萼脊蘭MADS-box基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

蔣素華，黃 萍，王默霏，梁 芳，許申平，崔 波

(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450)

萼脊蘭MADS-box基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

蔣素華1，黃 萍2，王默霏1，梁 芳1，許申平1，崔 波1

(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450)

為了研究“ABC”模型的B類PI基因，探究決定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊蘭花瓣總RNA，并通過RT-PCR法克隆萼脊蘭PI基因的編碼序列，該序列長(zhǎng)度為633 bp，編碼210個(gè)氨基酸，與小蘭嶼蝴蝶蘭的氨基酸相似性最高。對(duì)PI所表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、親水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，該基因包含MADS-box和K-box保守結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box基因家族；該蛋白分子屬于親水性蛋白，包含56.19% α螺旋、13.81% 的延伸鏈以及30%的不規(guī)則折疊，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，PI基因主要在花器官中表達(dá)，且表達(dá)量高，說明PI基因的表達(dá)具有組織特異性。構(gòu)建植物表達(dá)載體的結(jié)果顯示，目的基因和帶啟動(dòng)子的片段已插入到表達(dá)載體pCAMBIA1301中，表明成功構(gòu)建植物表達(dá)載體1301-PI，為最終獲得新奇花型的萼脊蘭奠定基礎(chǔ)。

萼脊蘭；PI基因；克??；表達(dá)分析；表達(dá)載體

萼脊蘭(Sedireajaponica)屬單子葉植物蘭科萼脊蘭屬，花瓣長(zhǎng)圓狀舌形，具橘子香氣，具有較高的園藝價(jià)值以及一定的藥用價(jià)值，養(yǎng)護(hù)簡(jiǎn)單且觀賞期長(zhǎng)，因而越來越受到人們的關(guān)注和喜愛[1-3]?；òl(fā)育是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中極為重要的環(huán)節(jié)，花的分化從生殖生長(zhǎng)開始，即營(yíng)養(yǎng)分生組織分化為花序分生組織，進(jìn)而分化為花分生組織形成花器官原基，最終形成花器官[4-6]。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對(duì)花卉的基因研究以及育種研究越來越受到重視。蘭科植物作為極度特化的開花植物，其花結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出獨(dú)特的進(jìn)化特征，如唇瓣的特化和合蕊柱的形成，這為人們研究新的變異基因以及花的形態(tài)建成提供了良好的組織材料[7-10]?；ㄆ鞴偈侵参锷尺^程中重要的功能器官，花發(fā)育遺傳機(jī)制的研究促進(jìn)了人們對(duì)被子植物花結(jié)構(gòu)進(jìn)化的進(jìn)一步了解[11-13]。被子植物的花從外向內(nèi)分別為：萼片、花瓣、雄蕊、心皮和胚珠，人們?cè)趯?duì)擬南芥和金魚草突變體的研究中發(fā)現(xiàn)了植物發(fā)育的同源異形現(xiàn)象以及產(chǎn)生同源異形突變的器官?zèng)Q定基因，這些基因在花發(fā)育過程中起著“開關(guān)”的作用[7]?！癆BC模型”是最早提出的有關(guān)花器官形成的理論，其要點(diǎn)是，正常花器官結(jié)構(gòu)的形成由A、B、C 3類基因的共同作用來完成，每一輪花器官特征的決定分別依賴A、B、C 3類基因中的一類或兩類基因的正常表達(dá)，若其中任何一類或更多類的基因發(fā)生突變而喪失功能，則花的形態(tài)發(fā)生將出現(xiàn)異常，A類基因控制第1，2輪的發(fā)育，B類基因控制第2，3輪的發(fā)育，C類基因控制第3，4輪的發(fā)育。ABC模型中的基因大都屬于MADS-box基因家族，它們的功能高度保守，多參與花發(fā)育的調(diào)控機(jī)制[14-16]。PI基因是調(diào)控植物花器官發(fā)育的B類基因，它控制植物花瓣和雄蕊的發(fā)育，含有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box家族基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子能與相應(yīng)的DNA區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄。它的突變能導(dǎo)致第2輪花瓣變?yōu)檩嗥?輪雄蕊變?yōu)樾钠?，所以，?duì)PI基因進(jìn)行研究意義重大[17-19]。為此，本研究采用RT-PCR法從萼脊蘭花瓣中擴(kuò)增PI基因，并對(duì)所擴(kuò)增的基因進(jìn)行序列檢測(cè)與分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在盛花期不同部位的表達(dá)特性，構(gòu)建高效植物載體pCAMBIA1301-PI，旨在為進(jìn)一步研究蘭科植物PI基因功能以及獲得萼脊蘭新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

E.coliDH5α菌株、中間載體pBI221、表達(dá)載體pCAMBIA1301由鄭州師范學(xué)院生物工程研究所保存，RNA提取試劑盒購(gòu)自天根有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、克隆載體pMD19-T Vector、rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)、質(zhì)粒小提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)于TaKaRa公司，LB固體及液體培養(yǎng)基、抗生素卡那霉素、氨芐青霉素均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)材料

萼脊蘭采自鄭州師范學(xué)院蘭花工程技術(shù)研究中心，在盛花期分別取萼脊蘭的根、葉、萼片、花梗、花瓣、唇瓣、蕊柱，用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1PI基因的克隆 按照CTAB法提取萼脊蘭花瓣總RNA，以提取的總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI上報(bào)道的PI基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引物ORF-F為5′-ACGAGCTCATGGGTCGGGGGAAGATAGA-3′，下游引物ORF-R為5′-CATCTAGA

TTACTTATTTCCCTGCAAGTT-3′，在2個(gè)引物的5′端分別用下劃線標(biāo)明了酶切位點(diǎn)(SacⅠ和XbaⅠ)。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為20 μL體系，其中包含dNTP Mix 2 μL、10×PCR Buffer 2 μL、上游引物ORF-F 1 μL、下游引物ORF-R 1 μL、萼脊蘭cDNA 1 μL、rTaq酶0.2 μL，加滅菌水至總體積20 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

電泳檢測(cè)后進(jìn)行凝膠回收，然后將擴(kuò)增的cDNA克隆到pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑選擇，挑出白色單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽性克隆進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3.2PI基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的Blast工具對(duì)已有PI基因序列進(jìn)行檢索，并使用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析；利用ExPASy網(wǎng)站上的ProtScale程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行親疏水性分析，并利用該網(wǎng)站上的GOR工具對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.3PI基因的表達(dá)分析 以PI基因序列的ORF區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以萼脊蘭EF1α作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行PI基因在萼脊蘭中的表達(dá)分析。分別提取萼脊蘭盛花期的根、葉、萼片、花梗、花瓣、唇瓣、蕊柱的總RNA，使用TaKaRa的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第1鏈。采用三步法 qRT-PCR，20 μL 反應(yīng)體系包括 10 μL 2×SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)、0.8 μL的上、下游基因特異性引物及各個(gè)樣本的 cDNA 1.4 μL，并補(bǔ) dH2O至20 μL。qRT-PCR所用儀器為Eppendorf Mastercycler ep realplex2，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，陰性對(duì)照為水。目的基因相對(duì)表達(dá)量Rel.Exp = 2-ΔΔCt，其中ΔCt =Ct (PI)-Ct (EF1α)，ΔΔ Ct =植物各組織ΔCt-花梗ΔCt。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的PI-ORF-T以及保存的載體pBI221和pCAMBIA1301按照質(zhì)粒小提試劑盒的說明進(jìn)行提質(zhì)粒操作，然后用SacⅠ和XbaⅠ對(duì)PI-ORF-T進(jìn)行雙酶切后與同樣經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ雙酶切的pBI221載體進(jìn)行連接，獲得中間載體pBI221-PI，再用EcoRⅠ和Hind Ⅲ將目的基因從中間載體中切下，然后與同樣經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的pCAMBIA1301表達(dá)載體進(jìn)行連接，從而構(gòu)建成植物表達(dá)載體1301-PI。

2 結(jié)果與分析

2.1 萼脊蘭總RNA的提取

提取萼脊蘭盛花期的根、葉、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱總RNA，電泳檢測(cè)顯示(圖1)，總RNA具有完整的28S、18S、5S，3條條帶均顯示清晰，表明提取的總RNA質(zhì)量好，完整性好，降解較少。

1～7.根、葉、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱。

2.2 萼脊蘭PI基因的克隆

萼脊蘭cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)，大小約為633 bp，這與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)DNAMAN進(jìn)行序列多重分析比對(duì)(圖3)，發(fā)現(xiàn)PI基因編碼的210個(gè)氨基酸序列與小蘭嶼蝴蝶蘭的相似性最高，初步表明PI基因被成功克隆。

1.PI目的基因；M.Marker 2000。

圖3 不同植物PI氨基酸序列多重比對(duì)

2.3 萼脊蘭PI基因序列分析

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)PI的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該基因?qū)儆贛DAS-MEF2-like亞家族，具有完整的MADS-box和K-box保守結(jié)構(gòu)域，屬于MDAS-box基因家族(圖4)；蛋白質(zhì)親疏水性分析表明該基因所表達(dá)蛋白屬于親水性蛋白，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由56.19%的α螺旋、13.81%的延伸鏈、30%的不規(guī)則折疊組成(圖5)。

2.4 萼脊蘭PI基因表達(dá)分析

萼脊蘭PI基因表達(dá)分析結(jié)果表明，PI基因在盛花期不同部位雖都有表達(dá)，但表達(dá)豐度不一致，盛花期營(yíng)養(yǎng)器官幾乎不表達(dá)，生殖器官中表達(dá)量很高，說明PI基因的表達(dá)具有組織特異性，主要在花器官中表達(dá)。在盛花期，營(yíng)養(yǎng)器官中根和葉表達(dá)最低，幾乎為零；在生殖器官中，萼片的表達(dá)量最高，其次是花瓣，唇瓣和蕊柱次之，花梗的表達(dá)量較低，并且在萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱中PI基因的表達(dá)量整體呈逐漸下降趨勢(shì)(圖6)。

圖4 PI蛋白保守結(jié)構(gòu)域

c.無規(guī)則卷曲；h.α螺旋；e.延伸鏈。

圖6 萼脊蘭PI基因的表達(dá)分析

2.5PI基因表達(dá)載體的構(gòu)建

應(yīng)用SacⅠ和XbaⅠ對(duì)PI-ORF-T質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，能夠切出633 bp的目的基因(圖7)。應(yīng)用EcoRⅠ和Hind Ⅲ對(duì)中間載體pBI221-PI進(jìn)行酶切，能夠切出符合預(yù)期的1.8 kb左右的片段(圖8)，說明中間載體pBI221-PI構(gòu)建成功。應(yīng)用SacⅠ和XbaⅠ對(duì)植物表達(dá)載體1301-PI進(jìn)行酶切，切出約633 bp的目的基因片段(圖9)，表明植物表達(dá)載體1301-PI構(gòu)建成功。

M.Marker 15000;1.質(zhì)粒；2.雙酶切。圖8-9同。

圖8 pBI221-PI質(zhì)粒及雙酶切(EcoRⅠ、Hind Ⅲ)

圖9 1301-PI質(zhì)粒及雙酶切(SacⅠ、XbaⅠ)

3 結(jié)論與討論

近年來有關(guān)開花調(diào)控基因的研究成為熱點(diǎn)，而PI基因作為控制花發(fā)育的B類基因，其研究卻剛剛起步[20]。本研究根據(jù)NCBI網(wǎng)站上報(bào)道的PI基因全長(zhǎng)序列來設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆了633 bp的PI基因ORF區(qū)域，利用qRT-PCR對(duì)PI基因的表達(dá)進(jìn)行研究分析，并且構(gòu)建了1301-PI表達(dá)載體。通過對(duì)PI基因的功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有完整的高度保守的MADS-box區(qū)和K-box區(qū)，這說明PI基因?qū)儆贛ADS基因家族。通過對(duì)PI基因所表達(dá)的蛋白進(jìn)行親疏水性分析，表明其所表達(dá)的氨基酸為親水性蛋白。

PI基因作為MADS-box基因家族的成員，不僅參與花器官的形成，還參與根的形成、花的起始、胚的發(fā)育及種子和果實(shí)的形成等過程[21]，且在植物生長(zhǎng)的不同時(shí)期中發(fā)揮不同的作用，本研究的結(jié)果顯示，在萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱中的表達(dá)量最高，在根和葉中表達(dá)量很低，說明PI基因主要參與花器官的形成。

在構(gòu)建載體的過程中，最重要的步驟就是酶切與連接體系的設(shè)計(jì)與操作。酶切位點(diǎn)和所采用的酶需要經(jīng)過認(rèn)真合理的篩選，必須注意兩酶切位點(diǎn)的間距要合適，否則會(huì)影響酶對(duì)位點(diǎn)的識(shí)別而影響酶切效率[22]。連接的過程中應(yīng)注意目的基因與載體之間的濃度比例，底物濃度應(yīng)控制在載體濃度的3～10倍，底物濃度過高或過低都會(huì)影響連接的效率。另外，無論酶切還是連接，都應(yīng)注意控制好反應(yīng)的溫度和時(shí)間。

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Cloning and Construction of Expression Vector ofMADS-boxGene fromSedireajaponica

JIANG Suhua1，HUANG Ping2， WANG Mofei1，LIANG Fang1，XU Shenping1，CUI Bo1

(1.Institute of Biotechnology，Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，China；2.Henan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou 451450，China)

In order to study the B typePIgene of "ABC" model， and explore the gene characteristics of petals and stamen formation.In the study，using CTAB approach to extract the total RNA of the petal ofSedireajaponica，and cloning the part-length cDNA sequences ofPIgene ofSedireajaponicaby using RT-PCR approach.It found that the length of this gene sequence was 633 bp，it encoded 210 putative amino acid residues and the gene sequence had a high homology withPhalaenopsisequestrisafter sequence alignment.After analysis of the structure and the hydrophilic and the secondary structure of PI protein，it found that the gene sequence contained the MADS-box domain and K-box，it belonged to theMADS-boxsuper family，PI was hydrophilic protein，and it contained 56.19% Alpha helix，13.81% extended strand and 30% random coil.The expression was analysed by Real-time fluorescent quantitative PCR，PIgenes mainly expressed in floral organ，and high expression andPIgene expression had tissue specificity.During the construction of expression vector，it leads the sequence containing objective gene and promoter to the pCAMBIA1301 expression vector，it showed that the construction of expression vector 1301-PIwas succeed，which laied the fundation for getting new varieties ofSedireajaponica.

Sedireajaponica；PIgene； Cloning； Expression analysis； Expression vector

2017-04-12

鄭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150448)；鄭州市重大科技專項(xiàng)(141PZDZX038)；河南省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(14B180036)

蔣素華(1983-)，女，河南漯河人，講師，碩士，主要從事花卉分子生物學(xué)研究。

崔 波(1962-)，男，河南泌陽人，教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

Q949.71+8.43；Q78

A

1000-7091(2017)03-0065-05

10.7668/hbnxb.2017.03.010