UPLC法測(cè)定木鱉子藥材中絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量

程志清，韓光磊，洪 燕，韓燕全，鄭 新，潘凌宇，韓麗萍

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038）

UPLC法測(cè)定木鱉子藥材中絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量

程志清1，韓光磊1，洪 燕2，韓燕全1，鄭 新2，潘凌宇2，韓麗萍2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038）

目的：建立UPLC法測(cè)定木鱉子中絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯含量的方法，并對(duì)不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行測(cè)定。方法：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，線性梯度洗脫；流速0.25 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長203 nm。結(jié)果：絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯濃度與峰面積在0.35～5.60 μg之間線性關(guān)系良好（r=0.999 6），加樣回收率為97.98%，RSD為1.60%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好，可用于木鱉子藥材的質(zhì)量控制。

木鱉子；UPLC；絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯

木鱉子為葫蘆科木鱉Momordica cochinchinensis（Lour.）Spreng.的干燥成熟種子，其味苦，微甘，性溫，有毒，為臨床常用中藥之一［1］。木鱉子具有散結(jié)消腫、攻毒療瘡之功效，由于其有毒，臨床主要外用治療瘡瘍腫毒、乳癰、瘰疬、痔瘺、干癬、禿瘡等。近年研究表明，木鱉子及其提取物具有較廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛以及用于治療糖尿病腎病和胰島素抵抗等。木鱉子中所含的成分有脂肪酸類、活性蛋白類、皂苷類等多種類別，目前已經(jīng)明確的單體成分有α-菠菜甾醇、熊果酸、齊墩果酸、木鱉子酸、木鱉子素等。其中木鱉子皂苷屬于五環(huán)三萜齊墩果烷型的雙糖鏈三萜皂苷，可能是其抗腫瘤作用的主要活性成分［2-6］。

《中國藥典》2015年版一部規(guī)定其含量測(cè)定成分為HPLC法測(cè)定其絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（C37H56O10）含量，該成分為木鱉子皂苷降解后的次級(jí)苷，結(jié)構(gòu)見圖1，其含量較高，是較為理想的含量測(cè)定的指標(biāo)成分。由于木鱉子的產(chǎn)地較多，藥材質(zhì)量有一定差異，不同產(chǎn)地之間的藥材優(yōu)劣目前尚不清楚。本課題在《中國藥典》2015年版HPLC法測(cè)定絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯方法的基礎(chǔ)上，建立該成分的UPLC測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的多批次木鱉子藥材進(jìn)行含量測(cè)定，了解該藥材的質(zhì)量狀況，為其進(jìn)一步研究開發(fā)提供依據(jù)。

圖1 絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)，配有四元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣本管理器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器和Empower 2色譜工作站（美國Waters公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200DB型超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；ME55型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利上海有限公司）；KDC-16H高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 試 藥

絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯對(duì)照品，規(guī)格20 mg，由成都普斯生物公司提供，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光譜檢測(cè)確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，按歸一化法測(cè)得其純度為98.95%，批號(hào)：PS13062101。

21份不同產(chǎn)地和批次的木鱉子藥材購自全國各地藥店，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院韓燕全副主任中藥師鑒定，均為葫蘆科木鱉的干燥成熟種子，具體信息見表2。色譜乙腈購自迪馬科技公司，甲醇、磷酸等試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備

木鱉子藥材40℃真空干燥至恒重后，去殼，取一定量粉碎，過40目篩。每批樣品稱取粉末1.5 g左右，精密稱定，置索氏提取器中。加石油醚（60℃～90℃）-三氯甲烷（1∶1）混合溶液150 mL，加熱回流1～2 h，棄去石油醚三氯甲烷混合溶液，濾紙筒揮盡溶劑。置圓底燒瓶中，加60%甲醇100 mL，加熱回流4 h，提取液水浴蒸干。殘?jiān)铀?0 mL使溶解并轉(zhuǎn)移至具塞試管中，加硫酸0.6 mL，搖勻，塞緊。置沸水浴中再加熱2 h，取出，放冷，濾過，棄去濾液，殘?jiān)由V甲醇8 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加硫酸1滴使溶液pH值至2.0，搖勻，定容。50℃水浴中放置4 h，取出放冷，加甲醇補(bǔ)至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2 對(duì)照品的制備

取絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯對(duì)照品適量，置于棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每1 mL含0.70 mg絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.1%的磷酸水溶液；柱溫30℃；流速0.25 mL/min。梯度洗脫程序如下：0～2 min，8%～25%A；2～3 min，25%～60%A；3～4 min，60%～8%A；4～6 min，8% A。檢測(cè)波長為203 nm，理論板數(shù)按絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000，對(duì)照品和木鱉子樣品的色譜圖見圖2。

圖2 對(duì)照品（A）和木鱉子樣品（B）的色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 設(shè)定UPLC自動(dòng)進(jìn)樣對(duì)照品溶液0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，絲石竹皂苷：Y=2.226 61E6X－232 040.2，r＝0.999 6。結(jié)果絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯在0.35～5.60 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度考察 精密吸取木鱉子對(duì)照品絲石竹皂苷1 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面積積分值，其RSD值為1.21%，儀器精密度表現(xiàn)良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取供試品（S1號(hào)樣品）1 μL，在上述色譜條件下定時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，時(shí)間間隔為0 h，1 h，2 h，4 h，6 h，12 h。記錄絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面積積分值，計(jì)算得其RSD值為1.46%，表明供試品至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性考察 取6份S2號(hào)樣品粉末，按照“2.1供試品的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品1 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定供試品絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面積積分值，計(jì)算得其RSD值為1.46%，供試品重復(fù)性表現(xiàn)良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份S20號(hào)樣品粉末，每份0.75 g左右，適量對(duì)照品溶液，按照“2.1供試品的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品1 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定供試品絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面積積分值，得其平均回收率為97.98%，RSD（%）為1.60，表明絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯回收率良好。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.4.6 樣品含量測(cè)定 分別取上述21批不同產(chǎn)地、批次木鱉子樣品粉末1.5g左右，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，各樣品溶液進(jìn)樣1 μL，以各成分峰面積按外標(biāo)法計(jì)算樣品中絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量，結(jié)果見表2。

表2 木鱉子樣品含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

3 討 論

超高相液相色譜（UPLC）法與高相液相色譜（HPLC）法比較具有分析時(shí)間快、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，在中藥質(zhì)量控制和指紋圖譜建立等研究中的應(yīng)用越來越廣泛［7-9］。本研究采用UPLC方法進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，在6 min左右就可完成1次進(jìn)樣，且色譜分離效果較為滿意。實(shí)驗(yàn)過程中考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)及梯度洗脫程序，也優(yōu)化了柱溫、流速、進(jìn)樣量等實(shí)驗(yàn)因素，最終得到該實(shí)驗(yàn)的色譜條件。

實(shí)驗(yàn)建立的絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯含量檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好，測(cè)定方法快速，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，可為木鱉子的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。木鱉子屬于常用中藥，《中國藥典》2015年版一部對(duì)木鱉子的含量控制指標(biāo)是以HPLC法測(cè)定其絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量，以含量不得少于0.25%為合格。在實(shí)驗(yàn)過程中，通過UPLC法對(duì)21個(gè)木鱉子供試樣品絲石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯測(cè)定結(jié)果表明，只有2批樣品含量低于《中國藥典》2015年版項(xiàng)下不低于0.25%規(guī)定，其他樣品總體質(zhì)量較好，同時(shí)也說明該質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)較為合理。

［1］國家藥典委員會(huì).中國藥典（一部）［S］.北京：中國中醫(yī)藥科技出版社，2015：65.

［2］趙連梅，韓麗娜，單保恩，等.木鱉子提取物體外抗腫瘤活性的初步研究［J］.癌變·畸變·突變，2010，22（1）：19-23.

［3］張丹，潘樂，江崢，等.木鱉子提取液抗氧化活性的分析［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，37（3）：319-321.

［4］孫付軍，路俊仙，崔璐，等.不同含油量木鱉子霜抗炎鎮(zhèn)痛作用比較［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（5）：1 084-1 085.

［5］Jung K，Lee D，Yu J S，et al.Protective effect and mechanism of action of saponins isolated from the seeds of gac（Momordica cochinchinensis Spreng.）against cisplatin-induced damage in LLC-PK1 kidney cells［J］.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2016，26（5）：1 466-1 470.

［6］Phani M M，Reddy D S，Venkataiah G.Preventive effect of momordica cochinchinensis（lour）.Spreng on high fat diet and along with low dose alloxan induced diabetic nephropathy and insulin resistance in rats［J］.Indo American Journal of Pharmaceutical Research，2013，3（12）：1 540-1 546.

［7］韓燕全，洪燕，桂潔，等.不同產(chǎn)地生、干、炮姜的UPLC指紋圖譜比較研究［J］.中成藥，2013，35（2）：356-359.

［8］韓燕全，洪燕，高家榮，等.基于UPLC特征指紋圖譜和指標(biāo)成分定量測(cè)定研究炮姜的炮制工藝［J］.中草藥，2013，44（1）：42-46.

［9］洪燕，韓燕全，夏倫祝，等.不同產(chǎn)地蒼耳子UPLC指紋圖譜研究［J］.中國中藥雜志，2013，38（11）：1 766-1 771.

（編輯：梁葆朱）

Determination of gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in Momordica cochinchinensis by UPLC

Cheng Zhiqing1，Han Guanglei1，Hong Yan2，Han Yanquan1，Zheng Xin2，Pan Lingyu2，Han Liping2
（1.The First Affiliated Hospital，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei Anhui 230031；2.Anhui University of Chinese Medicine，Hefei Anhui 230038）

Objective：To develop an UPLC method for determination of gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in Momordica cochinchinensis.Method：Gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester was determined on Waters BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with acetonitrile-0.1%phosphoric acid as mobile phase.The flow rate was 0.25 mL/min and the colum temperature was at 30℃.The detection wavelength was set at 203 nm.Results：The linear relationship between the concentration and the peak area of gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester was good at 0.35 μg to 5.60 μg（r=0.999 6）.The average recovery rate was 97.98%and RSD was 1.60%.Conclusion：The method is simple，rapid and good repeatability，and can be used for the quality control of Momordica cochinchinensis.

Momordica cochinchinensis；UPLC；gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester

R284.2

A

1671-0258（2017）02-0025-04

國家中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科臨床中藥學(xué)建設(shè)項(xiàng)目（國中醫(yī)藥人教發(fā)［2012］32號(hào)）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)臨床科研基金（2012LC1-019B）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)探索性科研項(xiàng)目（2016ts041）

程志清，副主任中藥師，E-mail：382117974@qq.com

韓燕全，博士，副主任中藥師，E-mail：hyquan2003@163.com