玉米秸稈和白菜尾菜混貯料的乳酸菌多樣性及耐高溫優(yōu)良菌株篩選

李志忠,竇俊偉,任海偉,,李金平,孫文斌,黃娟娟,李夢(mèng)玉(.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省生物質(zhì)能與太陽能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

玉米秸稈和白菜尾菜混貯料的乳酸菌多樣性及耐高溫優(yōu)良菌株篩選

李志忠1,竇俊偉1,任海偉1,2,3,李金平2,3,
孫文斌1,黃娟娟2,3,李夢(mèng)玉1
(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省生物質(zhì)能與太陽能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

通過形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析方法對(duì)玉米(Zeamays)秸稈和白菜(Brassicapekinensis)尾菜混貯料中的乳酸菌多樣性進(jìn)行分析，并以溫度和pH為限制因素篩選優(yōu)良乳酸菌菌株。結(jié)果表明，分離得到的12株乳酸菌分屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)。其中，1株(LB-1)為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，6株(LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9和LB-11)為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，3株(LB-5、LB-6和LB-12)為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，2株(LB-3和LB-10)為類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。菌株LB-3和LB-8表現(xiàn)出優(yōu)良的耐高溫、耐酸堿特性，且具有較強(qiáng)的產(chǎn)乳酸能力，二者可作為青貯飼料的乳酸菌添加劑。

玉米秸；尾菜；混合青貯；乳酸菌；多樣性；生長特性

隨著我國糧食種植面積和蔬菜生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，農(nóng)作物秸稈、尾菜等農(nóng)業(yè)廢棄物資源量逐年增加。作物秸稈和尾菜均含有豐富的有機(jī)質(zhì)成分，二者的季節(jié)性“爆炸”產(chǎn)出導(dǎo)致其在短期內(nèi)難以全部資源化利用(如飼料化、能源化等)，容易給生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重危害，如大量尾菜丟棄堆積常發(fā)生腐爛酸臭、細(xì)菌滋生等現(xiàn)象；秸稈焚燒造成大氣污染等危害。在我國大多地區(qū)，作物秸稈通常萎蔫或干黃后才收獲，水分和糖分的大量流失使其無法直接青貯。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，作物秸稈與花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytisLinnaeus)、白菜(Brassicapekinensis)、高丹草(Sorghumbicolor×S.sudanense)、白花草木樨(Melilotusalbus)等含水量高的植物進(jìn)行混貯，能夠調(diào)制出高品質(zhì)的動(dòng)物飼料[1-4]。另一方面，我國作物秸稈混貯多選擇在秋末冬初鮮草不足前進(jìn)行，這對(duì)緩解冬季飼料供應(yīng)緊張具有重要意義。但相對(duì)秋冬季節(jié)而言，夏秋季節(jié)的尾菜污染防治和秸稈飼料調(diào)制也有一定必要性。尾菜中富含水分和糖分，利用青貯原理將秸稈與尾菜進(jìn)行混合貯存，既能利用尾菜資源、消除尾菜帶來的環(huán)境污染，又能調(diào)制出高品質(zhì)的秸稈飼料，這對(duì)減少秸稈焚燒、加快秸稈飼料化利用、有效治理尾菜污染均具有積極意義[1]。

青貯發(fā)酵過程中乳酸菌的種類、數(shù)量及其產(chǎn)酸能力大小是決定貯存發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，因此了解混貯過程中的乳酸菌多樣性很有必要。同時(shí)，乳酸菌也是常用的細(xì)菌發(fā)酵促進(jìn)劑，添加乳酸菌能增加原料的乳酸菌數(shù)量，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，降低混貯料pH，抑制有害微生物生長，從而提高混貯品質(zhì)[5]。乳酸菌的一般生長溫度范圍是5～55 ℃，最適生長溫度為30～40 ℃，溫度過高或過低都會(huì)影響其生長和發(fā)酵品質(zhì)[6]。高溫條件(45～55 ℃)接種乳酸菌不能提高貯存發(fā)酵品質(zhì)，低溫條件(5～15 ℃)下乳酸菌發(fā)酵和pH下降緩慢，需要較長時(shí)間才能抑制有害微生物，因此篩選耐高溫或耐低溫的乳酸菌株十分重要[7]。近年來，許多學(xué)者就青貯用耐低溫乳酸菌的篩選和理化特性進(jìn)行了報(bào)道[8-9]，而有關(guān)耐高溫乳酸菌的報(bào)道相對(duì)較少。

蘭州市和武威市是甘肅省高原夏菜的主產(chǎn)區(qū)，年均尾菜產(chǎn)量高達(dá)300萬t[1]。為進(jìn)一步減緩夏秋季節(jié)的尾菜污染，促進(jìn)秸稈資源的飼料化利用，本研究選取含水量高、產(chǎn)量大的廢棄白菜和玉米秸稈進(jìn)行混合貯存，通過生理生化試驗(yàn)和16S rRNA序列分析等方法探明混貯料中的乳酸菌多樣性，并以溫度和pH為限制因素分離篩選耐高溫、高產(chǎn)乳酸優(yōu)良菌株，為夏秋高溫季節(jié)玉米秸稈和尾菜的混貯飼料調(diào)制提供可用的乳酸菌添加劑。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑

液體MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g；葡萄糖20 g；牛肉膏10 g；酵母浸膏5 g；吐溫-80 1 g；檸檬酸氫二氨2 g；乙酸鈉5 g；硫酸鎂0.1 g；硫酸錳0.05 g；磷酸氫二鉀2 g，加蒸餾水至1 000 mL，固體培養(yǎng)基添加瓊脂15 g。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：美國Biomiga公司；2×Taq MasterMix：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；DNA Marker-D：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離、純化與鑒定 玉米秸稈和白菜的混合青貯樣品為蘭州理工大學(xué)生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化利用實(shí)驗(yàn)室自制，其中秸稈和白菜分別切成1～2 cm長和2 cm×2 cm大小，按照21∶27質(zhì)量比例混勻，密閉貯存60 d后進(jìn)行乳酸菌的分離與鑒定[1]。在無菌環(huán)境中取混合青貯樣品25 g加入裝有225 mL無菌水的錐形瓶中，室溫振蕩2 h后菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，然后各取0.2 mL分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取不同的典型單菌落進(jìn)行分離純化，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)、生理生化特性檢測(cè)、分子生物學(xué)方法進(jìn)行綜合鑒定[1,10]。

1.2.2 耐高溫、高產(chǎn)乳酸菌株的篩選 將上述分離鑒定得到的菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)OD值繪制生長曲線并在48 h后測(cè)各菌株的乳酸濃度，初步篩選生長速度快、乳酸產(chǎn)量高的菌株。進(jìn)一步考察初篩菌株分別在不同溫度(20、30、37、42和50 ℃)和pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5)條件下連續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)的OD值和乳酸濃度，篩選耐高溫且具有一定耐酸性的優(yōu)良乳酸菌株。乳酸濃度測(cè)定采用SBA-40X三通道生物傳感分析儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件繪制圖表，并用SPSS 20軟件對(duì)不同溫度和pH處理的OD值和乳酸濃度進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)觀察，挑選乳白色、中央凸起、表面光滑的菌落，革蘭氏染色為陽性和過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性的菌落初步判定為乳酸菌，共分離得到12株，編號(hào)分別為LB-1、LB-2、LB-3、LB-4、LB-5、LB-6、LB-7、LB-8、LB-9、LB-10、LB-11、LB-12。12株乳酸菌的生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。

各菌株硝酸鹽還原和明膠液化試驗(yàn)均為陰性，且都能在pH 4.5條件下正常生長(表1)。所有菌株均不產(chǎn)生吲哚，且硫化氫不產(chǎn)氣。菌株LB-1、LB-3、LB-5、LB-6、LB-10、LB-12初步認(rèn)定為乳桿菌屬(Lactobacillus)。LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9、LB-11初步認(rèn)定為片球菌屬(Pediococcus)。由糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果可知(表2)， LB-1能利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，不能水解精氨酸，除阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖和木糖外的其它糖類和醇類均能進(jìn)行發(fā)酵，初步認(rèn)定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9、LB-11為球菌，可以發(fā)酵阿拉伯糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、水楊苷、海藻糖、纖維二糖，其生理生化性狀與片球菌屬相似，初步鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，與陶雅等[11]鑒定戊糖片球菌的結(jié)果一致； LB-5、LB-6、LB-12可水解精氨酸，能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可利用果糖、半乳糖和蜜二糖產(chǎn)酸，可初步認(rèn)為是異型的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)；LB-3和LB-10能利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，而且能發(fā)酵七葉苷、果糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、蜜二糖、甘露醇、纖維二糖、木糖、海藻糖和山梨醇，與于佳弘等[12]對(duì)玉米(Zeamays)青貯的研究結(jié)果基本一致，可初步認(rèn)定為類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

表1 乳酸菌屬水平的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of lactic acid bacteria at the genus level

注：“+”表示陽性；“—”表示陰性。表2同。

Note： “+”represent positive； “—”represent negative. similary for the Table 2.

表2 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of sugar fermentation test

為進(jìn)一步準(zhǔn)確判定乳酸菌種屬情況，進(jìn)行了16S rRNA分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)，將測(cè)序結(jié)果與Microbes Nucleotide數(shù)據(jù)庫中已知的菌種序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出與目的序列同源性最高的菌種。LB-1與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高(表3)；LB-5、LB-6、LB-12與短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)同源性最高；菌株LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9、LB-11與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)同源性最高；菌株LB-3、LB-10與類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)同源性最高。

表3 16S rRNA同源性比對(duì)結(jié)果Table 3 Results of 16S rRNA homology comparison

構(gòu)建12株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示。12株乳酸菌分別屬于乳桿菌屬和片球菌屬， 其中菌株LB-1與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)相似性達(dá)99%；菌株LB-5、LB-6、LB-12與Lactobacillusbrevis的親緣關(guān)系比其它菌株近，可鑒定為短乳桿菌；菌株LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9、LB-11與Pediococcuspentosaceus以98%的相似度在同一聚類上，可鑒定它們?yōu)槲焯瞧蚓?；菌株LB-3與Lactobacillusparacasei以99%的相似度聚在一支上，結(jié)合16S rRNA同源性比對(duì)結(jié)果，確定LB-3和LB-10為類干酪乳桿菌。

2.2 12株分離乳酸菌的生長特性研究

LB-3、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9、LB-10和LB-11具有相似生長趨勢(shì)，3～9 h處于對(duì)數(shù)生長期，12 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，48 h時(shí)未觀察到衰退現(xiàn)象[13](圖2)。LB-2和LB-6生長速率較慢，6 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，二者分別于9和12 h趨于穩(wěn)定。LB-5和LB-12在0 h時(shí)即迅速繁殖，且分別于9和6 h時(shí)進(jìn)入生長穩(wěn)定期。LB-1在3～6 h為對(duì)數(shù)生長期。

12株乳酸菌株培養(yǎng)48 h的產(chǎn)乳酸能力如圖3所示。LB-1、LB-3、LB-8和LB-9的乳酸濃度分別為1 730、1 920、2 820和2 340 mg·L-1，顯著高于其它菌株(P<0.05)。結(jié)合圖2菌株生長速率，初步選取LB-1、LB-3、LB-8和LB-9作為高產(chǎn)乳酸的初篩菌用于進(jìn)一步篩選。

圖1 基于16S rRNA基因序列建立的乳酸菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of lactic acid bacteria strains

注：圖中分支數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中該分支可信度百分?jǐn)?shù)；標(biāo)尺表示序列差異度。

Note：Numbers in tree branch represent percentage of confidence for each branch; scale represent difference in sequence.

2.3 4株初篩乳酸菌株的產(chǎn)酸速率曲線

LB-1和LB-3的產(chǎn)酸速率較快，9 h時(shí)pH降至最低值3.8(圖4)；LB-8和LB-9的產(chǎn)酸速率較慢，21 h時(shí)pH降至最低值3.9，這與張慧杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)的乳酸桿菌較乳酸球菌具有更強(qiáng)的產(chǎn)酸能力結(jié)果基本一致。

4株初篩菌在不同溫度時(shí)的生長代謝性能有很大差異。整體上看，50 ℃時(shí)的OD值均明顯低于其它溫度，乳酸產(chǎn)量也明顯低于其它溫度(圖5)；可見這4株顯著低于LB-3和LB-8(P<0.05)。說明菌株LB-3和LB-8在pH為4.5～8.5時(shí)均能良好生長且有較強(qiáng)的乳酸菌均不適宜在50 ℃時(shí)生長，20～42 ℃的溫度范圍則有利于菌株繁殖，但LB-9在42 ℃幾乎不生長，予以篩除。從產(chǎn)乳酸角度看，20～42 ℃有利于乳酸生成和累積。雖然LB-1繁殖能力強(qiáng)，但其在不同溫度時(shí)的產(chǎn)乳酸能力顯著低于LB-3和LB-8(P<0.05)，故LB-1予以篩除(圖6)。42 ℃時(shí)LB-3和LB-8的乳酸產(chǎn)量較高，由于乳酸菌的理論適宜溫度為37 ℃，因此初步判定LB-3和LB-8具有一定的耐高溫生長特性。

圖2 12株乳酸菌的生長曲線Fig. 2 Growth curve of 12 lactic acid bacteria

圖3 12株乳酸菌的乳酸濃度Fig. 3 Lactic acid concentrations in 12 lactic acid bacteria

注：不同小寫字母表示不同乳酸菌產(chǎn)酸量之間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference among different lactic acid concentration at the 0.05 level. similarly for the following figures.

圖4 4株初篩乳酸菌株的產(chǎn)酸速率曲線Fig. 4 Acid production rate in preliminary screening of 4 lactic acid bacteria

2.4 4株初篩乳酸菌株的耐酸性比較

4株初篩乳酸菌在較低pH(≤3.5)時(shí)的OD值很低，不適合生長繁殖(圖7)。pH為4.5～7.5時(shí)4株乳酸菌的OD值較高，適宜生長且能產(chǎn)生一定量乳酸，但LB-1和LB-9在pH為8.5的弱堿性條件下時(shí)OD值耐酸性和偏堿環(huán)境適應(yīng)能力，尤其LB-8菌株在pH為4.5～8.5時(shí)的產(chǎn)酸能力均顯著高于其它菌株(P<0.05)(圖8)。

圖5 4株初篩乳酸菌株在不同溫度時(shí)的OD值Fig. 5 OD values in preliminary screening of 4 lactic acid bacteria under different temperatures

圖6 4株初篩乳酸菌株在不同溫度時(shí)的乳酸濃度Fig. 6 Lactic acid concentration in preliminary screening of 4 lactic acid bacteria under different temperatures

圖7 4株初篩乳酸菌株在不同初始pH時(shí)的OD值Fig. 7 OD values of in preliminary screening of 4 lactic acid bacteria under different initial pH

圖8 4株初篩乳酸菌株在不同初始pH時(shí)的乳酸濃度Fig. 8 Lactic acid concentration in preliminary screening of 4 lactic acid bacteria under different initial pH

3 討論

3.1 混貯料的乳酸菌多樣性

青貯飼料中常見的乳酸菌包括乳桿菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬和魏斯氏菌屬(Weissella)等[15]。Pang等[16]從玉米秸稈青貯料中分離得到了植物乳桿菌、短乳桿菌、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)、魏斯氏乳酸菌(Weissellacibaria)和蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)。何軼群等[17]從玉米秸稈青貯料中分離鑒定出植物乳桿菌、戊糖片球菌、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)和腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.)。王彥蘇等[18]從水稻(Oryzasativa)秸稈中分離得到干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)和耐乙醇片球菌(P.ethanolidurans)。阿布都克尤木·麥麥提等[19]從小麥(Triticumaestivum)秸稈中分離得到副干酪乳桿菌亞種(Lactobacillusparacaseisubsp.)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、腸球菌(Enterococcusfaeciu)。張永輝等[20]從新疆棉花(Gossypium)秸稈中分離出了植物乳桿菌和戊糖片球菌。陶雅等[11]從短芒大麥(Hordeumbrevisubulatum)草中分離得到類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)、戊糖乳桿菌、短乳桿菌和戊糖片球菌。本研究從玉米秸/白菜混貯料中分離得到植物乳桿菌、戊糖片球菌、類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)和短乳桿菌，混貯發(fā)酵體系中的乳酸桿菌較乳酸球菌豐富，這與陶雅等[11]分離得到的乳酸桿菌屬較片球菌屬多的結(jié)果一致，但與其它文獻(xiàn)報(bào)道有所差異，這可能是青貯原料來源、青貯發(fā)酵的生化反應(yīng)過程、環(huán)境溫度等因素不同所致。

3.2 耐高溫優(yōu)良乳酸菌株的篩選

發(fā)酵過程的乳酸菌數(shù)量及其生長特性是青貯成功與否的關(guān)鍵因素，而發(fā)酵品質(zhì)的主要限制因素是缺少高活性、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌[21-22]。干秸稈或尾菜等原料自身附著的乳酸菌數(shù)量少，導(dǎo)致青貯發(fā)酵過程較慢[1,10]。通過添加優(yōu)良的乳酸菌制劑等方法可加快青貯過程中的乳酸發(fā)酵進(jìn)程，有效改善青貯品質(zhì)，因此篩選生長繁殖速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌很有必要。

本研究分離得到的植物乳桿菌、戊糖片球菌和類干酪乳桿菌為同型發(fā)酵乳酸菌，短乳桿菌為異型發(fā)酵乳酸菌。依據(jù)乳酸菌代謝理論，同型發(fā)酵乳酸菌能夠利用1分子葡萄糖產(chǎn)生2分子乳酸，迅速降低環(huán)境pH，是青貯發(fā)酵的主導(dǎo)菌群；而異型發(fā)酵乳酸菌利用1分子葡萄糖僅能產(chǎn)生1分子乳酸，效率僅為同型發(fā)酵乳酸菌的17%～50%[23]。本研究初篩得到的LB-1、LB-3、LB-8和LB-9均為同型發(fā)酵乳酸菌，生產(chǎn)繁殖能力和產(chǎn)酸能力強(qiáng)。其中，LB-1生長速率最快，但產(chǎn)乳酸能力低于LB-3、LB-8和LB-9；LB-3的pH下降最快，產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)，這與趙婧等[24]研究得出類干酪乳桿菌產(chǎn)酸量高結(jié)果一致，并且LB-3在高溫條件下乳酸大量積累；LB-8在不同溫度及不同pH條件下乳酸濃度最高，這與保安安等[25]研究得出戊糖片球菌可迅速降低青貯料pH結(jié)果基本一致；LB-9雖產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，但在42 ℃時(shí)生長緩慢。

研究表明，高溫(30～40 ℃)青貯容易產(chǎn)生丁酸發(fā)酵，發(fā)酵品質(zhì)較差；低溫(5～15 ℃)青貯則發(fā)酵強(qiáng)度較弱，需要較長時(shí)間來抑制腸桿菌、芽孢桿菌和酵母等腐敗微生物[6-7]。Wang和Nishino[26]認(rèn)為高溫青貯時(shí)乳酸菌、好氧性細(xì)菌和酵母菌的繁殖及乳酸發(fā)酵會(huì)被抑制，乙酸發(fā)酵增強(qiáng)。因此在夏秋高溫季節(jié)的玉米秸/尾菜混貯過程中，添加優(yōu)良的耐高溫乳酸菌株有利于提高混貯成功率，改善發(fā)酵品質(zhì)。研究中分離得到的菌株LB-3和LB-8在42 ℃高溫時(shí)具有較強(qiáng)的生長能力和產(chǎn)乳酸能力，符合McDonald等[27]提出的理想青貯用乳酸菌添加劑標(biāo)準(zhǔn)。建議類干酪乳桿菌LB-3與戊糖片球菌LB-8可以制成復(fù)合乳酸菌劑用于夏秋季節(jié)高溫青貯飼料的調(diào)制。復(fù)合乳酸菌劑的組成多樣性有利于各菌株之間發(fā)揮協(xié)同作用，提高青貯品質(zhì)[28]。但是該復(fù)合乳酸菌劑是否能提高青貯品質(zhì)還有待研究。

4 結(jié)論

從玉米秸/尾菜混貯料中共分離出12株乳酸菌，通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析和16S rRNA 鑒定，LB-1是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，LB-3和LB-10是類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，LB-5、LB-6和LB-12是短乳桿菌(Lactobacillus.brevis)，LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9和LB-11是戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。其中菌株LB-3和LB-8產(chǎn)酸能力強(qiáng)且都具有優(yōu)良的耐酸堿、耐高溫特性，可作為良好的乳酸菌青貯菌劑應(yīng)用于青貯飼料中。

References:

[1] 任海偉,趙拓,李金平,李雪雁,李志忠,徐娜,王永剛,喻春來,高曉航,王曉力.玉米秸稈與廢棄白菜混貯料的發(fā)酵特性及其乳酸菌分離鑒定.草業(yè)科學(xué),2015,32(9):1508-1517. Ren H W,Zhao T,Li J P,Li X Y,Li Z Z,Xu N,Wang Y G,Yu C L,Gao X X,Wang X L.Identification of lactic acid bacteria and fermentation characteristics for mixed ensilages of corn stover and cabbage waste.Pratacultural Science,2015,32(9):1508-1517. (in Chinese)

[2] 楊道蘭,汪建旭,馮煒弘.花椰菜莖葉與玉米秸稈的混貯品質(zhì).草業(yè)科學(xué),2014,31(3):551-557. Yang D L,Wang J X,Feng W H.Effects of broccoli stems and leaves and maize straw mix-ensiling on silage quality.Pratacultural Science,2014,31(3): 551-557.(in Chinese)

[3] 梁歡,劉貴波,吳佳海,曾兵,李源,游永亮,趙海明.混貯模式對(duì)高丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)及體外產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)特性的影響.草業(yè)學(xué)報(bào),2016,25(4):188-196. Liang H,Liu G B,Wu J H,Zeng B,Li Y,You Y L,Zhao H M.Effects of mixed sila-ge modes on the fermentation quality and in vitro gas dynamics of a sorghumsuda-ngrass hybrid (Sorghumbicolor×Sorghumsudanense).Acta Prataculturae Sinica,2016,25(4):188-196.(in Chinese)

[4] 李樹成,黃曉輝,王靜,李東華,王彥榮.白花草木樨與玉米秸稈混合青貯的發(fā)酵品質(zhì)及有毒成分分析.草業(yè)科學(xué),2014,31(2):321-327. Li S C,Huang X H,Wang J,Li D H,Wang Y R.Effects different mixed ratio and fermenting period on efficiency of mixed silage ofMelilotusalbusand straw.Pratacultural Science,2014,31(2):321-327.(in Chinese)

[5] 張慶,張萬軍,田吉鵬,王雨,李旭嬌,玉柱.乳酸菌青貯技術(shù)研究進(jìn)展.草業(yè)科學(xué),2014,31(2):328- 333. Zhang Q,Zhang W J,Tian J P,Wang Y,Li X J,Yu Z.Advances in lactic acid bacteria silage technology research.Pratacultural Science,2014,31(2):328-333.(in Chinese)

[6] 劉飛.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其應(yīng)用.黑龍江：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2005. Liu F.Identification of lactic acid bacteria species isolated from silage and their application for silage preparation.Master Thesis:Heilongjiang:Northeast Agricultural University,2005.(in Chinese)

[7] 劉秦華,李湘玉,李君風(fēng),白晰,張建國,邵濤,吳琳,趙新國,田佳鷺.溫度和添加劑對(duì)象草青貯發(fā)酵品質(zhì)、α-生育酚和β-胡蘿卜素的影響.草業(yè)學(xué)報(bào),2015,24(7):116-122. Liu Q H,Li X Y,Li J F,Bai X,Zhang J G,Shao T,Wu L,Zhao X G,Tian J L.Effects of additives on the fermentation quality,α-tocopherol and β-carotene of napier grass (PennisetumpurpureumSchumach.) silage.Acta Prataculturae Sinica,2015,24(7):116-122.(in Chinese)

[8] 陳明霞,劉秦華,張建國.耐低溫乳酸菌的篩選鑒定及其對(duì)黑麥草青貯的影響.草地學(xué)報(bào),2016,24(2):409-415. Chen M X,Liu T H,Zhang J G.Identification of lactic acid bacteria isolates and their inoculating effects on the silage fermentation of Italian ryegrass at low temperature.Acta Agrectir Sinica 2016,24(2):409-415.(in Chinese)

[9] 儲(chǔ)徐建,李長慧,劉明燦,李彩娟,趙明霞.耐低溫乳酸菌的分離與優(yōu)化培養(yǎng).草業(yè)科學(xué),2014,31(7):1380-1387. Chu X J,Li C H,Liu M C,Li C J,Zhao M X.Isolation and optimization of low temperature lactic acid bacteria.Pratacultural Science,2014,31(7):1380-1387.(in Chinese)

[10] 任海偉,趙拓,李金平,李雪雁,徐娜,王永剛,王曉力,高曉航.玉米秸稈與廢棄白菜的混貯品質(zhì)及乳酸菌多樣性研究.草業(yè)學(xué)報(bào),2016,25(1):197-206. Ren H W,Zhao T,Li J P,Li X Y,Xu N,Wang Y G,Wang X L,Gao X H.Quality and lactic acid bacteria of mixed corn stalk and cabbage waste silage.Acta Prataculturae Sinica,2016,25(1):197-206.(in Chinese)

[11] 陶雅,李峰,高鳳芹,孫啟忠.短芒大麥草青貯微生物特性研究及優(yōu)良乳酸菌篩選.草業(yè)學(xué)報(bào),2015(12):66-73. Tao Y,Li F,Gao F Q,Sun Q Z.Microbial characteristics ofHordeumbrevisubulatumsilage and screening for lactic acid bacteria with high fermentation performance.Acta Prataculturae Sinica,2015,24(12):66-73.(in Chinese)

[12] 于佳弘,羅紅霞,楊新建,汪長鋼,賈紅亮.玉米青貯中乳酸菌的分離鑒定及特性研究.食品工業(yè),2015,36(9):199-203. Yu J H,Luo H X,Yang X J,Wang C G,Jia H L.Isolation and identification of lactic acid bacteria in corn silage characteristic research.The Food Industry,2015,36(9):199-203.(in Chinese)

[13] 崔棹茗,郭剛,原現(xiàn)軍,李君風(fēng),楊曉丹,丁良,余成群,邵濤.青稞秸稈青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的篩選及鑒定.草地學(xué)報(bào),2015,23(3):607-615. Cui Z M,Guo G,Yuan X J,Li J F,Yang X D,Ding L,Yu C Q,Shao T.In the highland barley straw silage fine screening and identification of lactic acid bacteria.Journal of Grassland,2015,23(3):607-615.(in Chinese)

[14] 張慧杰,玉柱,王林,蔡義民,李峰,陶雅,孫啟忠.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選.草地學(xué)報(bào),2011,19(1):137-141. Zhang H J,Yu Z,Wang L,Cai Y M,Li F,Tao Y,Sun Q Z.Silage good strains of lactic acid bacteria isolation and identification of screening.Journal of Grassland,2011,19(1):137-141.(in Chinese)

[15] Han L Y,Zhou H.Effects of ensiling processes and antioxidants on fatty acid concentrations and compositions in corn silages.Journal of Animal Science and Biotechnology,2013,4(2):1-7.

[16] Pang H L,Zhang M,Qin G Y,Tan Z F,Li Z W,Wang Y P,Cai Y M.Identification of lactic acid bacteria isolated from corn stovers.Applied Dairy Microbiology,2011,82(5):642-653.

[17] 何軼群,雷趙民,吳潤,萬學(xué)瑞,刁小龍,艾文娜.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究.生物技術(shù)通報(bào),2013(5):177-183. He Y Q,Lei Z M,Wu R,Wan X R,Diao X L,Ai W N.Isolation and identification of excellent lactic acid bacteria from silage and its biological characteristics research.Biotechnology Bulletin,2013(5):177-183.(in Chinese)

[18] 王彥蘇,張一凡,嚴(yán)振亞,丁成龍,戴傳超.水稻秸稈青貯飼料中可培養(yǎng)微生物多樣性分析及優(yōu)勢(shì)乳酸菌的分離鑒定.草地學(xué)報(bào),2014,22(3):586-592. Wang Y S,Zhang Y F,Yan Z Y,Ding C L,Dai C C.Isolation and identification of lactic acid bacteria analysis of cultivable microbial diversity in rice straw silage.Journal of Grassland,2014,22(3):586-592.(in Chinese)

[19] 阿布都克尤木·麥麥提,熱娜·阿布都米吉提,烏斯?jié)M·依米提.小麥秸稈發(fā)酵液中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的分離·純化與鑒定.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(35):21824-21828. Abduldymn·Mamat,Rena·Abdumijt,Wusiman·Yimit.Isolation and identification of high-quality lactic acid bacteria from wheat Haulm.Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39(35):21824-21828.(in Chinese)

[20] 張永輝,嚴(yán)萍,阿布都克尤木·麥麥提,麥熱姆妮薩·艾麥爾,樊振,烏斯?jié)M·依米提.新疆棉花秸稈中乳酸菌的分離與鑒定.飼料工業(yè),2011,32(17):36-39. Zhang Y H,Yan P,Abduldymn·Mamat,Maremnisa·Aimaier,Fan Z,Wusiman·Yimit.Isolation and identification of lactic acid bacteria from cotton stalk in Xinjiang.Feed Industry Magazine,2011,32(17):36-39.(in Chinese)

[21] Santos A O,vila C L S,Pinto J C,Carvalho B F,Dias D R,Schwan R F.Fermentative profile and bacterial diversity of corn silages inoculated with new tropical lactic acid bacteria.Brain Research,2015,793(1-2):321-327.

[22] 董志浩,原現(xiàn)軍,聞愛友,王堅(jiān),郭剛,李君風(fēng),白晰,周順陶,邵濤.添加乳酸菌和發(fā)酵底物對(duì)桑葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響.草業(yè)學(xué)報(bào),2016,25(6):167-174. Dong Z H,Yuan X J,Wen A Y,Wang J,Guo G,Li J F,Bai X,Zhou S T,Shao T.Effect of lactic acid bacteria and fermentation substrates on the quality of mulberry(Morusalba) leaf silage.Acta Prataculturae Sinica,2016,25(6):167-174.(in Chinese)

[23] 徐春城.現(xiàn)代青貯理論與技術(shù).北京：科學(xué)出版社,2012:76-77. Xu C C.Silage Science and Technology.Beijing:Science Press,2012:76-77.(in Chinese)

[24] 趙婧,李慧,張玉玉,周春麗,宋弋,李全宏.高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選、鑒定和生長特性研究.食品工業(yè)科技,2013,34(3):173-176. Zhao J,Li H,Zhang Y Y,Zhou C L,Song Y,Li Q H.Screening,identification and growth characteristics of high acid-producing lactic acid bacteria.Science and Technology of Food Industry,2013,34(3):173-176.(in Chinese)

[25] 保安安,張娟,張紅梅,柯文燦,陳明,荊佩欣,郭旭生.青藏高原垂穗披堿草青貯飼料中乳酸菌的多樣性及低溫發(fā)酵菌株的篩選.微生物學(xué)通報(bào),2016,43(8):1785-1794. Bao A A,Zhang J,Zhang H M,Ke W C,Chen M,Jing P X,Guo X S.Screening of low-temperature fermentation lactic acid bacteria from silage ofElymusnutansgrowing on the Qinghai-Tibetan Plateau.Microbiology China,2016,43(8):1785-1794.(in Chinese)

[26] Wang C,Nishino N.Effects of storage temperature and ensiling period on fermentation products，aerobic stability and microbial communities of total mixed ration silage.Journal of Applied Microbiology,2013,114(6):1687-1695.

[27] McDonald P,Henderson A R,Heron S J E.The Biochemistry of Silage.2nd ed.Aberystwyth:Cambrian Printers Ltd.,1991.

[28] 張紅梅,柯文燦,荊佩欣,張娟,陳明,于應(yīng)文,郭旭生.青藏高原乳酸菌對(duì)垂穗披堿草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響.微生物學(xué)報(bào),2015,55(10):1291-1297. Zhang H M,Ke W C,Jin P X,Zhang J,Chen M,Yu Y W,Guo X S.Effect of lactic acid bacteria isolated from Tibetan Plateau on silage fermentation quality ofElymusnutans.Microbiology China,2015,55(10):1291-1297.(in Chinese)

(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Lactic acid bacteria diversity analysis and screening of superior thermotolerant strains from corn stover and cabbage waste mixed-silages

Li Zhi-zhong1, Dou Jun-wei1, Ren Hai-wei1,2,3, Li Jin-ping2,3, Sun Wen-bin1, Huang Juan-juan2,3, Li Meng-yu1
(1.School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China; 2.China Western Energy & Environment Research Center, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China; 3.Key Laboratory of Complementary Energy System of Biomass and Solar Energy, Lanzhou 730050, China)

Morphological observation, physiological and biochemical tests, and the 16S rRNA sequence analysis methods were used to analyse lactic acid bacteria (LAB) diversity in mixed silage of corn stover and cabbage, and the thermotolerant strains were screened through with temperature and pH as the restrictive indicators. The results showed that 12 LAB strains were isolated from mixed silage, which were classified intoLactobacillusandPediococcus, respectively. Specifically, one strain (LB-1) wasLactobacillusplantarum, six strains (LB-2, LB-4, LB-7, LB-8, LB-9 and LB-11) werePediococcuspentosaceus, three strains (LB-5, LB-6 and LB-12) wereLactobacillusbrevis, and two strains (LB-3 and LB-10) wereLactobacillusparacasei. The characteristics of LB-3 and LB-8 included high-temperature resistance, acid-resistance and higher acid-production ability. Therefore, these two lactic acid bacteria can be used as inoculants for silage forage.

corn stover; vegetable waste; mixed silage; lactic acid bacteria; diversity; growth characteristics

Ren Hai-wei E-mail：rhw52571119@163.com

2016-08-23 接受日期：2017-03-04

國家自然科學(xué)基金(51366009、51666010)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)(2014AA052801)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1506RJYA106、1508RJYA097)；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-2-20)

李志忠(1963-)，男，甘肅靖遠(yuǎn)人，教授，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：zzli2004@lut.cn

任海偉(1983-)，男，山西孝義人，副教授，博士，主要從事可再生能源與環(huán)境工程研究。E-mail：rhw52571119@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0442

S816.32

A

1001-0629(2017)06-1337-10

李志忠,竇俊偉,任海偉,李金平,孫文斌,黃娟娟,李夢(mèng)玉.玉米秸稈和白菜尾菜混貯料的乳酸菌多樣性及耐高溫優(yōu)良菌株篩選.草業(yè)科學(xué),2017,34(6)：1337-1346.

Li Z Z,Dou J W,Ren H W,Li J P,Sun W B,Huang J J,Li M Y.Lactic acid bacteria diversity analysis and screening of superior thermotolerant strains from corn stover and cabbage waste mixed-silages.Pratacultural Science，2017,34(6)：1337-1346.