-F細(xì)胞攝取試驗(yàn) 取活小鼠腹水2～3m L，置于10m L滅菌離心管中，加入適量PBS，離心（1 000 r/min，5min，下同），棄上清，再加入PBS重復(fù)操作至細(xì)胞沉淀內(nèi)無(wú)血色。向沉淀中加3m LRCPTN[13]，輕輕吹散，于37、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，離心，沉淀用冷PBS洗3次，75%乙醇固定10m in后再離心，沉淀用冷PBS洗3次。每孔加PI（0.5μg/m L）300μL染色15min后離心，沉淀用冷PBS洗3次，取少量細(xì)胞懸液壓片，用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察。結(jié)果顯示，RCPTN分布在HCa-F細(xì)胞核周?chē)@微鏡圖見(jiàn)圖2。

2.2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

圖2 HCa-F細(xì)胞攝取RCPTN的顯微鏡圖（×400）Fig 2 M icroscopy images RCPTN by HCa-F cell uptake（×400）

2.2.1 分組與給藥 為了消除96孔板和加入的培養(yǎng)液在測(cè)定樣品時(shí)對(duì)光密度（OD）的影響，先用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下只加入50μL高糖DMEM培養(yǎng)液的空白96孔板的OD空白孔（n＝6）。試驗(yàn)共分為6組，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔。（1）陰性對(duì)照組：接種細(xì)胞后不加任何藥物，加入50μL高糖DMEM培養(yǎng)液；（2）EPTN組：接種細(xì)胞后加入50μLEPTN混懸液；（3）FS組：接種細(xì)胞后加入50 μL FS（5-氟尿嘧啶終質(zhì)量濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 μg/m L）；（4）RBG溶液（RS）組：接種細(xì)胞后加入50μL RS（用含0.1%二甲基亞砜的無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液配制）；（5）RPN組：接種細(xì)胞后加入50μLRPN混懸液；（6）RPTN組：接種細(xì)胞后加入50μL RPTN混懸液。其中，RPTN、RPN、RS組中RBG終質(zhì)量濃度均分別為1.25、2.5、5、10、20μg/m L。試驗(yàn)中所有的納米粒在給藥前均需分散到適量無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液中，100W超聲處理60 s，形成納米粒的混懸液。

2.2.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL。按“2.2.1”項(xiàng)下分組加入藥物，分別作用24、48、72 h后，每孔加入WST-1溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD，參比波長(zhǎng)為600 nm，計(jì)算細(xì)胞存活率（CV）[CV（%）＝（OD加藥孔－OD空白孔）/（OD陰性對(duì)照孔－OD空白孔）×100%]。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組資料采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組細(xì)胞的CV測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，（1）HepG2細(xì)胞在EPTN組最大濃度下培養(yǎng)72 h的CV為（98.43±0.19）%，表明本研究制備納米粒所用的材料PLGA-TPGS對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)明顯的毒性；（2）隨RBG質(zhì)量濃度的增加、孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，RPN、RPTN組細(xì)胞的CV均降低（P＜0.01），表明RPN和RPTN的體外抗腫瘤作用有RBG濃度依賴(lài)性和作用時(shí)間依賴(lài)性；（3）RS組細(xì)胞的CV與FS組比較均無(wú)明顯差別，說(shuō)明RS和FS加入細(xì)胞后能迅速達(dá)到最大藥物釋放量，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，故不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞的CV變化較小；（4）當(dāng)納米粒中RBG濃度為20μg/m L時(shí)，孵育時(shí)間為48 h、72 h時(shí)，RPN、RPTN組的CV較同濃度同孵育時(shí)間點(diǎn)FS組的CV均顯著降低（P＜0.01），表明RPN、RPTN具有很好的體外抗腫瘤活性和一定的緩釋作用。⑤與RPN組比較，RPTN組細(xì)胞的CV均減低，表明RPTN體外抗腫瘤細(xì)胞作用優(yōu)于RPN。

表1 各組細(xì)胞的CV測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Determ ination resultsof CV in each group（± s，n＝6）

表1 各組細(xì)胞的CV測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Determ ination resultsof CV in each group（± s，n＝6）

注：與FS組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.FSgroup，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

作用時(shí)間，h 24 CV，% 48 72 RPTN組75.12±0.21＊72.31±0.24＊68.46±0.22＊61.32±0.15＊45.17±0.13＊58.23±0.11＊52.67±0.15＊45.25±0.23＊38.54±0.22＊＊18.71±0.26＊＊50.87±0.19＊45.93±0.12＊41.09±0.23＊31.52±0.24＊＊14.65±0.17＊＊質(zhì)量濃度，μg/mL 1.25 2.5 5 10 20 1.25 2.5 5 10 20 1.25 2.5 5 10 20 EPTN組99.27±0.15 99.07±0.17 98.73±0.21 98.36±0.19 98.44±0.18 99.32±0.20 99.08±0.19 98.89±0.13 98.17±0.11 98.25±0.22 99.13±0.21 99.05±0.27 98.37±0.13 98.44±0.11 98.43±0.19 FS組88.25±0.22 86.91±0.25 84.47±0.26 79.43±0.19 68.73±0.13 86.62±0.17 85.03±0.21 81.94±0.25 75.58±0.23 62.73±0.17 75.33±0.13 68.06±0.11 60.65±0.22 57.16±0.19 48.82±0.11 RS組87.63±0.23 85.71±0.21 83.12±0.15 80.15±0.13 75.33±0.21 85.54±0.16 80.22±0.11 79.17±0.14 74.92±0.19 69.91±0.21 83.34±0.11 79.81±0.17 75.25±0.12 71.14±0.14 68.92±0.18 RPN組78.55±0.17 75.51±0.14 72.73±0.12 67.85±0.11 55.38±0.23 64.97±0.21＊61.74±0.20＊58.13±0.25＊46.32±0.21＊32.67±0.17＊58.85±0.12＊54.98±0.11 50.22±0.17 41.24±0.19 32.37±0.21＊

2.2.4 半數(shù)抑制濃度（IC50）的測(cè)定 根據(jù)各組細(xì)胞抑制率[IR（%）＝1－CV]，將同一作用時(shí)間的5個(gè)藥物濃度分別與對(duì)應(yīng)的IR進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到不同作用時(shí)間的IR方程。將IR＝50%代入該方程，計(jì)算IC50。各組細(xì)胞作用不同時(shí)間的IC50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞作用不同時(shí)間的IC50測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Determ ination results of IC50after cell incubated for different time in each group（±s，n＝6）

表2 各組細(xì)胞作用不同時(shí)間的IC50測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Determ ination results of IC50after cell incubated for different time in each group（±s，n＝6）

注：與RS組比較，＊＊P＜0.01；與FS組比較，#P＜0.05Note：vs.RSgroup，＊＊P＜0.01；vs.FSgroup，#P＜0.05

RS組59.57±0.11 46.04±0.14 44.31±0.18作用時(shí)間，h 24 48 72 IC50，μg/mL RPTN組16.94±0.13＊＊4.05±0.15＊＊#0.66±0.17＊＊#RPN組24.53±0.22＊＊9.32±0.19＊＊#5.92±0.21＊＊#FS組38.10±0.27 30.01±0.29 17.44±0.17

由表2可知，在3個(gè)不同作用時(shí)間點(diǎn)，RPN組和RPTN組的IC50均比相應(yīng)濃度、作用時(shí)間點(diǎn)RS組的IC50?。≒＜0.01）；且在孵育24 h時(shí)，RPTN組、RPN組的細(xì)胞毒性是RS組的3.52倍和2.43倍。在孵育48、72 h時(shí)，RPN組和RPTN組的IC50均比相應(yīng)濃度、作用時(shí)間點(diǎn)FS組的IC50?。≒＜0.05）；且在孵育48 h時(shí)，RPTN組、RPN組的細(xì)胞毒性是FS組的7.41倍和3.22倍。這表明RBG納米粒對(duì)HepG2的細(xì)胞毒性強(qiáng)于RS和FS。

3 討論

由于RBG無(wú)熒光，故無(wú)法直觀(guān)地觀(guān)察RBG納米粒被腫瘤細(xì)胞攝取的情況。本研究制備同時(shí)包載RBG和C6的RCPTN，用以考察HepG2細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取情況。結(jié)果可見(jiàn)，帶熒光的RCPTN分布在細(xì)胞核周?chē)?，直觀(guān)地證明了RCPTN可通過(guò)細(xì)胞攝取作用將RBG和C6同時(shí)帶入肝癌細(xì)胞中，即RPTN也能通過(guò)細(xì)胞攝取作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而發(fā)揮RBG對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用。

本研究首次考察懸浮型細(xì)胞HCa-F對(duì)RCPTN的攝取情況，除HCa-F細(xì)胞形態(tài)與HepG2細(xì)胞不同外，細(xì)胞核周?chē)部梢?jiàn)RCPTN發(fā)出的熒光，證明RCPTN也能被HCa-F細(xì)胞攝取，為后續(xù)其對(duì)荷HCa-F細(xì)胞小鼠的抗腫瘤作用研究奠定了基礎(chǔ)。本課題組前期研究證實(shí)C6溶液無(wú)法被細(xì)胞攝取[13]，同時(shí)由于細(xì)胞的容積是有限的，故納米粒被細(xì)胞攝取量具有飽和性[14]。2種細(xì)胞與含C6的RCPTN在37下孵育4 h后，均需用PBS洗3次，以除去尚未被攝取進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的納米粒，從而證明了熒光顯微鏡下觀(guān)察到的綠色熒光是細(xì)胞內(nèi)的RCPTN所發(fā)出的。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，不同濃度、不同作用時(shí)間下，RPTN、RPN的CV均小于RS，表明RPTN、RPN的體外抗腫瘤活性?xún)?yōu)于RS。與體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)合，RPTN比RS在作用24 h時(shí)具有對(duì)HepG2細(xì)胞更大的毒性是因?yàn)镽BG分子跨膜吸收要經(jīng)過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，進(jìn)入細(xì)胞后又可能在P糖蛋白的作用下而外排，降低了RBG的抑制作用。但RPTN不需要載體轉(zhuǎn)運(yùn)或濃度梯度擴(kuò)散，可直接被HepG2細(xì)胞吞噬而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)溶酶體的作用下材料降解釋放出RBG，既能將藥物聚集在細(xì)胞內(nèi)，又由于材料的緩釋性而延長(zhǎng)藥物在細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間；同時(shí)載體材料PLGA-TPGS中所含的TPGS還可減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)P糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥性（MDR）[15]，故使RBG從納米粒中釋放出來(lái)后能更好地發(fā)揮其對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用。此外，不同濃度、不同作用時(shí)間下，RPTN的CV小于RPN，表明RPTN的體外抗腫瘤活性?xún)?yōu)于RPN。這是因?yàn)镽PTN的載體材料PLGA-TPGS中所含的TPGS可減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)P糖蛋白介導(dǎo)的MDR，改善細(xì)胞膜的滲透性，從而使納米粒更易進(jìn)入細(xì)胞從而發(fā)揮高效的抗腫瘤活性。其次，TPGS與PLGA合成的高分子材料PLGA-TPGS可改善PLGA的水溶性，其在細(xì)胞中釋放更快、更完全，進(jìn)一步增強(qiáng)了RBG的抗腫瘤活性。

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（

Study on the in vitro Cell Uptake and Toxicity of Resibufogenin-loaded PLGA-TPGSNanoparticles

XU Hong1，GAO Meng2，CHU Qiuchen2，DONG Hao2，CHEN Yu3，XU Rongqian3，ZHANG Chenghong1，TIAN Yan2（1.College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China；2.College of Pharmacy，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China；3.Grade 2016 in Clinical Medical Eight Grade，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

OBJECTIVE：To study the in vitro uptake of Resibufogenin（RBG）lactic acid glycolic acid copolymer-water soluble vitamin E（PLGA-TPGS）in human liver cancer HepG2 cells，mouse ascites-type lymphatic metastasis of tumor HCa-F cells，and the toxicity on HepG2 cells.METHODS：RCPTN loading RBG and coumarin-6（C6）were prepared.Fluorescent inverted microscope was used to observe the in vitro uptake by RCPTN HepG2，HCa-F cells.Itwas divided into negative control group，blank PLGA-TPGS nanoparticles（EPTN）group，5-fluorouracil solution（FS）group，RBG solution（RS）group，RBG/PLGA nanoparticles（RPN）group and RPTN group.WST-1 was conducted to investigate the optical density at 450 nm wavelength of HepG2 cells after 24，48，72 h incubated by FS，RS，RPN and RPTN w ith different final concentrations（1.25，2.5，5，10，20μg/m L）；the cell viability（CV）and half inhibitory concentration（IC50）were calculated.RESULTS：RCPTN distributed around the nucleus of HepG2，HCa-F cells.CV was decreased by RBG concentration increased in RPN group and RPTN group，and decreased by time prolonged；compared w ith FS group，CV in RPTN group was decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.IC50of HepG2 cells incubated by FS，RS，RPN and RPTN was decreased by time prolonged，ordered by RS＞FS＞RPN＞RPTN；IC50incubated by RPN and RPTN for 48，72 h was obviously less than that of FS and RS（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：RPTN can deliver RBG into HepG2，HCa-F cells，show ing inhibition effect on HepG2 cellswhich is stronger than RPN，RS and FS.

Resibufogenin；Lactic acid glycolic acid copolymer-water soluble vitam in E；Nanoparticles；Liver cancer HepG2 cells；Ascites-type lymphaticmetastasis of tumor HCa-F cells；Cell uptake；in vitro cytotoxicity

R285

A

1001-0408（2017）16-2252-04

2016-09-18

2017-01-02）

（編輯：鄒麗娟）

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015020308）

＊實(shí)驗(yàn)師。研究方向：藥物制劑、藥理學(xué)、藥效學(xué)。電話(huà)：0411-86110323。E-mail：859133790@qq.com

#通信作者：教授，碩士。研究方向：藥物新制劑、新技術(shù)。電話(huà)：0411-86110420。E-mail：tiany2004@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.25