山銀花水提物體外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究Δ

陳 靈，周艷萌，歐水平，任 麗（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，貴州遵義 56000；.遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫實驗室，貴州遵義 56006；.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 56000；.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 56006）

山銀花水提物體外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究Δ

陳 靈1＊，周艷萌2，歐水平3，任 麗4（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫實驗室，貴州遵義 563006；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563000；4.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563006）

目的：考察山銀花水提物（SYHW）體外抗甲型H1N1流感病毒（H1N1病毒）的作用。方法：以H1N1病毒感染體外培養(yǎng)的犬腎小管上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞），計算病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）；以不同質(zhì)量濃度SYHW作用MDCK細(xì)胞24 h，考察其最大無毒濃度。然后將試驗分為正常細(xì)胞組、病毒對照組和SYHW預(yù)防給藥組、治療給藥組和直接殺滅給藥組（均給予最大無毒濃度的SYHW，并以100 TCID50H1N1病毒感染細(xì)胞），測定SYHW的抗病毒有效率（ER）；將試驗分為正常細(xì)胞組、病毒對照組和SYHW治療給藥組、直接殺滅給藥組（給藥及病毒感染方法同上），分別測定細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）和細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果：H1N1病毒的100 TCID50為1.26×10－7，SYHW對MDCK細(xì)胞的最大無毒濃度為50μg/m L（細(xì)胞存活率為91.3%）。SYHW預(yù)防給藥組、SYHW治療給藥組和SYHW直接殺滅給藥組的ER分別為0、80.3%、52.7%。與正常細(xì)胞組比較，病毒對照組細(xì)胞的PI值顯著降低（P＜0.05），早期、晚期凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與病毒對照組比較，SYHW直接殺滅給藥組細(xì)胞的PI值顯著升高、早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），SYHW治療給藥組細(xì)胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：SYHW具有體外抗H1N1病毒的作用，且以治療給藥和直接殺滅給藥抗病毒作用較好。

山銀花；水提物；MDCK細(xì)胞；甲型H1N1流感病毒；體外

流行性感冒（簡稱“流感”）是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染病，以急起高熱、全身酸痛、乏力并伴輕度呼吸道癥狀為臨床特點。在各型流感病毒中，宿主范圍最廣、對人類健康影響最大的是甲型流感病毒[1]。目前，治療流感的化學(xué)藥主要有抗病毒藥阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林（病毒唑）等，這類藥通常副作用較多[2]。山銀花為灰氈毛忍冬（Loniceraemacranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（LonicerahypoglaucaMiq.）、華南忍冬（LoniceraconfusaDC.）或黃褐毛忍冬（Lonicerae fuluotomentosaHsuetS.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花[3]，具有抗炎、抗菌[4]、抗病毒、抗氧化[5]、抗動脈粥樣硬化[6]等作用，其因清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效而被臨床廣泛應(yīng)用。有研究表明，山銀花中酚酸類成分及綠原酸類提取物具有抗病毒活性[7-9]，咖啡酰奎寧酸類化合物具有抗呼吸道病毒感染作用[10]，黃酮提取物具有體外抗偽狂犬病毒的作用[11]。目前，尚未見山銀花體外抗甲型H1N1流感病毒（簡稱“H1N1病毒”）作用的研究報道，故本研究擬對山銀花水提物（簡稱“SYHW”）的體外抗H1N1病毒的作用進行研究，為其抗病毒應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BX43倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CFM-300E熒光顯微鏡（上海萬衡精密儀器有限公司）；Multiskan-FC酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；TDZ4-WS低速離心機（上海盧湘離心機儀器有限公司）；Gallios流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 藥材與試劑

山銀花采摘于貴州省綏陽縣，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室主任楊建文教授鑒定為灰氈毛忍冬（Lonicerae macranthoidesHard.-Mazz.）的干燥花蕾；RPMI1640培養(yǎng)基（上海立菲生物技術(shù)有限公司，批號：AAK208935）；胰蛋白酶、MTT、AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：1030E042、1028D051、2015D420）。

1.3 細(xì)胞和病毒

犬腎小管上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）、H1N1病毒及9～10日齡雞胚均由遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供。

2 方法

2.1 SYHW的制備

稱取山銀花500g，加10倍量水煎煮1.5h，過濾；濾渣加8倍量水煎煮1h，過濾；合并2次濾液，濃縮至500 mL，得質(zhì)量濃度為1g/mL（以生藥計）的SYHW。

2.2 H1N1病毒的傳代增殖

選擇9～10日齡健康雞胚，將0.2mLH1N1病毒液注入尿囊腔內(nèi)，48h后，收集尿囊液。按照文獻(xiàn)[12]中方法，將H1N1病毒液進行倍比稀釋，測得其凝血效價為1∶1280。

2.3 H1N1病毒對MDCK細(xì)胞的毒性作用測定

將生長旺盛的MDCK細(xì)胞消化成單個細(xì)胞懸液，按2×104個/孔接種于96孔板中，每孔100μL，在37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長滿單層后，棄上清，然后將凝血效價為1∶1280的病毒液用維持液2（含0.02%胰酶的RPMI1640培養(yǎng)基）倍比稀釋10～1010倍后分別加入培養(yǎng)孔中，每個濃度重復(fù)10孔，每孔100μL；同時設(shè)正常對照組（不加病毒，只加維持液2）。放入培養(yǎng)箱中感染1.5h后，小心吸棄各孔病毒液，換用維持液1（含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)72h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，并記錄病變程度及孔數(shù)，計算被感染細(xì)胞比例，根據(jù)Karber公式計算病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50），以病毒的100TCID50來進行后續(xù)研究。

2.4 SYHW對MDCK細(xì)胞的毒性作用測定

將生長旺盛的MDCK細(xì)胞消化成單個細(xì)胞懸液后，按1×104個/孔接種于96孔板中，每孔100μL，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄上清，加入質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL的SYHW，每個質(zhì)量濃度重復(fù)10孔，每孔100 μL；并設(shè)置正常細(xì)胞組（不加藥物）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加2滴維持液1和10μLMTT溶液，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩均勻后，在酶標(biāo)儀上（測定波長為492nm）測定各孔的光密度（OD）值，計算細(xì)胞存活率[13]：細(xì)胞存活率（%）＝給藥組平均OD值/正常細(xì)胞組平均OD值×100%，找出SYHW的最大無毒濃度。

2.5 SYHW體外抗H1N1病毒作用測定

將生長旺盛的MDCK細(xì)胞消化成單個細(xì)胞懸液后，按1×104個/孔接種于96孔板中，于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將試驗分為正常細(xì)胞組、病毒對照組和SYHW的預(yù)防給藥、治療給藥、直接殺滅給藥組，每組均重復(fù)6孔，再設(shè)1個空白孔。正常細(xì)胞組（每個給藥組均平行設(shè)置）：不用病毒進行感染也不加入藥物。病毒對照組（每個給藥組均平行設(shè)置）：加入100TCID50的H1N1病毒液（100μL/孔），于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SYHW預(yù)防給藥組：先將最大無毒濃度的SYHW加入培養(yǎng)孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液；然后再加入100TCID50的H1N1病毒液（100μL/孔），于37、5%CO2培養(yǎng)箱中感染1.5 h；然后再換為相應(yīng)質(zhì)量濃度的SYHW，培養(yǎng)至病毒對照組MDCK細(xì)胞出現(xiàn)最大程度病變?yōu)橹筟12-13]。SYHW治療給藥組：先將100TCID50的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培養(yǎng)箱中感染1.5h后棄去病毒液；然后再加入最大無毒濃度SYHW（100μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對照組MDCK細(xì)胞出現(xiàn)最大程度病變?yōu)橹?。SYHW直接殺滅給藥組：先將最大無毒濃度SYHW與100TCID50H1N1病毒液按1∶1混合后加入培養(yǎng)孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h，棄去混合液；然后加入維持液1繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對照組MDCK細(xì)胞出現(xiàn)最大程度病變?yōu)橹埂２捎肕TT法測定各孔OD值（測定波長為492nm），計算SYHW的抗病毒有效率（ER）[14]：ER（%）＝（給藥組平均OD值－病毒對照組平均OD值）（/正常細(xì)胞組平均OD值－病毒對照組平均OD值）×100%。

2.6 SYHW對H1N1病毒感染MDCK細(xì)胞周期的影響

將生長旺盛的MDCK細(xì)胞按1×104個/孔接種于6孔板中，于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，分別設(shè)置正常細(xì)胞組、病毒對照組和SYHW的治療給藥、直接殺滅給藥組，每個濃度重復(fù)3孔，處理方法同“2.5”項。培養(yǎng)結(jié)束后收集上清液，用胰酶（未加乙二胺四乙酸）消化細(xì)胞。將細(xì)胞懸液及上清液混合，離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，然后將細(xì)胞滴入70%冷乙醇中固定，－20冰箱保存?zhèn)錂z。檢測前取出樣品離心，用冷PBS洗滌3次后，按照1×106個細(xì)胞加1m L碘化丙啶（PI）染液，避光染色至少30min，流式細(xì)胞儀上機檢測。用M cycle軟件檢測細(xì)胞周期分布，計算細(xì)胞增殖指數(shù)（PI，%）：S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

2.7 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞凋亡的影響

將生長旺盛的MDCK細(xì)胞按1×104個/孔接種于6孔板中，于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照“2.6”項下分組、給藥。結(jié)束培養(yǎng)后收集上清液，并用胰酶（未加乙二胺四乙酸）消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液及上清液混合，離心，PBS洗2次，根據(jù)AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 H 1N1病毒對MDCK細(xì)胞的毒性作用測定結(jié)果

H1N1病毒感染MDCK細(xì)胞后細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、壁增厚、脫落以及折光性增強等細(xì)胞病變現(xiàn)象，根據(jù)Karber公式計算病毒的TCID50為1.26×10－9，100 TCID50為1.26×10－7。MDCK細(xì)胞感染H1N1病毒后細(xì)胞形態(tài)的變化見圖1。

圖1 MDCK細(xì)胞感染H1N1病毒后細(xì)胞形態(tài)的變化Fig 1 Cellm orphology changes of MDCK cells after infected by H 1N1 virus

3.2 SYHW對MDCK細(xì)胞的毒性作用測定結(jié)果

當(dāng)SYHW質(zhì)量濃度≥100μg/m L時，SYHW組的OD值與正常細(xì)胞組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明當(dāng)SYHW質(zhì)量濃度≥100μg/m L時對細(xì)胞有明顯毒性。故其最大無毒濃度為50μg/m L，此時細(xì)胞存活率為91.3%，結(jié)果詳見表1。

表1 SYHW對MDCK細(xì)胞的毒性作用測定結(jié)果（n＝10）Tab 1 Determ ination results of toxic effect of SYHW on MDCK cells（n＝10）

3.3 SYHW抗H 1N1病毒作用測定結(jié)果

病毒對照組OD值較正常細(xì)胞組OD值顯著降低（P＜0.05）；SYHW治療給藥后細(xì)胞OD值顯著升高（P＜0.05），SYHW治療給藥組、直接殺滅給藥組ER分別為80.3%、52.7%，SYHW對H1N1病毒感染無預(yù)防作用，結(jié)果詳見表2。

表2 SYHW抗H 1N1病毒作用測定結(jié)果（n＝6）Tab 2 Determ ination resultsof anti-H1N1 viruseffect of SYHW（n＝6）

3.4 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞周期的影響情況

與正常細(xì)胞組比較，病毒對照組細(xì)胞PI值顯著降低（P＜0.05）；與病毒對照組比較，SYHW直接殺滅給藥組細(xì)胞PI值顯著升高（P＜0.05），結(jié)果詳見表3。

3.5 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞凋亡的影響情況

與正常細(xì)胞組比較，病毒對照組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。與病毒對照組比較，SYHW治療給藥組細(xì)胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），然而晚期凋亡率繼續(xù)升高（P＜0.05）；SYHW直接殺滅給藥組細(xì)胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），晚期凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果詳見表4。

表3 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞周期的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of SYHW on cell cycle of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

表3 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞周期的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of SYHW on cell cycle of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

注：與正常細(xì)胞組比較，＊P＜0.05；與病毒對照組比較，#P＜0.05Note：vs.normal cell group，＊P＜0.05；vs.virus control group，#P＜0.05

PI，% 60.85±0.03 39.07±0.03＊45.77±0.03 50.60±0.02#組別正常細(xì)胞組病毒對照組SYHW治療給藥組SYHW直接殺滅給藥組質(zhì)量濃度，μg/mL細(xì)胞比例，% S 005 0 50 G0/G139.00±3.00 60.95±2.51 54.24±3.07 49.41±1.83 28.44±3.06 30.57±5.38 18.66±6.61 30.23±0.66 G2/M 32.41±3.01 8.50±5.69 27.11±4.52 20.37±1.30

表4 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）Tab 4 Effects of SYHW on apoptosis of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

表4 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）Tab 4 Effects of SYHW on apoptosis of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

注：與正常細(xì)胞組比較，＊P＜0.05；與病毒對照組比較，#P＜0.05Note：vs.normal cell group，＊P＜0.05；vs.virus control group，#P＜0.05

晚期凋亡率，% 0.23±0.15 0.30±0.26＊4.30±0.17#1.90±2.90組別正常細(xì)胞組病毒對照組SYHW治療給藥組SYHW直接殺滅給藥組質(zhì)量濃度，μg/mL 005 0 50早期凋亡率，% 6.73±1.24 41.70±2.21＊17.37±2.37#27.80±6.04#

4 討論

依據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，山銀花臨床用量為6～15 g[3]，以人體平均體液50 L計算，得到臨床實際用藥濃度。以此為參考，設(shè)置系列等比濃度篩選SYHW最大無毒濃度進行試驗。結(jié)果顯示，細(xì)胞耐受的最大無毒濃度（50μg/m L）遠(yuǎn)低于人體耐受的最大無毒濃度（300μg/m L）。本研究采用3種給藥方式考察SYHW的體外抗病毒作用，其中直接殺滅給藥組設(shè)置的目的是確定SYHW直接作用于H1N1病毒后是否具有抑制作用，同時設(shè)置SYHW預(yù)防給藥組和SYHW治療給藥組進一步明確SYHW抗H1N1病毒的作用是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外。

抗病毒試驗結(jié)果顯示，SYHW具有直接抑制H1N1病毒活性的作用（ER＝52.7%），且SYHW治療給藥組ER較病毒對照組顯著降低，這提示SYHW在細(xì)胞內(nèi)抗H1N1病毒療效較好，預(yù)示其可能對H1N1病毒有一定的治療作用，而無預(yù)防作用。故在細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡試驗中也只采用SYHW治療給藥和直接殺滅給藥兩種給藥方式進行試驗。結(jié)果顯示，H1N1病毒感染MDCK細(xì)胞后將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，阻礙細(xì)胞正常生長，且會引起細(xì)胞早期凋亡。SYHW作用于被H1N1病毒感染的MDCK細(xì)胞后，可逆轉(zhuǎn)流感病毒引起的G0/G1期細(xì)胞阻滯，促進已被H1N1病毒感染的MDCK細(xì)胞進入S期，從而促進細(xì)胞有絲分裂，提高PI值。

綜上所述，SYHW具有體外抗H1N1病毒的作用，且以治療給藥和直接殺滅給藥抗病毒作用較好。但山銀花化學(xué)成分較多，其發(fā)揮抗病毒作用的有效成分及作用機制還有待進一步研究。

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Study on the Anti-influenza A Virus H 1N1 Effect of Aqueous Extraction of Lonicerae Flos in vitro

CHEN Ling1，ZHOU Yanmeng2，OU Shuiping3，REN Li4（1.Drug Clinical Trial Institution of the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi563000，China；2.M icrobiology and Immunology Laboratory of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi563006，China；3.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi 563000，China；4.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563006，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of aqueous extraction of Lonicerae Flos（SYHW）on anti-influenza A virus H1N1（H1N1 virus）in vitro.METHODS：Using Madin-Darby canine kid ney（MDCK）cells cultured in vitro by H1N1 virus，half of the tissue culture infection dose（TCID50）was calculated.Culturing MDCK cells for 24 h w ith differentmass concentrations of SYHW，themaximum non-toxic concentration was investigated.And then test was divided into normal cell group，virus control group，SYHW preventive adm inistration group，therapeutic adm inistration group and direct killing group（given SYHW of maximum non-toxic concentration，infecting cells by 100 TCID50H1N1 virus），and antiviral effective rate（ER）of SYHW was determ ined.Testwas divided into normal cell group，virus control group，SYHW therapeutic group and direct killing group（the same adm inistration and infection as above），changes of cell proliferation index（PI）and cell apoptosis rate were respectively determ ined.RESULTS：100 TCID50of H1N1 virus was 1.26×10－7，and themaximum non-toxic concentration of SYHW on MDCK cells was 50μg/m L（cell survival rate was 91.3%）.ERs of preventive administration group，therapeutic administration group and direct killing group were 0，80.3%and 52.7%，respectively.Compared w ith normal cell group，PI value in virus control group was significantly reduced（P＜0.05），early and late apoptotic rates were significantly increased（P＜0.05）.Compared w ith virus control group，PI value in directly killing group was significantly increased（P＜0.05），and early apoptotic rate was significantly reduced（P＜0.05）；early apoptotic rates in therapeutic adm inistration group were significantly reduced（P＜0.05）.CONCLUSIONS：SYHW shows anti-H1N1 virus effect in vitro，therapeutic adm inistration and directly killing are preferred in antiviral effect.

Lonicerae Flos；Aqueous extraction；MDCK cell；Influenza A virus H1N1；in vitro

R285

A

1001-0408（2017）16-2194-04

2016-09-09

2017-04-17）

遵義市科技計劃項目（No.遵市科合社字〔2011〕26號）

＊主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥劑學(xué)、藥事管理學(xué)。電話：0851-8608210。E-mail：1551062041@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.09