豬DDX21基因的克隆、序列分析及原核表達

謝立蘭，安 康，陳 力，孫紫德，方六榮

( 1.武漢生物工程學院 應用生物技術研究中心，湖北 武漢 430415；2.湖北省病毒載體工程技術研究中心，湖北 武漢 430415；3.河北北方學院 醫(yī)學檢驗學院，河北 張家口 075000；4.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

豬DDX21基因的克隆、序列分析及原核表達

謝立蘭1，2，安 康3，陳 力1，2，孫紫德1，2，方六榮4

( 1.武漢生物工程學院 應用生物技術研究中心，湖北 武漢 430415；2.湖北省病毒載體工程技術研究中心，湖北 武漢 430415；3.河北北方學院 醫(yī)學檢驗學院，河北 張家口 075000；4.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

DEAD-box解旋酶21(DExD-box helicase 21， DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成員之一，不僅參與RNA的合成和加工過程，同時還參與機體的天然免疫應答，調控病毒的復制。為了研究豬DDX21基因的結構和功能，以豬腎傳代細胞(PK-15)總cDNA為模板，根據GenBank 公布的預測序列(XM_005657387.2)設計引物擴增豬源DDX21基因，并采用分子生物學軟件將其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析。結果顯示，首次成功克隆了豬DDX21基因的cDNA序列(GenBank登錄號為KX396051)，其開放讀碼框全長為2 355 bp，編碼784個氨基酸；與牛、斑馬魚、人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的氨基酸序列同源性分別為91.7%，57.5%，88.0%，82.3%，83.8%和48.9%；該基因編碼的蛋白結構域和人、牛、小鼠、大鼠一樣，其C端都具有保守的GUCT結構域；系統(tǒng)進化樹分析表明豬DDX21與牛DDX21的親緣關系最近。進一步構建原核表達質粒pET28a-DDX21，經測序鑒定正確后，將其轉化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，對DDX21基因進行原核表達。經 SDS-PAGE 分析顯示重組菌可表達分子量約為 90 kDa的融合蛋白，與預期相符；在IPTG誘導濃度一定的條件下，重組菌的最佳誘導時間為5 h。豬DDX21基因的克隆和原核表達，為進一步研究DDX21蛋白的結構和生物學功能奠定了基礎。

豬；DDX21基因；克?。恍蛄蟹治?；原核表達

DEAD-box(DEAD-box proteins/DEAD-box helicases)家族蛋白是一類兼具有ATP酶活性和RNA解旋酶活性的RNA解旋酶，屬于細胞RNA解旋酶超家族2型(SF2)。該家族蛋白廣泛存在于從細菌到哺乳動物的許多物種中，通常含有9個保守的氨基酸基序，分別為基序Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 和Q，并因其基序Ⅱ中的保守氨基酸序列Asp-Glu-Ala-Asp(D-E-A-D)被命名為DEAD-box蛋白[1-2]。DEAD-box蛋白家族成員眾多，在各種涉及RNA的細胞進程中均發(fā)揮重要作用，包括轉錄、mRNA前體剪接、mRNA輸出、核糖體生成、翻譯起始、細胞器基因表達、RNA降解等[3-4]。

1993年，F(xiàn)lores-Rozas等[5]最先在Hela細胞的細胞核提取物中鑒定了一種新的具有打開雙鏈RNA分子和改變ssRNA形成等雙重功能的RNA解旋酶-RNA helicase Ⅱ。隨后Valdez 等[6]利用自身抗體從西瓜胃(Watermelon stomach)病人的血清中分離到一種核仁RNA 解旋酶，命名為Gu蛋白。經鑒定，RNA helicase Ⅱ蛋白和Gu蛋白實為同一種蛋白，屬于DEAD-box蛋白家族成員，并將其命名為DDX21 (DEAD-box helicase 21)或RH Ⅱ/Ga(RNA helicase Ⅱ/Gua)[7]。后來的多項研究表明DDX21不僅參與RNA的生成和加工過程[8-9]，在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及機體的炎癥反應和信號傳遞中DDX21也起到非常重要的作用[10-11]，同時DDX21也參與了多種病毒(包括InfluenzaAvirusV(IAV)[12-13]、Humanimmunodeficiencyvirus1(HIV)[14]和Denguevirus(DENV)[15]等)的增殖過程。

迄今為止，僅人、小鼠和非洲爪蟾的DDX21基因被鑒定，尚未有關于豬源DDX21基因的研究報道。本研究利用RT-PCR技術克隆了豬DDX21的全長CDs區(qū)序列，利用生物信息學軟件分析了該基因的保守結構域及其與其他物種DDX1基因的同源性。同時，構建了豬DDX21的原核表達質粒，并在宿主菌BL21中成功進行了誘導表達，為今后深入研究豬DDX21蛋白的結構和功能奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、載體和細胞系

大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株和BL21(DE3)菌株、原核表達載體pET-28a(+)、豬腎傳代細胞系(PK-15)均由武漢生物工程學院應用生物技術研究中心保存。克隆載體pMD18-T購自大連寶生物(TaKaRa)公司。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒、DNA Marker、TaqDNA聚合酶、T4-DNA連接酶及各種限制性內切酶等均購自大連寶生物( TaKaRa)公司。SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、考馬斯亮藍R250和雙色蛋白預染Marker購自上海生工生物工程公司。

1.3 引物設計及合成

根據GenBank預測的豬DDX21基因序列(XM_005657387.2)，利用Pinmer Premier 5.0 軟件設計引物用于克隆DDX21，包括上游引物DDX21-2F(GAATTCATGCCGGGGAAACTTCGTAGT，下劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點) 和下游引物DDX21-2R(CTCGAGTTACTGTCCAAACGCTTTGC，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。引物由生工生物(上海) 股份有限公司合成。

1.4 豬DDX21基因的克隆

利用RNAiso Plus 法提取豬腎傳代細胞(PK-15)總RNA，參照反轉錄試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0)說明書，以DDX21-2F和DDX21-2R為引物，利用RT-PCR方法擴增豬DDX21基因編碼區(qū)(CDs)序列。PCR反應體系：5×PCR Buffer 10 μL，Taq聚合酶1 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板10 μL，用ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 °C預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 °C退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35個循環(huán)；72 °C延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物純化后克隆至pMD18-T 載體，命名為pMD18-DDX21，雙脫氧末端終止法進行測序。

1.5 豬DDX21基因序列分析、同源性比對及構建進化樹

利用DNAStar軟件的EditSeq程序將上述所獲得的豬DDX21基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；利用網站http://web.expasy.org/protparam/ 分析DDX21蛋白的理化性質；應用DNAStar的MegAligen工作區(qū)和ClustalX軟件對不同物種DDX21蛋白的氨基酸序列及RH Ⅱ/ Gu蛋白C端結構域 (The C-terminal domain in the RNA helicase Ⅱ / Gu protein family，GUCT)進行同源性分析和比對，并進一步利用 MEGA 7.0軟件構建NJ(Neighbour-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹；SMART服務器(http：//smart.embl-heidelberg.de)對豬DDX21蛋白質功能進行分析。

1.6 原核表達載體pET28a-DDX21的構建

用限制性內切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ對pMD18T-DDX21 質粒和pET-28a(+)空載體進行雙酶切，分別回收純化DDX21基因片段和線性化的pET-28a(+)片段并將其連接。將連接產物轉化到E.coliDH5α中，挑取單克隆菌落并提取質粒，用SphⅠ進行單酶切鑒定后，將疑似正確的質粒送到上海生工生物有限公司測序。

1.7 pET28a-DDX21的誘導表達

將測序正確的重組質粒(命名為pET28a-DDX21)轉入到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，挑取單菌落至含50 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。取上述菌液200 μL至新配制的5 mL含50 mg/mL卡那霉素抗生素的LB中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～1.0時，取1 mL菌液作為誘導前樣品，剩余菌液加入一定濃度的IPTG后37 ℃誘導一定時間。誘導后取1 mL菌液離心，沉淀用40 μL PBS和10 μL 5×SDS上樣緩沖液充分混勻，100 ℃水浴5 min，進行SDS-PAGE 電泳檢測，考馬斯亮藍染色。

2 結果與分析

2.1 豬DDX21基因的克隆

利用TaKaRa公司的細胞總RNA提取試劑-RNAiso plus 從豬腎傳代細胞系(PK-15)中提取細胞總RNA，通過RT-PCR(兩步法) 擴增豬DDX21基因的全長cDNA。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有一條約2 500 bp的條帶(圖1-A)，與預期相符。進一步將上述PCR產物進行膠回收，與pMD18-T 載體連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進行雙酶切鑒定，酶切后所得片段大小均與預期結果一致(圖1-B)。挑取陽性克隆(命名為pMD18-DDX21)菌液送生工(上海)生物工程有限公司進行測序。對測序結果進行序列比對得到豬DDX21基因的全長編碼區(qū)由2 355個核苷酸組成(GenBank登錄號為KX396051)。

M1和M2．DL1.5 kb和DL2000 DNA Marker；1．豬DDX21擴增產物；2，3．pMD18-DDX21/EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ。

2.2 豬DDX21基因的氨基酸序列分析及同源進化樹構建

根據DNAStar軟件推導出豬DDX21基因編碼784個氨基酸，Protparam分析表明其蛋白分子量為87.22，等電點(pI)為9.35，蛋白質穩(wěn)定性為44.26，為不穩(wěn)定蛋白。進一步運用DNAStar的MegAligen 工作區(qū)將其與已知物種DDX21的氨基酸序列進行同源性分析。結果顯示，豬DDX21 與牛(NP_001076996.1)、斑馬魚(NP_001120807.2)、人(NP_004719.2)、小鼠(NP_062426.2)、大鼠(NP_001032278.1)和非洲爪蟾(NP_001039224.1)的氨基酸同源性分別為91.7%，57.5%，88.0%，82.3%，83.8%和48.9% (圖2-A)，顯示哺乳動物DDX21的氨基酸序列具有較高的同源性。根據不同動物DDX21的氨基酸序列繪制遺傳進化樹，結果顯示豬DDX21與牛DDX21 的親緣關系最近(圖2-B)。

進一步利用SMART軟件對豬DDX21的氨基酸序列進行結構域預測，結果發(fā)現(xiàn)，與其他物種類似，豬DDX21也含有3個保守結構域，分別為位于206-413aa的DEXDc結構域、位于449-533aa的RNA解旋酶(HELICc)結構域和位于621-716aa的RH Ⅱ/ Gu蛋白C端結構域(http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/job-status.pl?jobid=611832

146647831474358807OmTGQHIGxM)，圖3-A)，且Blast序列比對發(fā)現(xiàn)DDX21的GUCT結構域在哺乳動物中高度保守，進一步證明所克隆的序列為豬的DDX21序列(圖3-B)。

圖2 不同物種DDX21的氨基酸序列比較(A)和遺傳進化樹(B)

圖3 DDX21基因的保守結構域(A)和GUCT區(qū)的氨基酸序列比對(B)

2.3 豬DDX21基因原核表達載體的構建及鑒定

根據1.6方法所述構建原核表達質粒pET28a-DDX21。將重組質粒用SphⅠ單酶切鑒定后，產生一條約1 300 bp和一條約6 400 bp的線性條帶，與預期結果一致(圖4)。在此基礎上，進一步對pET28a-DDX21進行測序，也證實無堿基錯配，證明原核表達質粒構建成功。

2.4DDX21基因重組蛋白的誘導表達

重組質粒pET28a-DDX21轉化BL21感受態(tài)細胞，經終濃度為1.0 mmol/L的IPTG在37 ℃分別誘導2，3，4，5 h后進行SDS-PAGE 電泳檢測。結果顯示重組質粒成功表達出約90 kDa大小的蛋白，并且隨著誘導時間的延長，融合蛋白的表達量也逐漸增加。而未誘導的空載體質粒轉化菌和未誘導的 pET28a-DDX21重組質粒均沒有出現(xiàn)相同的條帶(圖5)。進一步通過加入不同終濃度的IPTG誘導培養(yǎng)5 h，以篩選最優(yōu)的IPTG濃度。結果如圖6所示，在0.6～1.2 mmol/L的IPTG濃度時，目的蛋白都能表達，但表達量無明顯變化。參考《pET System Manual》中提到的“帶有T7lac啟動子的載體則需要終濃度為1 mmol/L 的IPTG 才能完全誘導。”，而IPTG對細菌也存在一定的毒性，為此進一步選擇終濃度為1.0 mmol/L的IPTG在菌液不同吸光值時(分別在菌液OD600為0.4，0.6，0.8或1.0時添加IPTG)對細菌進行誘導，37 ℃培養(yǎng)5 h后運用SDS-PAGE檢測蛋白的表達，以探索重組蛋白表達的最佳誘導時機。電泳結果表明(圖7)，在同樣的誘導時間和誘導劑濃度時，初始OD600分別為0.6和0.8時的菌液誘導后表達的重組蛋白基本相當，明顯高于OD600為0.4或1.0試驗組。

M1和M2．DL1.5 kb和DL2000 DNA Marker；1．pET28a-DDX21/ Sph Ⅰ單酶切鑒定。

M．蛋白Marker；1．誘導的空載體；2～5．pET28a-DDX21分別誘導2，3，4，5 h；6．未誘導的pET28a-DDX21。

M. Protein molecular weight Marker； 1. Induced the pET28a； 2-5. Induced pET28a-DDX21 for 2， 3， 4， 5 h， respectively； 6. pET28a-DDX21 before inducement.

圖5 誘導pET28a-DDX21不同時間后蛋白的表達

Fig.5 SDS-PAGE analysis of pET28a-DDX21 expression product after different induction time

M．蛋白Marker；1．誘導的空載體；2．未誘導的pET28a-DDX21；3～6．分別以0.6 ，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG 誘導pET28a-DDX1。

M. Protein molecular weight Marker； 1. Induced the pET28a； 2. pET28a-DDX21 before inducement； 3-6.Induced pET28a-DDX21 with 0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG， respectively.

圖6 不同濃度IPTG誘導pET28a-DDX21的表達

Fig.6 SDS-PAGE analysis of pET28a-DDX21 expression with different concentrations of IPTG

M．蛋白Marker；1．誘導的空載體；2～5．菌液吸光值分別為0.4，0.6，0.8，1.0時誘導蛋白的表達；6．未誘導重組質粒。

M. Protein molecular weight Marker； 1. Induced the pET28a； 2-5.Induced pET28a-DDX21 at different OD value 0.4， 0.6， 0.8，and 1.0 respectively； 6. pET28a-DDX21 before inducement.

圖7 不同吸光值時誘導pET28a-DDX21的表達

Fig.7 SDS-PAGE analysis of pET28a-DDX21 expression at different OD value

3 討論和結論

DEAD-box解旋酶是一個包含了與RNA代謝(轉錄起始、RNA剪切、核運輸、前mRNA拼接)等許多過程的蛋白質家族[1]。DDX21作為DEAD-box解旋酶家族的一員，已有多項研究表明其在核糖體RNA的生成、RNA編輯和轉錄等過程中起到非常重要的作用[8-9]，這些可能是由DDX21特殊的核仁定位決定的。此外，近期研究還表明DDX21參與了機體的天然免疫和病毒復制等諸多生物學過程。Zhang等[10]在分離鑒定能夠特異性結合poly(I∶C)的蛋白質時，發(fā)現(xiàn)DDX21和解旋酶DDX1及DHX36形成一個復合體，且DDX21通過其PRK結構域分別結合DDX1的SPRY結構域和DHX36的C-HA2-DUF解旋結構域，在poly(I∶C)的識別和信號傳遞過程中起橋梁作用；在IAV感染早期，DDX21通過結合IAV的PB1蛋白和抑制聚合酶的組裝，從而抑制IAV病毒RNA和蛋白質的合成，而在病毒感染后期，病毒的非結構蛋白NS1競爭性的與DDX21，從而釋放出PB1蛋白并解除DDX21對其病毒的抑制作用[12]。類似的，DDX21還能抑制HIV、登革熱病毒和博爾納病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)等病毒的復制，但其具體機制尚不清楚[14-16]。

目前，有關DDX21的功能研究主要是以人[3]、鼠[17]和非洲爪蟾[18]為模型，其他物種卻鮮有功能報道。本研究通過RT-PCR方法擴增得到豬DDX21基因的CDs序列。該基因的CDs序列為2 355 bp，編碼784個氨基酸，預測其蛋白分子量為87.22 kDa，等電點(pI)為9.35，蛋白質穩(wěn)定性為44.26(大于40被認為不穩(wěn)定)。經氨基酸序列比對和進化樹分析，豬DDX21基因與其他哺乳動物如牛、大鼠、人和小鼠的氨基酸序列之間的同源性較高，分別為91.7%，83.8%，88.0%和82.3%，且進一步的結構預測表明豬DDX21與其他哺乳動物的DDX21一樣，也存在DEXDc、HELICc和GUCT這3個保守結構域，其中GUCT為DDX21蛋白所特有的結構域[19]。不同物種DDX21基因結構域的高度保守性及豬DDX21與人DDX21之間較高的同源性，提示豬DDX21可能與人DDX21具有更相似的作用和功能。

本研究以pET28a(+)為原核表達載體構建了重組質粒pET28a-DDX21，并在大腸桿菌中成功表達了豬DDX21蛋白。進一步的分析表明pET28a-DDX21融合蛋白在IPTG終濃度為0.6～1.2 mmol/L時表達量變化不明顯。在IPTG終濃度為1 mmol/L，相同的初始OD值下誘導2～5 h都能表達，以誘導5 h后的表達量最高。在IPTG終濃度一定的條件下，初始OD值不同的菌液在誘導時間相同后蛋白表達差別較大，以初始OD為0.6和0.8時誘導的表達量較理想，初始OD值過低(0.4)或過高(1.0)時蛋白表達量都不高。pET28a(+)融合的his標簽分子量小，不會改變目的蛋白自身的可溶性，在pH=8.0時，不攜帶電荷，對蛋白的折疊、構象形成等影響較小，容易分離純化[20]。因此，pET28a-DDX21重組質粒的構建及DDX21表達條件的優(yōu)化可為重組蛋白的生產制備及進一步研究豬DDX21的結構提供基礎資料。

綜上所述，本研究首次克隆了豬DDX21基因，通過生物信息學分析再次證明DDX21基因在不同物種中的高度保守性，并利用原核表達技術成功誘導表達豬DDX21蛋白，今后擬對豬DDX21蛋白的結構及豬DDX21基因在豬源病毒復制中的作用和參與機體天然免疫的機制進行進一步研究。

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Cloning，Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of PorcineDDX21

XIE Lilan1，2，AN Kang3，CHEN Li1，2，SUN Zide1，2，F(xiàn)ANG Liurong4

( 1.Center of Applied Biotechnology，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China；2.Hubei Engineering Research Center of Viral Vector，Wuhan 430415，China；3.College of Lab Medicine，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China；4.State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

DDX21 (DExD-box helicase 21) is a RNA helicase，which belongs to the DEAD-box family of RNA helicases.Previous reports showed DDX21 not only take part in the generation and processing of RNA，but also have functional roles in virus′s replication.This experiment was conducted to obtain sequence of swine DEAD-box helicase 21 gene，and to study its prokaryotic expression.According to the predictedSusscrofaDDX21 gene mRNA sequence in GenBank(XM_005657387.2)，proper primers were designed.Total RNA was then extracted from porcine kidney passage cells(PK-15)，and CDs sequence of the gene was amplified by RT-PCR using the primers.The sequence analysis results showed that the sequence of porcine DDX21 CDs was in length of 2 355 bp which encoded 784 amino acids (GenBank Accession No.KX396051)； Compared withBostaurus，Daniorerio，Homosapiens，Musmusculus，RattusnorgicusandXenopustropicalis，homology of porcine DDX21 was 91.7%，57.5%，88.0%，82.3%，83.8%，and 48.9% at the amino acid level，respectively； Structural analysis with the SMART program indicated that porcine DDX21 contained a putative C-terminal GUCT domain.Similar GUCT domain domains had been identified in cattle，human，mouse and rat DDX21； Phylogenetic tree analysis showed that porcine DDX21 had the closest relationship with cattle DDX21.Additionally，prokaryotic expression vector pET28a-DDX21 was constructed for further study.After sequencing，the recombinant was transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) competent cells.The SDS-PAGE experiment demonstrated that the recombinant objective protein appeared a molecular mass of approximately 90 kDa which was consistent with the anticipated size.When IPTG concentration was kept constant，5 h induction was optimal.Cloning of porcineDDX21 gene and expression inE.colilaid a foundation for the subsequent structural analysis and function research of this gene.

Porcine；DDX21 gene； Cloning； Sequence analysis； Prokaryotic expression

2017-04-22

國家自然科學基金項目(31402181)；湖北省教育廳科學技術研究項目(B2016303)

謝立蘭(1984-)，女，江西九江人，講師，博士，主要從事動物病毒分子生物學與免疫學研究。

方六榮(1969-)，女，湖北咸寧人，教授，博士，主要從事動物病毒分子生物學與免疫學研究。

Q78；S828

A

1000-7091(2017)03-0042-06

10.7668/hbnxb.2017.03.007