Notch1基因在妊娠期合并高血壓孕婦胎盤(pán)組織中的表達(dá)及相關(guān)研究

梅麗娜 寧啟鵬 趙 清 吳孝立 杜 英?

Notch1基因在妊娠期合并高血壓孕婦胎盤(pán)組織中的表達(dá)及相關(guān)研究

梅麗娜 寧啟鵬 趙 清 吳孝立 杜 英?

目的 探討Notch1基因在妊娠期高血壓（妊高癥）、重度子癇前期及正常胎盤(pán)組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)的臨床意義。方法 分別采用免疫組化和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)50例妊高癥、30例重度子癇前期及50例正常胎盤(pán)組織中Notch1基因的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化檢測(cè)Nocth1蛋白在妊高癥組、重度子癇組及正常對(duì)照組中的表達(dá)率分別為52.0%、43.4%、76%，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Notch1基因mRNA含量在妊高癥組、重度子癇組及正常對(duì)照組中分別為（4.10±0.57）、（3.07±0.45），（4.88±0.70），組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Notch1基因的低表達(dá)與妊娠期高血壓的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

Notch1 妊娠期高血壓 重度子癇前期 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 免疫組化

妊娠期高血壓疾病是妊娠和血壓升高并存的一組疾病，發(fā)生率為5%～12%。該組疾病嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒病死率升高的主要原因。隨著二胎政策的開(kāi)放，越來(lái)越多的孕產(chǎn)婦面臨著妊娠高血壓帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。研究表明，妊娠期高血壓是由廣泛血管內(nèi)皮損傷，血管內(nèi)活性物質(zhì)失衡引起的嚴(yán)重病理生理改變［3］。而近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號(hào)通路異常表達(dá)可引起組織細(xì)胞發(fā)育異常，可影響血管的生成和“重鑄”，甚至在早期胚胎發(fā)育及胎盤(pán)的血管形成中也占有重要的作用［4-5］。因此妊娠期高血壓的發(fā)生與Notch信號(hào)通路密切相關(guān)。作者通過(guò)免疫組化與RTPCR技術(shù)檢測(cè)Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況，結(jié)合相關(guān)的臨床病理資料，進(jìn)一步探討與妊娠期高血壓發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2012年11月至2014年2月本院妊高癥及重度子癇前期產(chǎn)婦胎盤(pán)組織80例，妊娠期高血壓及重度子癇前期診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期無(wú)妊娠合并癥擇期剖宮產(chǎn)分娩產(chǎn)婦胎盤(pán)組織50例為對(duì)照組，年齡22～41歲，平均28.9歲。孕周26～42周。所有孕婦均無(wú)糖尿病、心臟病、腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能減退、慢性腎病等相關(guān)病史，孕期無(wú)特殊用藥史。

1.2 方法 （1）標(biāo)本采集：所有標(biāo)本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)?；颊咂蕦m產(chǎn)術(shù)中胎盤(pán)娩出后，立即在胎盤(pán)母體面正中近臍帶處取約250～500mg的組織，避開(kāi)出血、壞死組織及鈣化部位，立即置入液氮浸沒(méi)以便迅速降溫，液氮運(yùn)輸。（2）提?。篢otal總 RNA的提取按R mirVana-RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556的試劑盒進(jìn)行操作）。（3）頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物及熒光探針引物設(shè)計(jì)與合成 數(shù)據(jù)庫(kù)中各目的基因的序列（NM_017617），引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)并合成；DEPC由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。在共焦顯微拉曼光譜儀（Renishaw 1000）上檢測(cè)熒光。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行（由Invitrogen提供）。上游引物為：TCCAGCAGTCTCCGTCCGTG，下游引物為：GGACCCGCCCACAGTGAAAT。（4）特異mRNA的熒光定量PCR技術(shù)的建立及優(yōu)化熒光PCR：采用ABI Vii7 real-time PCR system實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。PCR反應(yīng)體系：H2O 6.4μl，KAPA SYBR FAST Qpcr Master Mix（2×）8μl，Primer（up10pM/μl）0.2μl，Primer（down10pM/μl）0.2μl，Template（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即cDNA）1μl，ROX0.2μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min，94℃變性 8s，60℃ 退火10s，72℃ 延伸45s，循環(huán)55次，最后72℃ 終末延伸10min，4℃保存后再分析結(jié)果。擴(kuò)增完畢后根據(jù)熒光曲線計(jì)算相對(duì)比值。（5）癌組織及正常組織mRNA的檢測(cè)：在共焦顯微拉曼光譜儀（Renishaw21000）上檢測(cè)熒光。激發(fā)光源為氬離子激光器的488nm線，檢測(cè)方式是背反式。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x±s）表示，采用F和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 Notch1蛋白在不同胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。Notch1蛋白在不同胎盤(pán)組織中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率。見(jiàn)表1。

圖1 Notch1蛋白在不同胎盤(pán)組織中的表達(dá)

表1 三組Notch1免疫組化表達(dá)率（n）

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 總RNA提取經(jīng)電泳掃描分析可見(jiàn)清晰完整的兩條條帶，所提取的RNA符合實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)內(nèi)參，建立Notch1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Notch1基因在妊娠期高血壓組胎盤(pán)組織、重度子癇前期組胎盤(pán)組織和正常對(duì)照組胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表2。

表2 Notch1 mRNA在三組胎盤(pán)組織中的表達(dá)（x±s）

3 討論

Notch基因首次發(fā)現(xiàn)于1917年，其突變能造成果蠅的殘翅，1983年Artavanis Tsakonas研究組完善相關(guān)研究并首次克隆了該基因［4］。Notch信號(hào)通路在進(jìn)化上相對(duì)保守，其家族的受體和配體通過(guò)局部細(xì)胞間的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)無(wú)脊椎和脊椎動(dòng)物個(gè)體的發(fā)育［5-6］。目前大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育、T細(xì)胞形成、維持造血干細(xì)胞的自我更新、腫瘤細(xì)胞形成及血管生成中均起著重要作用，其中尤以腫瘤細(xì)胞形成和血管生成方面研究較多［7-8］。Notch信號(hào)在血管的發(fā)生發(fā)展，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移，平滑肌分化，血管生成，動(dòng)靜脈分化等多個(gè)方面有重要調(diào)控功能［9-11］。Jahnsen等［12］對(duì)早期胚胎流產(chǎn)的組織中 Notch-1蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)了 Notch-1蛋白可以調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在胚胎早期發(fā)育、著床及胎盤(pán)血管侵襲中占有非常重要地位。Cormier等［13］研究報(bào)道，除去卵黃囊和胎盤(pán)中Notch受體的小鼠，可發(fā)生嚴(yán)重血管形成及重塑障礙從而導(dǎo)致胚胎早期致死；而在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)過(guò)多的小鼠則發(fā)現(xiàn)與Notch-1/4蛋白受體雙基因敲除小鼠類似的結(jié)果，表明Notch信號(hào)通路在胎盤(pán)的形成過(guò)程中非常重要，在早期胚胎發(fā)育的血管形成中起關(guān)鍵作用。

本資料顯示，Notch1基因表達(dá)水平在妊娠期高血壓胎盤(pán)組織及重度子癇前期患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明隨著疾病的發(fā)生，Notch1基因的表達(dá)水平逐漸下降，Notch1基因參與了在妊娠高血壓的早期發(fā)生過(guò)程，對(duì)妊娠合并高血壓的早期預(yù)防及后期治療具有重要意義。同時(shí)研究認(rèn)為［4］，Notch1基因的表達(dá)狀況與有關(guān)生物學(xué)標(biāo)記物的關(guān)系，Notch1基因的mRNA的表達(dá)量隨著年齡的增加逐漸下降，分別為（4.87±3.51）（＜35周歲孕產(chǎn)婦）和（4.12±2.56）（＞35周歲孕產(chǎn)婦）；同時(shí)，伴發(fā)圍生期不良結(jié)局的胎盤(pán)表達(dá)量更是顯著降低至（3.15±0.78）。這些下降趨勢(shì)表明Notch1基因在妊娠高血壓的演變過(guò)程中亦起到非常重要的作用。雖然Notch1mRNA的低表達(dá)與患者年齡及產(chǎn)后不良結(jié)局具有相關(guān)性，但其表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能受限于樣本量的缺乏，還有待擴(kuò)充樣本量進(jìn)一步加深研究。

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Objective To study the expression of Notch1 gene in hypertensive disorder complicating pregnancy（pregnancy-induced hypertension），severe preeclampsia and normal placenta and its clinical significance. Methods The expression of Notch1 gene in 50 cases of pregnancy-induced hypertension，30 cases of pre-eclampsia and 50 cases of normal placenta were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative PCR. Results The expression of Nocth1 protein in PIH group，severed eclampsia group and normal control group were 52.0%，43.4% and 76% respectively. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）.The mRNA levels of Notch1 mRNA in PIH group，severe eclampsia group and normal control group were 4.10 ± 0.57，3.07 ± 0.45 and 4.88 ± 0.70 respectively. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）. Conclusion The low expression of Notch1 mRNA is associated with the development of PIH.

Notch1 Pregnancy-induced hypertension（PIH） Severe preeclampsia Real-time quantitative PCR Immunohistochemistry

浙江省人口及計(jì)劃生育項(xiàng)目（浙人口計(jì)生委［2011］50號(hào)）

313000 浙江省湖州市婦幼保健院

*通信作者