大葉落地生根細(xì)胞周期蛋白依賴激酶KdCDK基因克隆及表達(dá)分析

朱敏群，梁小紅，黃慧青，歐素榮，葛永強(qiáng)，張利娟，鐘天秀

(1.深圳市日昇園林綠化有限公司，廣東 深圳 518040；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 草坪研究所，北京 100083；3.暨南大學(xué) 深圳旅游學(xué)院，廣東 深圳 518053；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

大葉落地生根細(xì)胞周期蛋白依賴激酶KdCDK基因克隆及表達(dá)分析

朱敏群1，梁小紅2，黃慧青1，歐素榮1，葛永強(qiáng)1，張利娟3，鐘天秀4

(1.深圳市日昇園林綠化有限公司，廣東 深圳 518040；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 草坪研究所，北京 100083；3.暨南大學(xué) 深圳旅游學(xué)院，廣東 深圳 518053；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

為了更好理解大葉落地生根中細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制，利用RACE-PCR技術(shù)從大葉落地生根中克隆了1個(gè)新的基因KdCDK。該基因編碼295個(gè)氨基酸殘基，分子量為34.12 kDa，等電點(diǎn)為6.15，其開放閱讀框長度為888 bp。其蛋白與筍瓜CDK蛋白的同源性最高，屬于CDKA類蛋白家族。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該蛋白基因在大葉落地生根的根中表達(dá)量最高，且受滲透脅迫(甘露醇)的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。從大葉落地生根中克隆出KdCDK基因，為將來該基因的功能研究打下了基礎(chǔ)。

大葉落地生根；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶；基因表達(dá)

細(xì)胞周期是受到嚴(yán)格調(diào)控的過程，通過一系列不連續(xù)的關(guān)鍵點(diǎn)來確保DNA正確復(fù)制和細(xì)胞的成功分裂。真核生物中的細(xì)胞周期由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族調(diào)控，最常見的就是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)[1-3]。CDKs活性調(diào)節(jié)主要有以下3種方式：磷酸化和去磷酸化、結(jié)合相互作用蛋白如細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(ICK)或細(xì)胞周期蛋白依賴激酶活化蛋白(CAK)、結(jié)合細(xì)胞周期蛋白[4-5]。到目前為止，從41種植物中克隆出152個(gè)CDK基因，根據(jù)與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合位點(diǎn)基序的差異把它們分為8個(gè)亞家族，包括CDKA～G和CDKL(類細(xì)胞周期蛋白依賴激酶)[6-7]。CDKA類蛋白家族含有PSTAIRE特征的序列，CDKB類蛋白家族含有PPTALRE或PPTTLRE特征序列，CDKC類蛋白家族含有具有PITAIRE特征序列，CDKD、CDKE和CDKF類蛋白家族調(diào)控CDK活化子，含有SPTAIRE特征序列，CDKG類蛋白家族含有PLTSLRE特征序列，CDKL類蛋白家族含有(V、I、L、K、R)FMAREI特征序列，根據(jù)基序中氨基酸殘基的變化將CDKL分為CDKL1～CDKL15[6]。

第一個(gè)CDK激酶是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，酵母中cdc2/cdc28突變體的表型能夠完全被CDKA修復(fù)，說明單一的CDK基因就能完全調(diào)控酵母的細(xì)胞周期[8]。到現(xiàn)在為止，已有大量的研究表明CDKA在受精胚發(fā)育早期和體細(xì)胞胚發(fā)育過程中起到了至關(guān)重要的作用[9-10]。過表達(dá)CDKA∶1的植株沒有出現(xiàn)表型上的改變，但是該基因的顯性失活突變體抑制轉(zhuǎn)基因煙草中細(xì)胞周期過程，使細(xì)胞分裂速度下降，細(xì)胞變大，植株矮小[11]。在擬南芥中，cdc2At基因的顯性突變體(與CDKA∶1是同源基因)中細(xì)胞周期蛋白依賴激酶失活，細(xì)胞周期活動受到抑制，植株無法存活[11]；而該基因的顯性失活突變體影響胚胎形成過程，C13株系不能形成種子，其他株系C1、C5、C12中胚胎上下軸模式(Apical-basal embryo pattern)出現(xiàn)畸形[11]。Nowack等[12]的研究都表明CDKA∶1基因完全被敲掉之后會導(dǎo)致胚胎死亡，花粉粒中出現(xiàn)雙細(xì)胞或者三細(xì)胞的精細(xì)胞。最近一項(xiàng)研究表明，CDKA∶1基因不僅在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂間期中的S期中有非常重要的作用，而且具有促進(jìn)根中的細(xì)胞增殖使根發(fā)育完整并維持根中分生組織的功能[12]。

大葉落地生根胎生苗的發(fā)育過程兼具胚胎發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑，是研究植物發(fā)生發(fā)育的理想模型[13]。為揭示大葉落地生根胎生苗發(fā)育機(jī)制，采用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了大葉落地生根胎生苗和普通葉片的SSH-cDNA文庫[14]，并從該差減文庫中篩選出一條與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶基因片段同源的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。本研究以該EST片段為基礎(chǔ)，采用RACE-PCR技術(shù)克隆出大葉落地生根細(xì)胞周期蛋白依賴激酶的cDNA基因全長(命名為KdCDK)，利用生物信息學(xué)方法分析KdCDK基因的序列、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育，并研究該基因在大葉落地生根不同組織和滲透脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)變化，為該基因的進(jìn)一步研究利用打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料的培養(yǎng)

大葉落地生根(Kalanchoedaigremontiana)種植于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所溫室，培養(yǎng)基質(zhì)為腐葉土、蛭石和珍珠巖(按4∶2∶1混合)，在16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為25 μmol/(m2·s)，溫度為(30±3)℃下培養(yǎng)。采集葉片后快速在液氮中固定，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄

使用TaKaRa MiniBEST universal RNA Extraction Kit(Code No.9769)提取落地生根葉片的總RNA，并在-80 ℃下保存。

1.3KdCDK基因的克隆和測序

根據(jù)差減文庫的測序結(jié)果，分別設(shè)計(jì)上游引物F1和下游引物R1(表1)。以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMⅡ High Fidelity RT-PCR Kit(TaKaRa Code No.RO23A)的操作說明合成第一鏈cDNA，使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括1 μL cDNA模板，1 μL Tks Gflex DNA Polymerase(1.25 U/μL)，1 μLF1引物(20 μmol/L)，1 μLR1引物(20 μmol/L)，25 μL 2×Gflex Buffer(Mg2+，dNTP plus)，21 μL ddH2O 。反應(yīng)程序?yàn)椋?98 ℃變性 10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。以上述PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行2次PCR，反應(yīng)體系及條件同上。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)回收，用F1/R1為特異引物對回收后的DNA測序。

根據(jù)獲得的CDK基因cDNA片段序列設(shè)計(jì)5′RACE Outer PCR特異引物R01和Inner PCRR02(表1)。使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech Cat.No.634923)對反轉(zhuǎn)錄總RNA合成cDNA。使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Outer PCR反應(yīng)完成后，立即取反應(yīng)液1 μL進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)回收。接著用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1(Code No.6022)中的連接酶，將PCR產(chǎn)物與T-Vector pMDTM18(Code No.3271)進(jìn)行連接，熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，用M13-47引物對進(jìn)行測序。由于第1次5′RACE 結(jié)果不理想，重新設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行再次5′RACE。5′RACE Outer PCR特異引物R06和Inner PCRR07見表1。具體操作同第1次5′RACE過程。

根據(jù)獲得的CDK基因cDNA片段序列設(shè)計(jì)3′RACE Outer PCR特異引物F01和Inner PCR特異引物F02(表1)。以1 μL的RNA為模板，使用3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase(Code No.6106)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進(jìn)行PCR反應(yīng)。2輪PCR反應(yīng)完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)切膠回收和連接克隆，用M13-47引物對質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。具體步驟同5′RACE。

對CDK基因cDNA片段的5′端和3′序列進(jìn)行拼接，獲得KdCDK基因的全長序列。并分別設(shè)計(jì)上游引物YZF1和YZF2及下游引物YZR1(表1)，以驗(yàn)證試驗(yàn)中使用的cDNA為模板，進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)。第1輪PCR反應(yīng)使用引物YZF1和YZR1。第2輪PCR反應(yīng)使用YZF2和YZR1。使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。用YZR1進(jìn)行測序分析。

1.4KdCDK基因的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫中ORF Finder軟件尋找KdCDK序列中的ORF，推導(dǎo)編碼的氨基酸序列。應(yīng)用Expasy的ScanProstie、ProtParam、TMpred、Protscale程序分析KdCDK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、分子量和等電點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和親疏水性[15]。用Blast程序檢索相似蛋白，利用ClustalX 2.1 軟件對不同物種的氨基酸序列進(jìn)行多重比對[16]；利用MEGA 6.0進(jìn)行氨基酸序列分析，用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，并用Bootstrap校正[17]；根據(jù)NPS@ web server網(wǎng)站中的PHD方法預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)[18]。應(yīng)用在線分析工具Phyre分析CDK蛋白三級結(jié)構(gòu)[19]。

1.5KdCDK表達(dá)的熒光定量分析

以大葉落地生根actin作為內(nèi)參基因(上下游引物見表1)，根據(jù)KdCDK的序列信息設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)熒光定量的上游引物F2和下游引物R2(表1)。以大葉落地生根中的根、莖、葉、葉柄為總RNA材料分析KdCDK基因在不同組織中的表達(dá)情況。對大葉落地生根幼苗進(jìn)行滲透脅迫處理(300 mmol/L甘露醇)，分別在處理的0，3，6，9，12，24 h采集葉位相同葉片，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，3個(gè)重復(fù)混合取樣，提取總RNA分析KdCDK基因在滲透脅迫下的表達(dá)情況。按照Ist Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒的操作說明合成cDNA，根據(jù)SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熒光定量反應(yīng)體系為：SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA 1 μL，ROX校正染料 0.2 μL，dH2O 3.4 μL，共10 μL。反應(yīng)在ABI7900HT實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s。采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果。

表1 KdCDK基因克隆和鑒定中所用的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1KdCDKcDNA克隆與測序

以大葉落地生根葉片第一鏈cDNA為模板，并用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約150 bp的目的片段(圖1-A)。根據(jù)獲得的SAHH基因cDNA片段序列分別設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE特異引物，獲得約600，200 bp的目的片段(圖1-B、C)。由于測序結(jié)果不理想，再次設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5′RACE試驗(yàn)，獲得約1 000 bp的目標(biāo)片段，電泳檢測結(jié)果如圖1-D。將獲得的cDNA片段的5′端和3′端序列進(jìn)行拼接，以大葉落地生根葉片第一鏈cDNA為模板，設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，獲得約1 200 bp的目的片段(圖1-E)。因此，大葉落地生根CDK基因的cDNA全長為1 437 bp(GenBank登錄號：KU740360)，命名為KdCDK，含有888 bp完整開放閱讀框(ORF)，編碼295個(gè)氨基酸(圖2)，不包括PolyA尾的長度為1 426 bp，5′UTR(非編碼區(qū))361 bp，3′UTR 176 bp。

M.D2000 DNA Marker；A.根據(jù)差減文庫的結(jié)果設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證KdCDK基因；B.3′ RACE 結(jié)果；C.5′ RACE 結(jié)果；D.再次5′RACE結(jié)果；E.RACE結(jié)果驗(yàn)證。

M.D2000 DNA Marker；A.Validation fragments ofKdCDKgene according to the results of subtractive library；B.The result of 3′ RACE；C.The result of 5′ RACE；D.The result of second 5′ RACE；E.The verification of RACE results.

圖 1 大葉落地生根KdCDK同源擴(kuò)增和RACE 克隆以及序列驗(yàn)證

Fig.1 RT-PCR amplification，RACE cloning and sequence verification ofKdCDKgene in

Kalanchoedaigremontiana

下劃線ATG為起始密碼子；方框TGA為終止密碼子；灰色陰影部分為蛋白激酶ATP結(jié)合信號區(qū)域;虛線部分為CDKA類蛋白的特征序列;雙下劃線為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)信號序列。

2.2 KdCDK 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

KdCDK與筍瓜(CBJ18166.1)、陸地棉(ABV64386.1)、毛果楊(XP 002306004.1)、金魚草(CAA66233.1)的相似性分別為68%，67%，66%，65%。通過ScanProsite在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)域信號序列(10-33)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)信號序列(123-135)。含有保守的基序(motif)“PSFALRE”，與CDKA蛋白激酶類似，是細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。通過SIB中的Motif Scan，預(yù)測得到一些不同的基序，包括1個(gè)SANT 保守域(1-12)、2個(gè)蛋白酪氨酸激酶(4-20、49-152)、2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(8-15、280-287)、3個(gè)MYRISTYL N-豆蔻酰化位點(diǎn)(114-119、148-153、191-196)、4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(70-73、93-96、183-186、222-225)、5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(25-27、120-122、141-143、274-276、278-280)。

將大葉落地生根KdCDK與其他25種植物中的CDKA進(jìn)行了氨基酸序列比對，可以看出，不同植物CDK氨基酸序列在幾個(gè)重要功能位點(diǎn)的序列保守性程序很高，如蛋白激酶ATP-結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、T-Loop區(qū)域(圖3)。利用Mega 6.0中的相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，采用默認(rèn)參數(shù)，自檢舉1 000次，對生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行Bootstrap校正。結(jié)果表明，KdCDK與CDKB類蛋白完全分開，與其他植物中的CDKA類蛋白同屬于一類。雙子葉、單子葉、裸子植物中的CDKA類聚為一類，而大葉落地生根的CDK蛋白單獨(dú)聚為一類。

2.3 KdCDK的理化性質(zhì)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

KdCDK蛋白的理論分子量為34.12 kDa，理論等電點(diǎn)為6.15。脂溶指數(shù)為92.51，總平均親水性(GRAVY)為-0.188，不穩(wěn)定系數(shù)為34.51，表明該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，KdCDK含有48.47%的α-螺旋，20.68%的β-折疊和30.85%的隨機(jī)卷曲(圖5，6)，沒有信號肽及其剪切位點(diǎn)，是水溶性的非分泌型蛋白，有1個(gè)明顯的跨膜區(qū)(表2)，被定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 大葉落地生根細(xì)胞周期蛋白依賴激酶與其他植物的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶氨基酸序列比對

圖4 大葉落地生根細(xì)胞周期蛋白依賴激酶與其他植物細(xì)胞周期蛋白依賴激酶氨基酸序列的進(jìn)化分析

數(shù)字代表氨基酸;最長的細(xì)線代表α-螺旋；中等長度的細(xì)線代表β-折疊。

通過Phyre在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)表明，KdCDK具有細(xì)胞周期蛋白依賴激酶典型的三維結(jié)構(gòu)，包括2個(gè)小葉結(jié)構(gòu)，一個(gè)小葉主要由α-螺旋構(gòu)成，另一個(gè)小葉由α-螺旋和β-折疊構(gòu)成。共有11個(gè)α-螺旋和8個(gè)β-折疊(圖6)。

表2 KdCDK 跨膜區(qū)域

螺旋為α-螺旋；箭頭為β-折疊；曲線為無規(guī)則卷曲。

2.4KdCDK的組織表達(dá)分析

利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對KdCDK在大葉落地生根中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示，KdCDK在根中表達(dá)量最高，大約是葉中的1.6倍。根、葉、葉柄、莖中KdCDK的表達(dá)量沒有明顯差異。這些結(jié)果表明，KdCDK在各組織中均有表達(dá)，但不具有組織特異性。

圖7 KdCDK在大葉落地生根中不同組織中的表達(dá)

2.5KdCDK的誘導(dǎo)表達(dá)分析

用300 mmol/L甘露醇對大葉落地生根進(jìn)行滲透脅迫，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析其表達(dá)動態(tài)(圖8)。結(jié)果顯示，KdCDK在甘露醇處理下存在上調(diào)表達(dá)的趨勢。在處理 24 h后，KdCDK的表達(dá)量達(dá)到最大值。

圖8 KdCDK在滲透脅迫下的表達(dá)

3 討論

目前，已經(jīng)從不同的植物中克隆出大量的CDK類基因。本研究從大葉落地生根中克隆出CDK基因序列含有888 bp完整開放閱讀框，編碼的蛋白質(zhì)與筍瓜、陸地苗、毛白楊等植物中的CDKA類蛋白相似性都很高[20]。對CDKA類蛋白進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)該類蛋白5′端相對保守，而在3′端差異比較大，說明A類CDK蛋白家族的氨基酸序列相對保守。而且，進(jìn)化樹比對分析結(jié)果表明大葉落地生根細(xì)胞周期依賴激酶屬于CDKA類蛋白聚在一起，與CDKB類蛋白完全分開，與Zhang等[21]的研究結(jié)果一致。所有這些結(jié)果說明KdCDK是一個(gè)新的CDKA類基因，與之前報(bào)道的植物CDKA類基因在序列信息上有諸多相似之處。

一般情況下，根據(jù)不同的基序推測蛋白的生物學(xué)功能。在KdCDK中，含有“PSFALRE”，與植物中A型CDK類的典型基序“PSTAIRE”十分相似，推測KdCDK屬于CDKA類蛋白，并具有相應(yīng)的功能。KdCDK特征序列中存在2個(gè)氨基酸突變，可能是因?yàn)榇笕~落地生根特殊的繁殖方式。在KdCDK中，也存在其他的保守區(qū)域，如蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)，這些都與維持CDK的功能密切相關(guān)?？偟膩碚f，通過對KdCDK保守區(qū)域的預(yù)測可以推測，它的功能應(yīng)該類似于植物中其他CDKA類蛋白[22-23]。但是，KdCDK蛋白的具體功能還需從生物化學(xué)和基因角度去探究。

通過蛋白三維結(jié)構(gòu)建模分析蛋白結(jié)構(gòu)有利于蛋白的功能分析。目前，CDKs家族蛋白結(jié)構(gòu)建模主要集中在酵母和人上[23-25]。KdCDK蛋白的三維結(jié)構(gòu)是在人類CDK結(jié)構(gòu)(PDB code：d1unla)的基礎(chǔ)上進(jìn)行建模，與其他植物的CDK蛋白結(jié)構(gòu)相似，2個(gè)小葉結(jié)構(gòu)都以α-螺旋和β-折疊為主要構(gòu)件，無規(guī)則卷曲為連接方式，圍繞著一個(gè)中心激活區(qū)域。這說明大部分CDK，特別是CDKA類蛋白進(jìn)化出類似的三維結(jié)構(gòu)[26]。

植物中的CDKA類基因轉(zhuǎn)錄本大部分是在組織分裂細(xì)胞中表達(dá)量較高，比如頂芽、根尖、發(fā)育的葉片和花器官組織[27]。非生物脅迫如機(jī)械損傷能提高葉中CDKA的表達(dá)量[27]。本研究中，KdCDK的表達(dá)量在根中最高，說明組織中KdCDK的表達(dá)量與細(xì)胞分裂和分化的類型有關(guān)[28]。在滲透脅迫下，KdCDK的表達(dá)量逐漸升高，說明KdCDK的表達(dá)量與非生物脅迫有關(guān)[29-32]。

本研究對大葉落地生根細(xì)胞周期蛋白依賴激酶進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，證明該基因在序列結(jié)構(gòu)和功能上與植物CDKA類蛋白類似，在分裂組織(根)中表達(dá)量最高，并且受滲透脅迫的誘導(dǎo)，說明KdCDK可能在大葉落地生根根發(fā)育和抵抗非生物脅迫的過程中起到一定的作用，關(guān)于KdCDK在大葉落地生根中的具體功能還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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cDNA Cloning and Expression Analysis of Cyclin-dependent Kinase (KdCDK)Gene inKalanchoedaigremontiana

ZHU Minqun1，LIANG Xiaohong2，HUANG Huiqing1，OU Surong1，GE Yongqiang1，ZHANG Lijuan3，ZHONG Tianxiu4

(1.Shenzhen Risheng Landscape Company Limited，Shenzhen 518040，China；2.Turfgrass Research Institute，The College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；3.Shenzhen Tourism College of Ji′nan University，Shenzhen 518053，China；4.College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangdong Engineering Research Center of Grassland Science，Guangzhou 510642，China)

To better understand the molecular mechanisms of CDKs involved inKalanchoedaigremontiana，an A-Type CDK gene，KdCDK，was identified using rapid amplification of cDNA end(RACE)PCR.KdCDKgene consists of an ORF of 888 bp that was predicted to encode a 295 amino acid residue-long protein of 34.12 kDa with an isoelectric point of 6.15.KdCDK was related most closely to CmCDK and was clustered to CDKA subfamily.Real-time PCR analysis revealed thatKdCDKtranscript was expressed highly in root and upregulated under osmotic stress.This study characterized the novelKdCDKgene fromKalanchoedaigremontianafor the first time and the results would be useful for further functional determination of the gene.

Kalanchoedaigremontiana；Cyclin-dependent kinase；Gene expression

2017-04-12

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CXZZ20140418110342522)；北京林業(yè)大學(xué)與廈門日懋城建園林建設(shè)股份有限公司產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目

朱敏群(1978-)，女，江西贛州人，工程師，主要從事園林綠化工作。

鐘天秀(1986-)，女，四川內(nèi)江人，講師，博士，主要從事草業(yè)生物技術(shù)研究。

Q78

A

1000-7091(2017)03-0033-09

10.7668/hbnxb.2017.03.006