米糠蛋白提取工藝優(yōu)化研究

張金建，趙優(yōu)萍，唐思煜，蔡成崗，2，3，毛建衛(wèi)，2，3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

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米糠蛋白提取工藝優(yōu)化研究

張金建1，趙優(yōu)萍1，唐思煜1，蔡成崗1，2，3，毛建衛(wèi)1，2，3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

采用超聲輔助酶法提取米糠蛋白，并對蛋白質(zhì)的氨基酸組成進(jìn)行了初步的分析。結(jié)果表明，以纖維素酶提取米糠蛋白效果較好，其最佳工藝條件為提取溫度60 ℃ 、提取時(shí)間5 h、料液質(zhì)量體積比1∶9、pH值5.0、纖維素酶添加量0.5%，在此條件下米糠蛋白提取率達(dá)到63.11%。超聲波輔助纖維素酶法提取的米糠蛋白含有17種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸；最高的3種為谷氨酸、賴氨酸和亮氨酸，含量最少的為脯氨酸、蛋氨酸和酪氨酸。研究結(jié)果可作為米糠蛋白提取的參考。

米糠蛋白；酶法提?。还に噧?yōu)化

中國每年的米糠產(chǎn)量為1 400多萬t，居世界之首。米糠中含有30%～40%的淀粉、12%～18%的蛋白質(zhì)、13%～22%的脂肪、23%～30%膳食纖維、8%～12%的灰分、7%～14%水分,以及豐富的維生素和礦物質(zhì)[1-3]，其開發(fā)潛力巨大，但目前精深加工不足。米糠蛋白由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白組成，其中所含的氨基酸組成比例接近人體需要。米糠蛋白還具有其獨(dú)特的性質(zhì)，如低過敏性，根據(jù)其低過敏的性質(zhì)，常被用作嬰幼兒食品原料。同時(shí)，它還具有良好的乳化、溶解、穩(wěn)定等應(yīng)用特性，在嬰兒配方食品、功能食品、功能性多肽等行業(yè)，以及焙烤食品、咖啡、糖果、醬料和其他調(diào)味品等產(chǎn)品形式中得到廣泛應(yīng)用[4-6]。米糠蛋白的低過敏性凸顯了其應(yīng)用潛力。

目前提取米糠蛋白的方法包括堿法[7]、物理法和酶法[8-12]，采用輔助手段包括超聲波等方法[13]。其中，堿法中過高的pH值會破壞蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性，對產(chǎn)品風(fēng)味、色澤等理化性質(zhì)也有不利影響；物理法如采用膠體磨等超微粉碎裝置提取米糠蛋白，則效率低、設(shè)備投入大；酶法提取可以將蛋白質(zhì)適度降解為活性肽，有利于胃腸道的消化和吸收，具有工業(yè)化的潛力[14-15]。綜合考慮上述方法的優(yōu)劣后，筆者運(yùn)用超聲波輔助水酶法提取米糠蛋白，在采用不同酶的條件下選取優(yōu)質(zhì)酶，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)以作優(yōu)化，以期為米糠蛋白的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮米糠(浙江恒樂糧食有限公司)，脫脂后冷藏備用。氫氧化鈉(上海阿拉丁生化科技股份限公司)，考馬斯亮藍(lán)G250(上海邁坤化工有限公司)、葡萄糖(廣州市德松化工有限公司)、尿素(天津市鼎盛鑫化工有限公司)，以及5種酶制劑，試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4(金壇市天瑞儀器有限公司)，博訊BSD-YF3600立式雙層智能精密恒溫?fù)u床(上海百典儀器有限公司)，上海雷磁PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)，UV-1100紫外分光光度儀(上海美普達(dá)有限公司)，離心機(jī)TDL-20B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，L-8900全自動氨基酸測定儀(日本日立公司)，600 W超聲波清洗器(北京科璽超聲波清洗機(jī)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠蛋白提取的工藝流程

米糠蛋白超聲波輔助水酶法提取工藝流程為：將脫脂米糠粉碎→按照一定料液質(zhì)量體積比加入蒸餾水→攪拌→超聲提取→80 ℃條件下使酶失活10 min→8 000 r/min 離心20 min→40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→去離子水定容測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 酶的選擇 稱取脫脂米糠20 g，在料液質(zhì)量體積比1∶8，提取時(shí)間為4 h，反應(yīng)溫度為60 ℃，以及pH值為5.0的條件下，300 W的超聲功率提取20 min，考察酶的選擇對提取效率的影響：加入1%纖維素酶(最適溫度為45～65 ℃、最適pH值為4.0～5.5)，1%木瓜蛋白酶(最適溫度為50～60 ℃ 、最適pH值為5.0～7.0)，1%中性蛋白酶(最適溫度為40～60 ℃ 、最適pH值為6.0～8.0)，1%復(fù)合蛋白酶(最適溫度為35～60 ℃ 、最適pH值為5.5～7.5)和1%堿性蛋白酶(最適溫度為50～60 ℃、最適pH值為8.0～9.0)。

1.3.2.2 其他條件的優(yōu)化 在上述基本試驗(yàn)條件不變的情況下，采用纖維素酶，分別以料液質(zhì)量體積比1∶5、1∶6、1∶8、1∶9、1∶10，酶解時(shí)間60、120、180、240、300 min，酶解溫度20、30、40、50、60 ℃，酶解pH值 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，加酶量0%、0.125%、0.25%、0.5%、1%為因素，對脫脂米糠進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過選取酶解時(shí)間、酶解溫度和料液質(zhì)量體積比3個影響較大的因素作為變量，設(shè)計(jì)L9(3)3正交試驗(yàn)，通過正交試驗(yàn)選取更優(yōu)的米糠蛋白提取工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

1.3.4 可溶性蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法：測定的蛋白質(zhì)總含量除去加入的酶含量即為提取的米糠蛋白的含量。

1.3.5 米糠蛋白氨基酸組成分析

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定方法》測定游離氨基酸。配制6 mol/L的HCl溶液，稱量50 mg蛋白樣品于100 mL燒杯中，在燒杯中加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液，充入N2，用耐高溫的橡膠套袋進(jìn)行真空密封，將其放在干燥箱中，保持溫度在110 ℃的條件下水解24 h，在常溫下冷卻，用去離子水定容至100 mL，量取5 mL樣液進(jìn)行真空冷凍干燥，加入3 mL 0.02 mol/L HCl溶液，震蕩使其充分溶解，再進(jìn)行抽濾，取液體通過0.22 μm濾膜，以氨基酸自動分析儀進(jìn)行分析。按照上述方法對纖維素酶中氨基酸含量進(jìn)行檢測作為對照，以除去酶對米糠蛋白中氨基酸檢測的影響。

圖1 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration analyzed by Bradford method

2 結(jié)果與討論

2.1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

建立米糠蛋白測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。由圖1可知，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.997 6，y=6.503 6x+0.004 2，符合測定標(biāo)準(zhǔn)。本文中關(guān)于蛋白質(zhì)含量的計(jì)算都運(yùn)用此公式。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶種類對米糠蛋白提取率的影響

不同種類的酶對提取結(jié)果的影響不同，5種酶在相同添加量的情況下，對蛋白提取率促進(jìn)作用由大到小依次為：纖維素酶(提取率為62.8%)> 木瓜蛋白酶(提取率為54.6%)> 中性蛋白酶(提取率為43.2%)> 復(fù)合蛋白酶(提取率為41.3%)> 堿性蛋白酶(提取率為30.06%)。纖維素酶是一種糖酶，其主要作用是分解細(xì)胞壁，而米糠的細(xì)胞壁主要由纖維素和多糖類物質(zhì)組成，通過運(yùn)用纖維素酶破壞其細(xì)胞壁，以達(dá)到細(xì)胞壁內(nèi)蛋白類物質(zhì)的釋放，這樣有助于提高蛋白的提取率。

圖2 溫度對米糠蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of different temperatures on rice bran protein extraction rate

2.2.2 溫度對米糠蛋白提取率的影響

以脫脂米糠作為反應(yīng)原料稱取20 g，料液質(zhì)量體積比為1∶8，提取時(shí)間4 h，pH值為5，超聲波處理時(shí)間為15 min，超聲功率為300 W，纖維素酶添加量為0.5%，調(diào)節(jié)溫度分別為20、30、40、50、60 ℃ 進(jìn)行提取，研究不同溫度對米糠蛋白提取率的影響，如圖2所示。由圖2可知，隨著溫度的升高米糠蛋白的提取率逐漸上升，在溫度低于50 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，米糠蛋白的提取率上升得較快，對蛋白的提取有利；而當(dāng)溫度高于50 ℃后，蛋白的提取率上升較慢且基本保持不變，因此選擇最佳溫度為50 ℃。

2.2.3 pH值對米糠蛋白提取率的影響

圖3 pH值對米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of different pH values on rice bran protein extraction rate

以脫脂米糠為反應(yīng)原料稱取20 g，料液質(zhì)量體積比為1∶8，提取時(shí)間為4 h，溫度為60 ℃，超聲波處理時(shí)間為15 min，超聲功率為300 W，纖維素酶添加量為0.5%，調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0進(jìn)行提取，研究不同pH值對米糠蛋白提取率的影響，如圖3所示。從圖3可以看出，在較低pH值下，隨著pH值的不斷升高，蛋白提取率呈不斷增加的趨勢，至pH值為5.0左右達(dá)到最佳水平。這可能是因?yàn)檩^高的pH值影響纖維素酶的活性，進(jìn)而對蛋白的提取產(chǎn)生一定的影響。

2.2.4 纖維素酶添加量對米糠蛋白提取率的影響

圖4 纖維素酶添加量對米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of cellulase quantities on rice bran protein extraction rate

調(diào)節(jié)纖維素酶添加量分別為0%、0.125%、0.25%、0.5%、1%進(jìn)行提取，研究纖維素酶添加量對米糠蛋白提取率的影響。由圖4可知， 隨著加酶量的不斷提高，米糠蛋白提取率不斷上升，當(dāng)添加量達(dá)到 0.25%時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定。原因可能是當(dāng)加酶量在 0.125%～0.25%時(shí)，隨著加酶量的增加，增大了酶和底物相結(jié)合的概率而使提取率升高。當(dāng)加酶量大于 0.25%時(shí)，酶的數(shù)量趨于飽和狀態(tài)，無法再與底物相結(jié)合，因而提取率沒有明顯增加。當(dāng)酶的添加量大于0.5%時(shí)，米糠蛋白提取率下降。

圖5 時(shí)間對米糠蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of time on rice bran protein extraction rate

2.2.5 時(shí)間對米糠蛋白提取率的影響

從圖5可以看出，隨著時(shí)間的增加，米糠蛋白的提取率不斷增加。在提取時(shí)間少于3 h時(shí)，米糠蛋白提取率隨著時(shí)間的增加上升幅度較大；而在提取時(shí)間超過3 h后，米糠蛋白的提取率上升比較緩慢。在綜合生產(chǎn)成本和效率的情況下，選擇最佳提取時(shí)間為3 h。

2.2.6 料液質(zhì)量體積比對米糠蛋白提取率的影響

以脫脂米糠作為反應(yīng)原料稱取20 g，提取時(shí)間為4 h，溫度為60 ℃ ，超聲波處理時(shí)間為15 min，超聲功率為300 W，pH值為5.0，纖維素酶添加量為0.5%，料液質(zhì)量體積比為1∶5、1∶6、1∶8、1∶9、1∶10進(jìn)行提取，研究料液質(zhì)量體積比對米糠蛋白提取率的影響，如圖6所示。

圖6 料液質(zhì)量體積比對米糠蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of solid-to-solution ratio on rice bran protein extraction rate

由于米糠中含有較多的膳食纖維和淀粉，具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，料液質(zhì)量體積比過低時(shí)，物料變得黏稠，流動性差，難以攪拌，體系分散不均勻，使底物無法完全與酶相結(jié)合，從而導(dǎo)致較低的提取率。降低料液質(zhì)量體積比雖然可以提高蛋白質(zhì)的提取率，但無疑又增加了水的用量，使廢水排放量增加。從圖6可以看出，液料質(zhì)量體積比為1∶9 時(shí)，雖然蛋白質(zhì)提取率仍在升高，但增幅不大，因此，選擇液料質(zhì)量體積比為1∶9較合適。

2.2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2～3可以看出，設(shè)定的三因素主次順序?yàn)椋篈>B>C，即酶解溫度>酶解時(shí)間>料液質(zhì)量體積比。

表2 正交試驗(yàn)方案結(jié)果

Table 2 Results of orthogonal experiments

實(shí)驗(yàn)號ABC提取率/%11(40)1(3)1(1∶8)45.9321(40)2(4)2(1∶9)49.8731(40)3(5)3(1∶10)55.6342(50)1(3)2(1∶9)53.4752(50)2(4)3(1∶10)60.2362(50)3(5)1(1∶8)55.2873(60)1(3)3(1∶10)58.2783(60)2(4)1(1∶8)62.7893(60)3(5)2(1∶9)63.11

表3 極差分析結(jié)果

Table 3 Range analysis results

K值A(chǔ)BCK1151.43157.67163.99K2168.98172.88166.45K3184.16174.02174.13k150.4852.5654.66k256.3357.6355.48k361.3958.0158.04R10.915.453.38主次順序A>B>C最優(yōu)水平A3B3C2最優(yōu)組合A3B3C2

2.3 米糠蛋白氨基酸組成分析

表4 100 g米糠蛋白中氨基酸的組成
Table 4 Amino acids composition of rice bran protein per 100 g g

氨基酸種類含量亮氨酸5.79精氨酸5.18脯氨酸0.92賴氨酸6.87異亮氨酸2.68蛋氨酸1.42酪氨酸2.45組氨酸2.76苯丙氨酸4.05谷氨酸9.89絲氨酸4.03半胱氨酸2.91天冬氨酸5.26甘氨酸3.87蘇氨酸3.57纈氨酸3.16丙氨酸3.60

從超聲波輔助纖維素酶法提取的米糠蛋白中分離出17種氨基酸，結(jié)果如表4所示。由表4可知，米糠蛋白含有17種氨基酸，含有人體必需的8種氨基酸，其中氨基酸的比例與人體必需的氨基酸比例比較接近，含量最高的3種氨基酸為谷氨酸、賴氨酸和亮氨酸，含量最少的氨基酸為脯氨酸、蛋氨酸和酪氨酸。從營養(yǎng)學(xué)角度來看，米糠蛋白中氨基酸與其他谷物蛋白中氨基酸相比較，米糠蛋白中氨基酸的組成更接近世界衛(wèi)生組織所提供的人體必需的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式。米糠蛋白中谷氨酸的含量最高，谷氨酸是一種酸性氨基酸，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝中起重要的作用，在醫(yī)學(xué)上用于改善兒童的智力發(fā)育，現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用在日用化妝品上。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對超聲波輔助纖維素酶提取米糠蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化，選取了最佳的工藝條件：提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為5 h、料液質(zhì)量體積比為1∶9、pH值為5、纖維素酶添加量為0.5%，在此條件下米糠蛋白提取率達(dá)到63.11%。米糠蛋白含有17種氨基酸，有8種是人體必需的氨基酸，其中最高的3種為谷氨酸、賴氨酸和亮氨酸，含量最少的為脯氨酸、蛋氨酸和酪氨酸。本研究結(jié)果可供米糠蛋白的提取參考。

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Study on optimization of rice bran protein extraction process

ZHANG Jinjian1, ZHAO Youping1, TANG Siyu1,CAI Chenggang1,2,3, MAO Jianwei1,2,3

(1. School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, Zhejiang, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, Zhejiang,China; 3. Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing, Hangzhou 310023, Zhejiang, China)

The article applied the ultrasonic assisted enzymatic method to extract rice bran protein and conducted the preliminary analysis on composition of the amino acid in the extracted protein. The results showed that cellulase was the optimal enzyme for extracting rice bran protein, and the extraction rate of rice bran protein was the highest, up to 63.11% when it was extracted at 1∶9 rate of solid to solution and at 60 ℃ for 5 hours with pH value of 5.0 and 0.5% amount of cellulase. The extracted rice bran protein contained 17 kinds of amino acids, among which 8 were indispensable to human body and the highest in concentration were glutamic acid, lysine and leucine, and the lowest proline, methionine and tyrosine. The results can shed light on development of the rice bran protein.

rice bran protein; enzymatic extraction; process optimization

10.3969/j.issn.1671-8798.2017.03.010

2017-03-02

科技部國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2010DFA34370)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30870553)；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015C02031)；浙江省國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2013C14012)；浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心開放項(xiàng)目(2016KF0035，2016KF0044);浙江省分析測試科技計(jì)劃研究項(xiàng)目(2017C37049)

毛建衛(wèi)(1964— )，男，浙江省奉化人，教授，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)生物資源生化制造研究。E-mail：zjhzmjw@163.com。

TS210.9

A

1671-8798(2017)03-0214-05