基于腸道菌群調(diào)節(jié)的GLP-1降糖作用機制研究

袁 曉 陳夏涼 陳 頡 吳巧敏 馮曉紅

基于腸道菌群調(diào)節(jié)的GLP-1降糖作用機制研究

袁 曉 陳夏涼 陳 頡 吳巧敏 馮曉紅

目的 從腸道菌群調(diào)節(jié)角度探討胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的降糖作用機制。方法 40只SD雄性大鼠，隨機分為正常組（N組）、模型組（M組）、二甲雙胍組（MET組）、GLP-1組（GLP-1組），每組各10只。除N組外，其余大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周后，按30mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）進行2型糖尿病造模。造模后，MET組、GLP-1組分別以二甲雙胍及GLP-1治療，N組和M組等量生理鹽水皮下注射，治療6周后，收集大鼠糞便，進行腸道菌群16SrDNA測序分析。結(jié)果 治療6周后，與N組比較，M組、MET組、GLP-1組大鼠空腹血糖均顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，MET組與GLP-1組空腹血糖均顯著下降（P＜0.01），且兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Alpha多樣性上，observed_species、shanno、chao 3個指數(shù)均為N組＞GLP-1組＞MET組＞M組，與N組比較，M組、MET組3指數(shù)差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），GLP-1組僅chao指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與N組比較，M組擬桿菌門比例顯著下降（P＜0.01），變形菌門、厚壁菌門比例顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，GLP-1組擬桿菌門比例顯著升高（P＜0.01），變形菌門比例顯著下降（P＜0.01）。與N組比較，M組乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著下降（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，GLP-1組乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論 GLP-1可能通過增加T2DM大鼠腸道菌群物種多樣性，同時提高乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌比例，從而起到調(diào)控血糖的作用。

腸道菌群 GLP-1 降糖 作用機制

糖尿病是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合征，因胰島素分泌不足或（和）胰島素抵抗，引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)等一系列代謝紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失衡與T2DM的發(fā)生、發(fā)展可能密切相關(guān)［1］。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是回腸及結(jié)腸遠(yuǎn)端L細(xì)胞內(nèi)合成并分泌的一種腸促胰素，能通過促進胰島素合成和分泌、減少胰高糖素分泌及減緩胃排空等多種機制調(diào)控血糖。研究證實［2］，T2DM患者或小鼠胃腸旁路術(shù)后，在血糖控制改善的同時，GLP-1水平變化與腸道菌群變化存在一定的相關(guān)性。2016年 5月至11月作者應(yīng)用16SrDNA測序技術(shù)，通過對正常大鼠、T2DM模型大鼠、二甲雙胍及GLP-1治療后大鼠腸道菌群的檢測，觀察T2DM大鼠腸道菌群的變化，并從腸道微生態(tài)菌群調(diào)節(jié)角度探討GLP-1的降糖作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心購于中科院上海實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 主要試劑和藥品 GLP-1選用美國禮來公司長效GLP-1類似物艾塞那肽注射液（商品名：百泌達(dá)）；二甲雙胍選用施貴寶公司藥品（商品名：格華止）。糞便DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。

1.3 主要儀器 PCR儀（LongGene，A200），離心機（ependorf，5424），16SrDNA測序儀（Miseq，2825）。1.4 方法 （1）動物分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，SD大鼠隨機分為4組：正常組（N組），模型組（M組），二甲雙胍組（MET組），GLP-1組，每組各10只。（2）模型制備：造模方法參考《藥理實驗方法學(xué)》，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始實驗：N組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，其余3組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng) 8周后，空腹18～24h，M組、MET組、GLP-1組均按空腹體重30mg/kg腹腔注射STZ［用前以pH4.4的0.1mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成1%（10mg/ml）的濃度］，并繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，72h后，禁食8h，尾靜脈采血，測空腹血糖，2次血糖≥16.7mmol/L，即造模成功；N組僅注射同等體積的生理鹽水。（3）給藥劑量及方法：模型建立后，開始藥物治療6周：GLP-1 組給予艾塞那肽注射液5μg/kg，2次/d皮下注射；MET組予二甲雙胍400mg/（kg·d），2次/d灌胃給藥；N組和M組予等量生理鹽水皮下注射，2次/d，連續(xù)6周。（4）檢測指標(biāo)及方法：①血糖監(jiān)測：造模成功后，M組、MET組及GLP-1組大鼠測空腹血糖，1次/周，尾靜脈取血，葡萄糖氧化酶法測定。②腸道菌群16SrDNA測序及信息分析：于治療6周后，以無菌方法收集4組大鼠糞便，將每只大鼠糞便分別放入滅菌EP管，-80℃保存，稱取0.1g大鼠便樣，采用TIANGEN公司糞便基因組DNA提取試劑盒提取樣品的總基因組DNA；16SrDNA測序通過對V3和V4雙可變區(qū)進行PCR擴增，純化產(chǎn)物建庫，文庫構(gòu)建步驟遵循Illumina測序儀文庫構(gòu)建方法。測序分析針對Illumina MiSeq 2X300bp paired-end測序數(shù)據(jù)進行分析，對于MiSeq測序獲得的雙端數(shù)據(jù)，根據(jù)barcode信息進行樣品區(qū)分，然后根據(jù)overlap關(guān)系進行merge拼接成tag，對拼接完成的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)過濾，隨后進行Q20、Q30等質(zhì)控分析，對最終獲得clean數(shù)據(jù)進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)等信息分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖比較 實驗開始，各組大鼠空腹血糖比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。喂養(yǎng)8周后，M組、MET組、GLP-1組空腹血糖均高于N組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療6周后，與N組比較，M組、MET組、GLP-1組空腹血糖均顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，MET組與GLP-1組空腹血糖均顯著下降（P＜0.01），且兩組間血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖變化（x±s）

2.2 腸道菌群物種Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括observed_ Species、shannon、chao指數(shù)以及simpson指數(shù)等，前面3個指數(shù)越大，最后一個指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富。見表2。

表2 各組observed Species、shannon、chao及simpson指數(shù)比較（x±s）

2.3 各組大鼠腸道菌群門分類水平的主要物種組成比較 各組大鼠腸道菌群最主要的均由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門三者組成。N組大鼠腸道菌群主要組成為擬桿菌門75.5%、厚壁菌門20.8%、變形菌門3.1%；M組大鼠為擬桿菌門59.5%、厚壁菌門34.9%、變形菌門5.0%；MET組大鼠為擬桿菌門59.1%、厚壁菌門34.2%、變形菌門5.0%；GLP-1組大鼠為擬桿菌門61.0%、厚壁菌門35.1%、變形菌門3.4%。與N組比較，M組擬桿菌門比例顯著下降（P＜0.01），變形菌門、厚壁菌門比例顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，GLP-1組擬桿菌門比例顯著升高（P＜0.01），變形菌門比例顯著下降（P＜0.01），厚壁菌門比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；MET組擬桿菌門、厚壁菌門比例均顯著下降（P＜0.01），變形菌門比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠腸道菌群屬分類水平比較 與N組比較，M組大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著下降（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著升高（P＜0.01）。與M組比較，GLP-1組大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著下降（P＜0.01）；MET組大鼠乳酸桿菌屬、螺桿菌屬比例顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著下降（P＜0.01），雙歧桿菌屬差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腸道是人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，其中的大量微生物稱腸道菌群。據(jù)估計人體腸道中含有＞1000種細(xì)菌，總數(shù)＞1014個［3］。腸道菌群在合成營養(yǎng)成分、調(diào)節(jié)免疫、生物拮抗方面發(fā)揮著十分重要的作用。

腸道菌群失衡是指由于腸道菌群結(jié)構(gòu)改變、細(xì)菌代謝活性變化或菌群在局部分布變化而引起的失衡狀態(tài)，較多因素如抗生素、腸蠕動改變及飲食變化等均可引起腸道菌群失衡。最新研究認(rèn)為，腸道菌群失衡可引發(fā)機體免疫力下降、慢性炎癥反應(yīng)、能量失衡等一系列問題，進而可導(dǎo)致代謝失調(diào)，最終可促使T2DM的發(fā)生［4］。

GLP-1是腸上皮細(xì)胞分泌的腸肽激素，除了刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素、抑制胰高糖素分泌等作用外，還能抑制迷走神經(jīng)減少胃和十二指腸的蠕動，減少胃酸分泌、増加幽門壓力、延緩胃排空?；贕LP-1可作用于胃腸道引起腸蠕動的改變，而腸蠕動的改變可引起腸道菌群變化，且臨床和動物研究均顯示T2DM患者或小鼠胃腸旁路術(shù)后，GLP-1水平變化與腸道菌群變化存在一定的相關(guān)性［2］，因此，推測GLP-1可能可以通過對腸道菌群數(shù)量、結(jié)構(gòu)等的調(diào)節(jié)起到調(diào)控血糖的作用。

本資料中Alpha多樣性分析顯示，與N組比較，M組大鼠腸道菌群物種多樣性顯著降低，這和黃旭東［5］等研究結(jié)果基本一致，提示腸道菌群物種數(shù)量下降與糖、脂代謝的異常有關(guān)，是T2DM等代謝性疾病的重要病因之一。經(jīng)過GLP-1或二甲雙胍治療后，T2DM大鼠腸道菌群物種多樣性均有不同程度增加，且在血糖水平無顯著差異的情況下，GLP-1組腸道菌群多樣性增加較MET組更為顯著，接近正常組大鼠，提示GLP-1可能可以通過提高腸道菌群物種多樣性起到調(diào)控血糖的作用。

在腸道菌群門分類水平比較顯示，各組大鼠腸道優(yōu)勢菌群都集中在擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。擬桿菌門包括了如多形擬桿菌等眾多益生菌，而變形菌門包括較多有害菌，如大腸桿菌、螺桿菌等。與N組比較，M組大鼠擬桿菌門比例顯著減少，變形菌門比例顯著增加，這與既往研究基本一致［6］。與M組比較，GLP-1組擬桿菌門比例顯著升高，變形菌門比例顯著下降，菌群比例恢復(fù)至接近正常組大鼠；而MET組擬桿菌門、厚壁菌門比例均下降，變形菌門比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

在腸道菌群屬分類水平上比較顯示，與N組比較，M組大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌屬比例顯著下降，而大腸桿屬菌、鏈球菌屬等有害菌屬比例顯著升高。經(jīng)治療后，MET組益生菌雙歧桿菌屬比例無顯著增加，而GLP-1組乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌比例顯著增加，大腸桿菌屬、鏈球菌屬等有害菌比例顯著下降，趨向正常大鼠菌群水平。

對于腸道益生菌調(diào)節(jié)血糖的機制，目前已有較多研究：部分益生菌產(chǎn)生的丁酸進入血液中具有抗炎和改善胰島素抵抗的作用，與胰島素抵抗及T2DM發(fā)生密切相關(guān)［7］；雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乳球菌等益生菌能提高機體抗氧化應(yīng)激的能力，還可提高鉻、鋅等微量元素的生物活性。益生菌還可以提高腸道細(xì)菌分泌酶的活性，如β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷水解酶等活性，使糖類分解為人體更易吸收的預(yù)消化狀態(tài)，有助于促進外周組織對糖的攝取和利用［8］；益生菌可將一些多糖轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，部分被腸道黏膜直接利用，部分吸收入血，通過與脂肪細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)的脂肪酸受體結(jié)合，促進游離脂肪酸和葡萄糖的吸收，并改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［9］。

基于GLP-1對胃腸道生理功能具有一定調(diào)節(jié)作用，結(jié)合本資料結(jié)果顯示，GLP-1對腸道微生態(tài)菌群具有一定調(diào)節(jié)作用，可能通過增加T2DM大鼠腸道菌群物種的多樣性，同時提高乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌比例，從而起到調(diào)控血糖的作用。這為更全面闡釋GLP-1降糖作用機制，并為后續(xù)GLP-1基礎(chǔ)上T2DM治療靶點和治療藥物的研究提供可靠的實驗依據(jù)。

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Objective To explore the mechanism of hypoglycemic effect of GLP-1 on the regulation of intestinal fl ora. Methods 40 SD male rats were randomly divided into normal group，model group，metformin group and GLP-1 group，10 rats in each group. In addition to the N group，the other rats were fed with high fat diet for 8 weeks and intraperitoneal injection of STZ according to the 30mg/kg for type 2 diabetes model. MET and GLP-1 group were treated respectively with metformin and GLP-1，N and M groups were subcutaneous injected with normal saline for 6 weeks，then collected of rat feces to intestinal fl ora 16SrDNA sequence. Results Compared with N group，the fasting blood glucose of M，MET and GLP-1 group rats were signif i cantly elevated（P＜0.01）；compared with M group，MET and GLP-1 group were signif i cantly decreased（P＜0.01），and no signif i cant difference between the two groups（P＜0.01）.The 3 indexes of observed species,shanno,and chao were N grouP＞GLP-1 grouP＞MET grouP＞M group. Compared with N group，the 3 indexes’ difference of M group and MET group had statistical signif i cance（P＜0.01），while only Chao index difference of GLP-1 group had statistical significance（P＜0.01）. Compared with the N group，the proportion of Bacteroidetes of M group was signif i cantly decreased（P＜0.01），and the proportion of Proteobacteria and Firmicutes were signif i cantly increased（P＜0.01）.Compared with the M group，the proportion of Bacteroidetes of GLP-1 group was significantly increased（P＜0.01），and the proportion of Proteobacteria was signif i cantly decreased（P＜0.01）.Compared with N group，the proportion of Lactobacillus and Bif i dobacterium of M group were signif i cantly decreased（P＜0.01），and the proportion of Escherichia and Streptococcus were significantly increased（P＜0.01）.Compared with M group，the proportion of Lactobacillus and Bif i dobacterium of GLP-1 group were signif i cantly increased（P＜0.01），and the proportion of Escherichia and Streptococcus were signif i cantly decreased（P＜0.01）. Conclusion GLP-1 may increase the species diversity of the intestinal fl ora of T2DM rats，and increase the proportion of probiotics such as Lactobacillus and Bif i dobacteria，thus playing a role in regulating blood glucose.

Intestinal fl ora GLP-1 Hypoglycemic Mechanism

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2016KYB218）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（袁曉 陳頡吳巧敏 馮曉紅）310006 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院（陳夏涼）