瑤藥葫蘆鉆中α-葡萄糖苷酶抑制活性部位的篩選Δ

許有瑞，伊 輝，張可鋒，廖 迎，林家遜，段小群（桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004）

瑤藥葫蘆鉆中α-葡萄糖苷酶抑制活性部位的篩選Δ

許有瑞＊，伊 輝，張可鋒，廖 迎#，林家遜，段小群（桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004）

目的：從瑤藥葫蘆鉆中篩選出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的有效部位。方法：將葫蘆鉆水提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同極性部位，分別測定各部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并對篩選出的活性強且得率相對較高的部位進行酶抑制動力學(xué)研究；考察各部位對葡萄糖、蔗糖和淀粉負荷小鼠血糖值的影響（以阿卡波糖片為陽性對照）。結(jié)果：體外酶活性抑制試驗顯示，葫蘆鉆乙酸乙酯部位[得率為0.40%、酶活性抑制率為（72.90±2.85）%]具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且呈現(xiàn)出劑量依賴的快速非競爭性可逆抑制類型。體內(nèi)耐糖量實驗結(jié)果表明，阿卡波糖片和葫蘆鉆各部位對葡萄糖負荷小鼠的血糖值均沒有影響（P＞0.05），而阿卡波糖片和葫蘆鉆乙酸乙酯部位能降低蔗糖負荷小鼠30、60m in的血糖值以及淀粉負荷小鼠30、60、120 min的血糖值（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：乙酸乙酯部位是瑤藥葫蘆鉆中α-葡萄糖苷酶抑制活性的有效部位。

瑤藥；葫蘆鉆；α-葡萄糖苷酶抑制劑；不同極性部位；小鼠；耐糖量實驗

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）是一類酶的總稱，其能從含有α-糖苷鍵的底物中催化水解α-葡萄糖基，主要存在于小腸刷狀緣膜上皮細胞中，能夠?qū)㈦p糖或多糖水解為可以被小腸吸收的單糖，是食物中碳水化合物水解的關(guān)鍵酶。因此，抑制該酶可以有效地減少食物中碳水化合物的吸收，一定程度改善餐后高血糖的癥狀[1]。

葫蘆鉆為天南星科石柑屬石柑子[Pothos chinensis（Raf.）Merr.]的全草，系傳統(tǒng)瑤藥“十八鉆”之一，又名上樹葫蘆、石葫蘆茶、藤桔、柚子楓、石蒲藤等，主要分布于廣東、廣西、貴州、四川、云南等地[2]。其味淡、澀，性涼，在瑤醫(yī)用藥中屬“風(fēng)打相兼”類，具清熱解毒、涼血止血、利尿消肌等功效，是我國南方瑤、壯等少數(shù)民族常用的藥材之一[3-4]。有關(guān)葫蘆鉆化學(xué)成分的研究表明，其含有酚酸等有機酸類[5-7]、黃酮碳苷類[8]、揮發(fā)油[9]、蒽醌、香豆素、萜類等化合物[10-11]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗腫瘤[12]、抗氧化[13-14]、降血糖[15]等作用，然而尚缺乏對其更深入的作用機制及相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。鑒于此，本研究結(jié)合體外酶抑制活性試驗與體內(nèi)糖耐量實驗從葫蘆鉆中篩選出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的有效部位，為進一步從中提取分離α-葡萄糖苷酶抑制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-1750型紫外-可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）；PHS-2C型pH計（上海三信儀表廠）；電子天平（上海梅特勒公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

葫蘆鉆購于桂林市六合路中草藥市場，由桂林醫(yī)學(xué)院張可鋒講師鑒定為天南星科石柑屬石柑子[Pothos chinensis（Raf.）Merr.]的全草；阿卡波糖片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ14499，規(guī)格：50mg/片）；α-葡萄糖苷酶（10U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）購自美國Sigma公司；葡萄糖測試試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：143291）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級健康KM小鼠，♂，體質(zhì)量為（20±2）g，由蘭州大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2009-0004。

2 方法

2.1 葫蘆鉆各部位的提取與分離

取干燥葫蘆鉆2 kg，切碎，按藥材與蒸餾水1∶10（m/ V）的比例加熱回流提取7次，每次1.5 h，合并提取液，抽濾，減壓濃縮至2 L。取100m L濃縮液真空干燥，其余濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，低溫真空干燥得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水部位（依次簡稱為PF、EAF、nBF、WF），稱質(zhì)量、計算得率。

2.2 葫蘆鉆各部位對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

以PNPG為底物，利用α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG產(chǎn)生對硝基酚（PNP），以一定時間內(nèi)反應(yīng)體系中PNP的含量變化來計算樣品提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。具體按如下反應(yīng)體系[16]進行：取0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液2 m L，加入待測樣品提取物100μL與PNPG（終濃度為2mmol/L），然后加入α-葡萄糖苷酶0.05 U，37反應(yīng)15 m in后，加入0.1 mol/L碳酸鈉（Na2CO3）溶液4m L終止反應(yīng)。在397 nm波長處測定吸光度（A）值，計算酶活性抑制率{[A0－（A1－A2）]/A0× 100%，A0：空白，即不加樣品反應(yīng)后的A值；A1：加入樣品反應(yīng)后的A值；A2：背景，即只加樣品的A值}。

2.3 EAF的酶抑制動力學(xué)試驗

在EAF質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg/m L時，測定其酶抑制活性，考察EAF不同質(zhì)量濃度對酶活性的影響；在EAF質(zhì)量濃度為5mg/m L的條件下，分別測定反應(yīng)時間為1、3、5、10、15、20m in的酶抑制活性，考察EAF不同反應(yīng)時間對酶活性的影響；在酶濃度為0.24、0.36、0.48、0.60 U/m L時測定EAF質(zhì)量濃度分別為0、5mg/m L時的酶抑制活性，考察其抑制作用的可逆性；取0.5、1、1.7、2mmol/L 4個濃度的PNPG與1、2、5 mg/m L 3個質(zhì)量濃度的EAF，分別測定反應(yīng)速率，由Lineweaver Burk作圖法繪制EAF的酶抑制動力學(xué)曲線，考察其抑制作用類型。

2.4 葫蘆鉆各部位對小鼠耐糖量的影響實驗

將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照體質(zhì)量大小編號，依據(jù)隨機數(shù)字表將其分成16組，每組10只，分別為1個正常組、3個阿卡波糖片組（25mg/kg）、3個生理鹽水組、3個葫蘆鉆EAF組（75 mg/kg）、3個葫蘆鉆nBF組（75 mg/kg）和3個葫蘆鉆WF組（75mg/kg），分別進行葡萄糖、蔗糖和淀粉耐糖量實驗。試驗前禁食12 h，然后ig受試藥物（10m L/kg）與葡萄糖（2 g/kg）或蔗糖（4 g/kg）或淀粉（6 g/kg）。分別在給藥后30、60、120min時經(jīng)眼眶靜脈采血，按試劑盒說明書方法測定血糖值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 葫蘆鉆各部位的得率與酶活性抑制率測定結(jié)果

葫蘆鉆各部位的得率與酶活性抑制率測定結(jié)果見表1。

表1 葫蘆鉆各部位的得率與酶活性抑制率測定結(jié)果（n＝3，%%）Tab 1 Resultsof yield rateand enzymeactivity inhibition rateofeach part from P.chinensis（n＝3，%%）

由表1可知，葫蘆鉆各部位中WF的得率最大，PF的得率最小，分別占總提物的80%和1%；葫蘆鉆EAF和nBF的得率分別為0.40%和0.67%，分別占總提物的7%和12%，可見葫蘆鉆中主要含強極性成分。但對α-葡萄糖苷酶的抑制活性則是隨著極性漸大而漸小，即WF的酶抑制活性最弱，而弱極性的PF和EAF則活性最強。此外，由于PF的活性雖然最強，但得率太低，故選擇EAF作為后續(xù)酶抑制動力學(xué)試驗的研究對象。

3.2 EAF的酶抑制動力學(xué)試驗結(jié)果

EAF的酶抑制動力學(xué)試驗結(jié)果詳見圖1。

圖1 EAF的酶抑制動力學(xué)試驗結(jié)果Fig 1 Resu ltsof enzym e inhibition kinetic test

由圖1A可知，EAF的酶活性抑制率隨EAF質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，且呈濃度依賴關(guān)系，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.74mg/m L。由圖1B可知，當(dāng)EAF的質(zhì)量濃度為5mg/m L時，可快速抑制酶活性，且在1m in內(nèi)酶活性抑制率就可以達到最大值，之后稍呈下降趨勢。由圖1C可知，EAF對酶抑制類型屬可逆性抑制。由圖1D可知，EAF對酶的抑制呈非競爭性抑制類型，米氏常數(shù)Km＝1.43mmol/L。

3.3 葫蘆鉆各部位對小鼠耐糖量的影響測定結(jié)果

葫蘆鉆各部位對小鼠耐糖量的影響測定結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠耐糖量實驗測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Resultsof glucose tolerance test inm ice of each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠耐糖量實驗測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Resultsof glucose tolerance test inm ice of each group（±s，n＝10）

注：分別與各類型耐糖量實驗中的生理鹽水組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.normal saline group in each type of glucose tolerance test respectively，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

120min 5.421±0.619 8.035±0.687 8.348±0.793 8.425±0.934 7.962±0.571 7.284±0.748 7.167±0.580＊9.332±0.813 7.586±0.794 9.474±0.896 9.492±0.867 6.701±0.841＊＊7.783±0.770 6.952±0.672＊7.907±0.847 8.034±0.728糖類型空白葡萄糖劑量，mg/kg血糖值，mmol/L 25蔗糖75 75 75 25淀粉組別正常組阿卡波糖片組生理鹽水組EAF組nBF組WF組阿卡波糖片組生理鹽水組EAF組nBF組WF組阿卡波糖片組生理鹽水組EAF組nBF組WF組75 75 75 25 75 75 75 30min 5.319±0.642 13.394±0.862 13.724±1.065 13.637±1.239 12.915±0.994 12.586±1.028 8.352±0.601＊＊11.871±0.726 8.754±0.656＊＊10.391±0.948 10.735±0.911 7.942±0.734＊＊10.196±0.981 8.210±0.844＊＊9.924±0.739 10.047±0.872 60min 5.570±0.547 10.617±1.128 10.491±0.817 10.480±0.772 10.011±0.948 9.743±0.902 7.809±0.834＊＊10.816±0.892 8.152±0.773＊9.735±0.832 10.207±0.985 7.367±0.861＊＊8.572±0.890 7.428±0.738＊＊8.761±0.856 8.642±0.621

由表2可知，在葡萄糖耐糖量實驗中，阿卡波糖片和葫蘆鉆各部位對葡萄糖負荷小鼠的血糖值均沒有影響（P＞0.05）；而在蔗糖耐糖量實驗中，阿卡波糖片和EAF均能夠降低蔗糖負荷小鼠30、60min時的血糖值（P＜0.05或P＜0.01）；同樣在淀粉耐糖量實驗中，阿卡波糖片和EAF也能夠降低淀粉負荷小鼠30、60、120min時的血糖值（P＜0.05或P＜0.01）。本研究結(jié)果與體外酶活性抑制試驗篩選結(jié)果相一致，葫蘆鉆各部位中EAF在耐糖量實驗中的活性也最強，同時也可初步判斷其是通過抑制腸道內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性來發(fā)揮降血糖作用。

4 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠有效地降低餐后高血糖，可用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治。因此，自從第一個α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥——阿卡波糖片上市后，國內(nèi)外研究者開始從天然產(chǎn)物中篩選更安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，包括黃酮類、生物堿類、多糖類和多酚類等化合物[17]。本研究結(jié)合體外α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗與體內(nèi)耐糖量實驗對葫蘆鉆中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分進行了篩選，體內(nèi)外結(jié)果一致表明其活性成分主要存在于EAF，且EAF對酶的抑制呈非競爭性抑制類型。

由于葡萄糖是單糖，可直接在胃腸道內(nèi)吸收，所以不受α-葡萄糖苷酶抑制劑的影響；而作為雙糖的蔗糖和多糖的淀粉，二者必須由α-葡萄糖苷酶水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖才能被吸收。因此，在耐糖量實驗中，陽性藥物阿卡波糖片和葫蘆鉆EAF對葡萄糖耐糖量實驗中小鼠的血糖值均沒有影響，而對蔗糖和淀粉耐糖量實驗中小鼠的血糖值具有顯著的降低作用，這也說明葫蘆鉆EAF和阿卡波糖片的體內(nèi)降血糖作用機制相似。

此外，覃振林等[15]采用四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型和葡萄糖致高血糖小鼠模型研究了葫蘆鉆不同提取物的降血糖活性，結(jié)果水提醇沉（95%乙醇）后的上清液和沉淀物均可明顯降低兩種模型小鼠的血糖值，而70%乙醇提取物卻無此作用。可見，葫蘆鉆中既存在弱極性的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的降血糖成分，還存在強極性的具有其他作用機制的活性成分，對其降血糖機制還需更加深入的研究。

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Screening of theα-G lucosidase Inhibitory Active Part from Yao M edicine Pothos chinensis

XU Yourui，YIHui，ZHANG Kefeng，LIAO Ying，LIN Jiaxun，DUAN Xiaoqun（School of Pharmacy，Guilin Medical University，Guilin 541004，China）

OBJECTIVE：To screen theα-glucosidase inhibitory active part from Pothos chinensis.METHODS：The aqueous extractions of P.chinensis were extracted by petroleum，ethyl acetate，n-butyl alcohol in turn to obtain different polarparts.Effect of each part onα-glucosidase inhibitory activity was determ ined，and enzyme inhibition kinetics was conducted for the screened parts w ith strong activity and relatively high yield rate；effects of each part on blood glucose level ofm ice loaded w ith glucose，sucrose and starch were respectively determined（using Acacoside tablet as positive control）.RESULTS：Enzyme inhibition kinetics in vitro showed the ethyl acetate part[yield rate was 0.40%，enzyme activity inhibition ratewas（72.90±2.85）%]had strongα-glucosidase inhibitory activity and showed a dose-dependent，fast，non-competitive and reversiblemodel.Results of in vivo glucose tolerance indicated that Acacoside tablet and each part of P.chinensis had no effects on blood glucose level of glucose-loaded mice（P＞0.05）；while Acacoside tablet and ethyl acetate part in P.chinensis could reduce 30，60 m in blood glucose level of sucroseloaded mice and 30，60，120 m in blood glucose level of starch-loaded mice（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Ethyl acetate part is theα-glucosidase inhibitory active part from Yaomedicine P.chinensis.

Yaomedicine；Pothos chinensis；α-glucosidase inhibitor；Different polar parts；M ice；Glucose tolerance test

R963

A

1001-0408（2017）16-2235-03

2016-08-21

2017-03-01）

（編輯：林 靜）

桂林醫(yī)學(xué)院高層次人才科研啟動項目（No. KY2014016）

＊講師，博士。研究方向：中藥活性成分的研究與開發(fā)。電話：0773-2303446。E-mail：xuyourui@sina.com

#通信作者：實驗師。研究方向：中藥活性成分。電話：0773-2303446。E-mail：849169006@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.20