HPLC-ELSD法檢測葛根酶解物中纖維低聚糖的含量

王朋凱，張雁，唐小俊，池建偉

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北武漢430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

HPLC-ELSD法檢測葛根酶解物中纖維低聚糖的含量

王朋凱1，2，張雁2，*，唐小俊2，池建偉2

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北武漢430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

建立高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection）測定葛根酶解制備物中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的方法。HPLC條件為：采用Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫 35℃、流動相：乙腈 ∶水=70∶30（體積比）、流速 0.8 mL/min；ELSD 參數(shù)為：漂移管溫度70℃，N2流速2.0 L/min。結(jié)果表明，葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的濃度與其峰面積在0.07 mg/mL～0.7 mg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99），精密度RSD 0.99%～3.1%，平均回收率98.17%～103.42%。

高效液相色譜；蒸發(fā)光檢測器；葛根纖維低聚糖

葛根是傳統(tǒng)藥食兩用植物，采自豆科葛屬植物的根，富含黃酮、淀粉、膳食纖維等活性成分，從中提取的黃酮和淀粉在醫(yī)藥及食品工業(yè)中得到了較好的應用[1]，而含有大量膳食纖維的副產(chǎn)物葛根殘渣多作為廢料丟棄，造成一定程度的資源浪費。實際上，葛根膳食纖維中的纖維素經(jīng)過酶水解可制備功能性纖維低聚糖。

纖維低聚糖是由2到10個葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的線性低聚糖，具有促進雙歧桿菌增殖、提高機體免疫力、抗齲齒、促進鈣、磷、鎂等對礦物質(zhì)的吸收和預防結(jié)腸癌等功能[2-3]，可應用于營養(yǎng)保健、畜牧獸醫(yī)、飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，將葛根膳食纖維轉(zhuǎn)化為纖維低聚糖，既可提高資源利用率，又可提升其經(jīng)濟社會效益。

確定葛根纖維低聚糖的定量分析方法，對于葛根纖維低聚糖酶解制備工藝參數(shù)的優(yōu)化尤為關(guān)鍵。目前纖維低聚糖的測定方法主要包括蒽酮比色法、苯酚硫酸法、高效液相色譜法、氣相色譜法等[4]。其中高效液相法測定糖類物質(zhì)的含量最為快捷簡便，且無需衍生化處理，尤其是定量單糖及低聚糖的效果較好。蒸發(fā)光檢測器是近年來廣泛應用于糖類測定的通用型質(zhì)量檢測器，它基于不揮發(fā)性樣品顆粒對光的散射程度與其質(zhì)量成正比的原理進行檢測，對沒有紫外吸收、熒光或電活性的物質(zhì)以及產(chǎn)生末端紫外吸收的物質(zhì)均能產(chǎn)生響應[5-6]。具有靈敏度高、容許梯度洗脫、不易受環(huán)境影響等優(yōu)點[7]。

本試驗采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用，建立葛根酶解制備物中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的定量分析方法，以期為葛根纖維低聚糖的制備技術(shù)開發(fā)及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Aligent 1200高效液相色譜、Aligent 1260蒸發(fā)光檢測器：美國安捷倫公司；Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱：日本昭和公司；電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；離心機：Thermo美國；SB25-12 DTD超聲清洗機：寧夏新芝生物科技股份有限公司。

1.2 材料與試劑

葛根：廣州市天河區(qū)天平架果蔬批發(fā)市場，產(chǎn)地廣東，品種為粉葛，新鮮度和成熟度良好；纖維素酶（別名 β-1，4（1，3）內(nèi)切葡聚糖酶，酶活力 0.8 U/mg）、葡萄糖（純度≥99%）、纖維二糖（純度≥99%）、纖維三糖（純度≥99%）標準品：美國希格瑪有限公司；乙腈為色譜純、其他試劑為分析純、試驗用水為超純水：美國費希爾有限公司。

1.3 色譜條件及檢測器參數(shù)

HPLC參數(shù)：AsahipakNH2P-50-4E色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm），柱溫 35 ℃，流速 0.8 mL/min，進樣量10 μL；ELSD參數(shù)：蒸發(fā)溫度70℃，漂移管溫度70℃，載氣流速2.0 L/min，增益1。

1.4 方法

1.4.1 流動相體系對糖色譜行為的影響

流動相流速0.8 mL/min，柱溫35℃，配置不同比例的流動相：乙腈∶水=75∶25（體積比）、乙腈∶水=70∶30（體積比）、乙腈 ∶水=60∶40（體積比），考察不同比例的流動相對3種糖分色譜行的影響。

1.4.2 標準溶液的配置

3種糖標準貯備液：分別準確稱取0.050 0 g葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖標準品溶于少量超純水中，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，加水定容，得5 mg/mL葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖標準貯備液。

3種糖混合標準液：分別吸取上述3種糖液的標準貯備液2 mL于10 mL容量瓶中混合，用超純水定容，得1 mg/mL 3種糖混合標準溶液，轉(zhuǎn)移至試劑瓶，吸取部分混合標準溶液，使用超純水稀釋為0.7 mg/mL的標準工作液備用。

1.4.3 葛根膳食纖維提取

將清洗干凈的新鮮葛根切塊打漿，并用砂布過濾漿液，漿液自然沉降、干燥后得到葛根淀粉以備其他用途；濾渣進行脫蛋白處理，得到葛根膳食纖維粗品，經(jīng)80℃烘干后粉碎備用。

1.4.4 葛根纖維低聚糖樣品制備

將粉碎后的葛根膳食纖維加入檸檬酸緩沖液，配制成4%的懸濁液，然后添加適量的纖維素酶，置于磁力攪拌器上酶解一段時間，反應結(jié)束后沸水滅酶15 min，將酶解液進行真空抽濾，濾液離心15 min，取適量稀釋后的上清液，過0.22 μm濾膜，得樣品溶液。

1.4.5 標準曲線的繪制

以0.7 mg/mL的標準工作液為基準，通過改變高效液相的上樣量（5、15、25、35、45、50 μL），按 1.3 項色譜條件上機測定，以峰面積Y對3種標準物質(zhì)量濃度（mg/mL）X計算線性回歸方程，得到線性范圍。

1.4.6 精密度

取混合標準溶液，按照1.3的色譜條件重復進樣6次，計算混合標準溶液中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖峰面積的相對標準偏差（RSD），以峰面積的相對標準偏差表示測定方法的精密度。

1.4.7 檢出限、定量限

將葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖3種糖的混合標準溶液稀釋后進行測定，在信噪比S/N約為3時測得最低檢出限；在信噪比S/N約為10時測得最低定量限。

1.4.8 重復性

取同一樣品溶液，按照1.3的色譜條件測定，進行5次重復，計算樣品中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖峰面積的相對標準偏差（RSD），以峰面積RSD表示測定方法的重復性。

1.4.9 穩(wěn)定性

取同一樣品溶液分別在室溫下放置 0、2、4、6、8、10 h后進樣分析，并計算樣品中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的峰面積相對標準偏差（RSD），以峰面積RSD表示測定方法的穩(wěn)定性。

1.4.10 加標回收率

采用添加標準樣法測定回收率，對樣品提前加入3 mg/mL的糖標準溶液2 mL，以不加標準物質(zhì)的樣品作為對照，重復測試5次，根據(jù)加標量與檢出量計算樣品回收率?；厥章?%=檢出量/加標量×100。

1.4.11 樣品溶液各組分含量的測定與計算

將制備完成的葛根纖維低聚糖樣品溶液按照1.3的色譜條件進樣分析，采用外標法，根據(jù)峰面積計算樣品中葡萄糖、纖維二糖及纖維三糖等各個組份的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

糖類物質(zhì)的色譜分析通常使用氨基柱，然而傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的氨基柱壽命較短，不耐水相，當流動相中水相比例大于40%時，硅膠基質(zhì)氨基柱的鍵合相易脫落，從而發(fā)生基線漂移，無法定量的情況[9]。本試驗選取的色譜柱為聚乙二醇基質(zhì)的氨基柱，克服了傳統(tǒng)氨基柱不耐水相，使用壽命短，基線漂移的弱點[8]，可以有效測定葛根酶解制備物中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的含量，重復性良好，同時可以得到較好的分離度和峰形。

2.2 流動相比例的確定

根據(jù)糖分子含有極性基團及氨基柱的特點，選用乙腈和水作為流動相。結(jié)果如圖1所示，適當降低乙腈的比例可以明顯縮短各峰的保留時間，當乙腈和水的體積比為75∶25時，各組分峰分離較好，但保留時間較長；當乙腈和水的體積比為70∶30時，各組分峰分離度良好，在20 min內(nèi)完全分離；但當乙腈與水的體積比降低到60∶40時，流動相的極性增加較大，各組分峰卻難以分離。

因此，選擇乙腈∶水=70∶30（體積比）作為本方法的流動相。

圖1 不同比例乙腈∶水作流動相時的混合糖標準品色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard samples with different volume ratio of CH3CN and H2O as mobile phase

2.3 柱溫和流速的選擇

在乙腈∶水=70∶30（體積比）做流動相的條件下，分別設(shè)置柱溫為30、35、40℃進行試驗，結(jié)果表明上述3個溫度對3種糖的分離效果影響并不大，考慮到色譜柱的溫度適用范圍，選擇柱溫為35℃；流動相流速在一定程度上決定保留時間的長短，隨著流動相流速的增加，保留時間減小，但當流速過高時，會導致色譜柱的柱壓偏高，有損色譜柱的使用壽命，所以本實驗采用流速0.8 mL/min。

2.4 色譜檢測條件的選擇

載氣流速和漂移管溫度是ELSD檢測器二個關(guān)鍵的技術(shù)參數(shù)。當載氣流速過低時，形成大量微滴，導致尖峰信號或噪聲信號；載氣流速過高時，微滴量過低會導致信號響應降低。而漂移管溫度下降時，溶劑揮發(fā)不完全；但當溫度過高時，分析樣品部分揮發(fā)，微滴量下降，檢測器響應下降[10-11]。因此，選擇載氣流速為2.0 L/min，漂移管溫度為70℃。

2.5 檢測方法的標準曲線、線性范圍

檢測方法的標準曲線、線性范圍如表1所示。

表1 3種糖的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和精密度Table 1 The linear equation，correlation coefficient and precision of 3 saccharides

2.6 方法的精密度

混合標準工作液中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的峰面積RSD結(jié)果見表1。三種糖的精密度0.99%～3.1%，表明該檢測方法精密度良好。

2.7 方法的檢出限和定量限

混合標準工作液中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的檢出限分別為 1.61、0.83、2.52 μg；定量限分別為5.06、2.17、8.02 μg。

2.8 方法的重復性

檢測方法的重復性試驗結(jié)果如表2所示，3種糖的峰面積RSD 2.4%～3.1%，說明該檢測方法的重復性良好。

表2 重復性試驗結(jié)果Table 2 Repetitiveness of the method

2.9 方法的穩(wěn)定性

檢測方法的穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Steadiness of the method

葛根纖維低聚糖樣品在室溫下分別放置0、2、4、6、8、10 h后，其測定的峰面積 RSD2.5%～3.3%，說明該方法的穩(wěn)定性較好。

2.10 加標回收率試驗

加標回收率是實驗室確定準確度的重要指標之一，同時也可反應分析方法是否適合被測樣品。加標回收率試驗見表4。

表4 加標回收率試驗Table 4 Recovery rate of the established method

從表4可知，樣品的平均加標回收率98.17%～103.42%，回收率RSD 2.81%～3.90%，說明該檢測方法準確性較高。

2.11 樣品測定

葛根酶解制備物中纖維低聚糖含量的確定是衡量檢測方法有效性最直接指標。將制備完成的樣品按照1.3項色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖2。

樣品中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的含量分別為（1.330±0.042）mg/mL（樣品濃度 RSD=3.158%）、（2.805±0.063）mg/mL（樣品濃度 RSD=2.246%）和（0.580±0.035）mg/mL（樣品濃度 RSD=6.035%）。

圖2 葛根纖維低聚糖酶解樣品HPLC色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram of the samples

3 討論與結(jié)論

在糖類物質(zhì)檢測方法中，常見的苯酚-硫酸法、二硝基水楊酸法等化學分析法用于測定總糖，其中苯酚硫酸法不穩(wěn)定，重復性不好，易受環(huán)境因素的影響[12]；氣相色譜法因其在糖類物質(zhì)測定上具有選擇性好、樣品用量少、分辨率高、快速準確等優(yōu)點，在國內(nèi)外得到廣泛應用。但氣相色譜法測定的樣品需具有一定的揮發(fā)性，而糖類物質(zhì)的揮發(fā)性較少，需要衍生化處理，費時繁瑣[4]。

高效液相法測定纖維低聚糖較為簡便快捷，而通常采用的示差折光檢測器，對于溫度變化及其敏感，使得基線變化很不穩(wěn)定，靈敏度低，且啟用前需使用流動相長時間平衡檢測器[13]；劉勝男等[14]采用高效陰離子脈沖安倍檢測器可準確測定纖維低聚糖的含量，但該類檢測器對技術(shù)設(shè)備要求較高，價格昂貴[15]。

蒸發(fā)光檢測器是近年來廣泛應用于糖類測定的通用型質(zhì)量檢測器，樣品無需衍生化處理、檢測靈敏度高，對物質(zhì)的響應不依賴于樣品的光學特性，可以有效克服示差折光檢測器基線漂移、不容許梯度洗脫的弱點，有利于濃度較小的低聚糖及單糖的測定。Xi Chen[16]、YA Sun[17]、閆正[18]等先后使用 HPLC-ELSD 方法準確測定啤酒、煙草和乳制品中的可溶性糖含量，分離度好且峰形較佳。

本研究建立了葛根酶解物中葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的色譜分離條件：采用Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫 35 ℃、流動相：乙腈 ∶水=70∶30（體積比）、流速 0.8 mL/min；漂移管溫度70℃，N2流速2.0 L/min，增益值：1。葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖的濃度與其峰面積在0.07 mg/mL～0.7 mg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系，樣品平均回收率98.17%～103.42%，其RSD為 2.81%～3.90%，方法精密度0.99%～3.1%，重復性和穩(wěn)定性良好，樣品檢測的峰面積RSD＜3.5%，可為纖維低聚糖的檢測和應用提供依據(jù)。

[1] Zhou L,Zuo Z,Chow M S.Danshen:an overview of its chemistry,pharmacology,pharmacokinetics,and clinicaluse[J].Journal of Clinical Pharmacology,2013,53(8)787-811

[2] Vejdovszky P,Oberlerchner J,Zweckmair T,et al.Preparation and Analysis of Cello-and Xylooligosaccharides[M]//CelluloseChemistry and Properties:Fibers,Nanocelluloses and Advanced Materials.Springer International Publishing,2015:1-40

[3] Akpinar O,Penner M H.Preparation of cello-oligosaccharides:Comparative study[J].Journal of Food Agriculture&Environment,2015,6(1):55-61

[4] 林慧,顏春榮,徐春祥,等.HPLC-ELSD法測定梨果實中不同種類可溶性糖含量[J].食品科學,2013,34(12):286-291

[5] 紀祥娟,王軍,楊新光,等.蒸發(fā)光散射檢測器的應用概況及檢定方法研究進展[J].計量與測試技術(shù),2014,41(5):50-51

[6] Ko J,Lee M S,Kwak B M,et al.Determination of Isomaltooligosaccharides in Yoghurts by Using HPLC-ELSD[J].Korean Journal For Food Science of Animal Resources,2013,33(3):417-424

[7] Chen R B,Zhang Y Y,He J M,et al.Simultaneous Determination of Two Major Triterpenoid Saponins:Celosins I and II in Celosiae Semen,by HPLC-ELSD[J].Chinese Herbal Medicines,2015,7(2):185-190

[8] Ito K.Advantages.of Shodex(TM)NH2P Series,Polymer-Based Amino HILIC Column,Over Silica-Based Amino HILIC Columns[J].Lc Gc North America,2011:56-56

[9] 林慧,顏春榮,徐春祥,等.HPLC-ELSD法同時測定食品中的10種糖和糖醇[J].食品科學,2013,34(12):286-291

[10]劉芳.蒸發(fā)光散射檢測器在食品安全領(lǐng)域的應用及與加壓毛細管電色譜的聯(lián)用[D].上海:上海交通大學,2012

[11]朱群英,江勇,甘鈺.HPLC-ELSD法同時測定食品中5種糖[J].食品科學,2008,29(12):503-506

[12]徐光域,顏軍,郭曉強,等.硫酸-苯酚定糖法的改進與初步應用[J].食品科學,2005,26(8):342-346

[13]沈昱.糖類化合物HPLC分析方法建立的研究[J].輕工科技,2013(9):20-22

[14]劉勝男,宛曉春,杜先鋒.酶法制備葛根纖維低聚糖[J].食品科學,2012(4):66-70

[15]Radva D,Knutsen S H,Kosáry J,et al.Application of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection to compare the kinetic properties of β-glucosidase on oligosaccharides from lichenase digested barley β-glucan[J].Carbohydrate Research,2012,358(358):56

[16]Chen X,Wang J,Li Q.Simultaneous Determination of Maltooligosaccharides in Beer Using HPLC-ELSD and Their Influence on Beer Foam Stability[J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,2015,73(1):78-83

[17]Sun Y A,Wang G Q,Zhang Y J,et al.Determination of the Water-Soluble Carbohydrates in Tobacco by HPLC-ELSD[J].Journal of Analytical Science,2004,20(5):531-533

[18]閆正,張玉,李盈辰,等.HPLC-ELSD法同時測定乳制品中5種水溶性糖的含量[J].河北大學學報(自然科學版),2011,31(1):52-56

Determination of Cello-Oligosaccharide in Radix Puerariae Enzymatic Preparation by HPLC-ELSD

WANG Peng-kai1，2，ZHANG Yan2，*，TANG Xiao-jun2，CHI Jian-wei2
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，Hubei，China；2.Sericultural&Agri-Food Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，Guangdong，China）

A high performance liquid chromatography （HPLC）with evaporative light scattering detection（ELSD）method was developed for the dermination of 3 saccharides such as glucose，cellobiose and cellotriose in the enzymatic hydrolysate of Radix Puerariae.A Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used and the HPLC contidions were as follows：colunmn temperature 35 ℃，mobile phase：acetonitrile：water=70∶30，flow rate 0.8 mL/min.And also the ELSD conditions were：detector drift tube temparature 70℃，nitrogen flow rate 2.0 L/min.The results showed that there were good linear correlations between the concentration and the peak area of the 3 kinds of saccharides with the detection limitation from 0.07 mg/mL to 0.7 mg/mL（R2＞0.99）.Precision RSDs of standard samples for the determination of the sugars were 0.99%-3.1%and average recoveries for the sugars in 5 real samples were 98.17%-103.42%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；evaporative light scattering detection（ELSD）；Radix Puerariae cello-oligosaccharides

2017-03-12

廣東省工業(yè)高新技術(shù)項目（2013B010102011）；廣州市產(chǎn)學研協(xié)同創(chuàng)新重大專項（201508020036）；廣東省應用型科技研發(fā)專項（2015B020230005）

王朋凱（1994—），男（漢），碩士，研究方向：食品生物化學。

*通信作者：張雁（1967—），女（漢），研究員，博士，研究方向：食品生物化學。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.030