鼻腔滴注博萊霉素誘導(dǎo)ICR小鼠肺纖維化模型的建立

欒智華，魏硯明，劉必旺，董 立，侯 淵，王永輝

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

鼻腔滴注博萊霉素誘導(dǎo)ICR小鼠肺纖維化模型的建立

欒智華，魏硯明，劉必旺，董 立，侯 淵，王永輝

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

目的：通過鼻腔滴注博萊霉素誘導(dǎo)ICR小鼠發(fā)病，尋求建立穩(wěn)定且方法簡單的肺纖維化模型。方法：ICR雌性小鼠分為對照組和模型組，模型組鼻腔滴注博萊霉素50 μL（15 mg/kg），對照組滴注生理鹽水。取小鼠肺組織進(jìn)行HE、Masson染色、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）免疫組化及羥脯氨酸含量測定。結(jié)果：與對照組小鼠相比，造模后第7天模型組小鼠的肺臟出現(xiàn)急性肺泡炎；第14天時(shí)，肺泡炎更加明顯，開始出現(xiàn)肺纖維化；第28天時(shí)肺泡炎有所減輕，肺纖維化明顯加重。第28天時(shí)模型組小鼠的肺臟HYP含量、α-SMA水平明顯高于對照組。結(jié)論：鼻腔滴注博萊霉素（15 mg/kg）可誘導(dǎo)ICR小鼠建立相對穩(wěn)定的肺纖維化模型。

肺纖維化；鼻腔；博萊霉素；ICR小鼠

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是以肺泡上皮細(xì)胞損傷、肺實(shí)質(zhì)彌漫性炎性浸潤、成纖維細(xì)胞異常增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為主要特征的一大組疾?。?］。目前IPF的病因和發(fā)病機(jī)制均不明確，所以建立穩(wěn)定且方法簡單的動物模型對研究肺纖維化非常重要。本文通過鼻腔滴注博萊霉素，成功誘導(dǎo)建立了ICR小鼠肺纖維化模型，論述如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ICR雌性小鼠，6 w齡，體質(zhì)量16~18 g，SPF級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001，給予常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，并自由飲水。

1.1.2 藥物與試劑 注射用鹽酸博萊霉素（浙江海正輝瑞制藥有限公司，產(chǎn)品批號：15014311）；Masson染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20160317）；羥脯氨酸檢測試劑盒［（堿水解法）南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20160317］；鼠抗鼠 α-SMA單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；小鼠IgG免疫組化試劑盒SABC即用型（武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：201603）；DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）；蘇木素、伊紅染液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，生產(chǎn)批號：201560326）；無水乙醇、二甲苯、95%乙醇均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2型）；電子天平（FA3204B）；紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器 TU-1810）；石蠟切片機(jī)（YD-1508RⅢ）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9243BS-Ⅲ）；病理圖文分析系統(tǒng)（Olympus）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肺纖維化模型復(fù)制 23只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組10只，模型組13只。先用乙醚麻醉模型組小鼠，然后用微量移液器吸取50 μL博萊霉素溶液（按15 mg/kg進(jìn)行干預(yù)），將藥物經(jīng)鼻腔緩慢滴入小鼠氣管內(nèi)，放入鼠籠內(nèi)安置，觀察其造模后一般情況，對照組經(jīng)鼻腔滴注等量生理鹽水。

1.2.2 檢測指標(biāo) ①動物的臨床癥狀：動物精神狀態(tài)、活動情況、死亡率、體質(zhì)量以及攝食飲水等。②肺組織大體觀察及肺系數(shù)：造模過程中，發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，打開胸腔，觀察肺葉顏色、體積、有無出血點(diǎn)、結(jié)節(jié)等。在造模后第28天統(tǒng)一脫臼處死并稱重記錄，之后進(jìn)行標(biāo)本的采集，完整剝離肺組織，PBS沖洗，用吸水紙吸干多余的PBS，稱得小鼠肺組織濕重其中a為肺濕重（mg），b為體質(zhì)量（g）。計(jì)算小鼠的肺系數(shù)（y）。③HE和Masson染色及α-SMA免疫組化：造模過程中，發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，整塊切取各小鼠的左肺，以4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后制成石蠟切片供蘇木素-伊紅（HE）染色、膠原纖維染色（Masson染色）、α-SMA免疫組化檢測。④肺組織的羥脯氨酸（HYP）檢測：將各小鼠的右肺上中葉取下放在EP管中置于-80℃保存，以完成羥脯氨酸（HYP）的檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 動物的臨床癥狀表現(xiàn)

對照組小鼠表現(xiàn)正常，皮毛光亮，攝食飲水正常，呼吸平穩(wěn)，體質(zhì)量逐漸增加。模型組小鼠造模后活動減少，呼吸急促，反應(yīng)靈敏度變差，毛發(fā)干燥晦暗，嚴(yán)重者可見斑禿、脫毛，進(jìn)食下降，體質(zhì)量逐漸減輕。模型組小鼠從第5天開始死亡，死亡率為61.5%。結(jié)果見表1，圖1。

表1 小鼠的體質(zhì)量變化 （g，±s）

表1 小鼠的體質(zhì)量變化 （g，±s）

注：與對照組相應(yīng)時(shí)間段比較，1）P＜0.01

組別 第0天 第7天 第14天 第21天 第28天對照組 22.30±0.97 23.92±1.19 25.48±1.49 26.61±1.35 26.35±1.55模型組 22.16±0.89 17.77±3.491）21.17±2.851）22.02±4.181）25.36±1.04

圖1 滴注博萊霉素后小鼠體質(zhì)量及存活率的變化

2.2 小鼠肺臟的肉眼觀察及肺系數(shù)

對照組小鼠的肺臟無異常表現(xiàn)，肺葉呈淡粉紅色，色澤均勻，彈性良好。模型組小鼠第7天時(shí)雙肺充血水腫，可見密集的點(diǎn)狀、彌漫性出血，體積變大；第14天雙肺彈性下降，局部見大小不等點(diǎn)狀出血，結(jié)節(jié)樣改變；第28天時(shí)雙肺萎縮、蒼白，彈性變差，質(zhì)地堅(jiān)韌，表面出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)及條索狀改變。

小鼠在造模后第28天肺系數(shù)的變化情況：模型組小鼠的肺系數(shù)（13.07±0.42）明顯高于對照組（7.38±0.19），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2。

2.3 HE染色

對照組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡腔內(nèi)無滲出物，無炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁無增厚，肺泡間隔形態(tài)正常，未見增厚。

圖2 滴注博萊霉素后小鼠肺臟的大體病變

模型組小鼠第7天時(shí)，肺臟出現(xiàn)明顯的急性炎癥，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)伴有少量出血；第14天時(shí)肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)仍有大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生；第28天時(shí)肺泡炎減輕，肺泡腔萎縮、消失，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)大量纖維成分沉積，肺纖維化明顯加重。結(jié)果見圖3。

圖3 滴注博萊霉素后小鼠肺組織病理學(xué)的動態(tài)變化HE染色（×400）

2.4 Masson染色

對照組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)正常，僅在較大的血管及氣管周圍有少量藍(lán)色膠原纖維沉積。模型組小鼠第7天時(shí)藍(lán)染部位較少；隨著病情的進(jìn)展，小鼠肺組織內(nèi)的藍(lán)色膠原纖維逐漸增多；第28天時(shí)模型組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完全被破壞，肺野內(nèi)有大量藍(lán)色膠原纖維沉積，肺泡間隔也幾乎被藍(lán)染的膠原纖維充填。結(jié)果見圖4。

2.5 肺組織中α-SMA的定位

圖4 滴注博萊霉素后小鼠的肺組織切片Masson染色（×400）

免疫組化結(jié)果顯示：對照組小鼠的肺臟中α-SMA蛋白表達(dá)較少；第28天時(shí)模型組小鼠肺臟的α-SMA蛋白不僅表達(dá)在血管、氣管的平滑肌細(xì)胞漿中，在肺間質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞漿中也有表達(dá)。結(jié)果見圖5。

圖5 滴注博萊霉素后小鼠的肺組織切片α-SMA免疫組化（×400）

2.6 肺組織的羥脯氨酸（HYP）的檢測

小鼠在造模后第28天肺臟羥脯氨酸含量的變化情況：模型組小鼠肺臟的羥脯氨酸含量（0.63±0.02）明顯高于對照組（0.31±0.01），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）是急性或慢性間質(zhì)性肺疾病中病因不明確的一種類型，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)表現(xiàn)為不同程度的炎癥和纖維化［2］。由于該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前有多種方法復(fù)制肺纖維化的動物模型來對本病進(jìn)行研究。

李麗娜等［3］研究提示，對小鼠進(jìn)行腹腔注射BLM 5次后，與對照組相比，模型組小鼠的肺系數(shù)、體質(zhì)量變化明顯，但造模時(shí)需要的BLM劑量大，注射次數(shù)多，費(fèi)用偏高，故其研究受到了一定限制。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾對ICR小鼠腹腔注射BLM，每只按照15 mg/（kg·d）給藥，連續(xù)10 d，結(jié)果動物在注射藥物后的28 d內(nèi)死亡率僅為10%，表明模型不成功。張曉曄等［4］采用一次性尾靜脈注射BLM ［150 mg/（kg·d）］的方法制備的肺纖維化動物模型，具有模型形成晚，動物品種特異性、死亡率高等缺點(diǎn)。氣管注射博萊霉素是經(jīng)典的給藥方式，但有學(xué)者認(rèn)為其形成的肺纖維化主要分布在肺門和支氣管周圍，故該法誘導(dǎo)建立的肺纖維化模型受到懷疑［5］。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)對ICR小鼠進(jìn)行一次性氣管注射BLM（5 mg/kg），結(jié)果動物在注射藥物后死亡率非常高，表明模型不成功。

最終本研究決定采用鼻腔滴注博萊霉素的方式來建立小鼠的肺纖維化模型。通過對小鼠的臨床表現(xiàn)、病理變化及肺臟中α-SMA表達(dá)量的觀察比較發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食減少、脫毛，行動遲滯，呼吸急促、體質(zhì)量顯著減輕等癥狀；模型組小鼠從第5天開始死亡，28 d時(shí)死亡率為61.5%；肺臟病理切片HE、Masson染色表明，發(fā)病初期表現(xiàn)為肺泡炎，肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，后期肺泡炎減輕，肺組織失去了正常結(jié)構(gòu)，肺泡腔萎縮，甚至消失，肺泡間隔可見大量增生的成纖維細(xì)胞，肺纖維化明顯加重；α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的表型，是其特異性分子標(biāo)識［6］。與對照組相比，第28天時(shí)模型組小鼠肺組織內(nèi)α-SMA表達(dá)水平明顯增多。

目前測定肺臟羥脯氨酸的含量是評價(jià)肺纖維化程度的常用方法，羥脯氨酸的含量與肺纖維化成正相關(guān)［7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，第28天時(shí)模型組小鼠的肺臟HYP含量顯著高于對照組。

綜上所述，表明本研究建立的小鼠肺纖維化模型成功，從而為下一步研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］Raghu G，Collard H R，Egan J J，et al.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement：idiopathic pulmonary fibrosis：evidence-based guidelines for diagnosis and management［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（6）：788-824.

［2］King T J，Pardo A，Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet，2011，378（9 807）：1 949-1 961.

［3］李麗娜，王華，周蕾，等.博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化造模方式的選擇［J］.中國免疫學(xué)雜志，2010，26（3）：254-257.

［4］張曉曄，寧欣，劉衛(wèi)青，等.靜脈注射和氣管內(nèi)滴入博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的差異［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2008，16（3）：176-178.

［5］Lawson W E，Oury T D.Animal models of fibrotic lung disease［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49（2）：167-179.

［6］Willis B C，du Bois R M，Borok Z.Epithelial origin of myofibroblasts during fibrosis in the lung［J］.Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：377-382.

［7］Blaauboer M E，Emson C L，Verschuren L，et al.Novel combination of collagen dynamics analysis and transcriptional profiling reveals fibrosisrelevant genes and pathways［J］.Marix Biology，2013，32（7）：424-431.

（編輯：翟春濤）

Establishment on ICR mouse model of pulmonary fibrosis induced by nasal instillation of bleomycin

Luan Zhihua，Wei Yanming，Liu Biwang，Dong Li，Hou Yuan，Wang Yonghui （Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：The pathogenesis of ICR mouse was induced by intranasal instillation of bleomycin to establish stable and simple pulmonary fibrosis model.Methods：ICR female mice were divided into control group and model group. The mice in model group were given nasal instillation of bleomycin 50 μL（15 mg/kg），the mice in control group were given nasal instillation of normal saline drip.The lung tissue of mice was observed by HE，Masson staining，the contents of alpha-SMA and hydroxyproline were detected.Results：Compared with the control group，7 days after modeling，lung tissue of the model group showed acute pulmonary alveolar inflammation.14 days after modeling，pulmonary alveolar inflammation was more obvious，and pulmonary fibrosis occurred.28 days after modeling alveolar inflammation of the model group had been reduced，pulmonary fibrosis was significantly increased.Compared with the control group，28 days after modeling the contents of HYP and alpha-SMA in the lung of the model group were significantly increased.Conclusion：Nasal instillation of bleomycin（15 mg/kg）induced ICR mice model of pulmonary fibrosis is relatively stable.

pulmonary fibrosis；nasal；bleomycin；ICR mice

R285

A

1671-0258（2017）02-0018-04

山西中醫(yī)學(xué)院博士科研啟動金

欒智華，高級獸醫(yī)師，博士，E-mail：llzh4215@163.com

王永輝，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，E-mail：wyh766188@sina.com