超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定麻辣燙中喹諾酮類藥物殘留

趙 飛，高廣慧，賈宏新

(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

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超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定麻辣燙中喹諾酮類藥物殘留

趙 飛*，高廣慧，賈宏新

(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

建立了麻辣燙中14種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。采用酸化乙腈提取麻辣燙中的喹諾酮類藥物殘留，提取溶液經(jīng)鹽析和C18固相萃取柱凈化后，在電噴霧離子源中正離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進行測定，內(nèi)標法定量。結(jié)果顯示，14種喹諾酮類藥物在7.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。在3個不同加標水平下的平均回收率為75.4%～110.0%，相對標準偏差(n=6)為1.3%～10.1%，14種化合物的檢出限和定量下限分別為0.5，1.5 μg/kg。該方法操作簡單、快速，凈化效果好，靈敏度高，適用于麻辣燙中多種喹諾酮類藥物殘留的同時定性和定量檢測。

固相萃?。怀咝б合嗌V-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法；喹諾酮類藥物；麻辣燙

喹諾酮類藥物是一類合成抗菌藥物，其抗菌譜廣，見效快，成本低，被廣泛用于醫(yī)療[1-2]。同時該類藥物也是衛(wèi)生部公布的“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單”中禁用于麻辣燙食品中的藥物。當前對該類藥物檢測方法的研究中，較多的是對動物源性食品[3-9]和豆芽的檢測研究，對于麻辣燙中該類藥物的檢測尚未見報道。不法商販將喹諾酮類藥物添加在麻辣燙類食品中用于殺菌，防止人們食用變質(zhì)的該類食物后出現(xiàn)腸胃不適等情況。但長期攝入這類藥物會影響人體正常的腸道菌群分布，并催生該類藥物的耐藥性。

目前，食品中喹諾酮類藥物的檢測方法主要有液相色譜法[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-10]、酶聯(lián)免疫法[11]。由于不同種類的食品基質(zhì)組分相差較大，檢測麻辣燙中喹諾酮類藥物時，不僅要求樣品前處理方法要具有普適性和高效性，而且要具有較高的選擇性。因此，本文以市售的麻辣燙為研究對象，對麻辣燙中喹諾酮類藥物檢測的樣品前處理條件、分離條件和質(zhì)譜檢測條件進行了優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測麻辣燙中喹諾酮類藥物的方法，并對市售200批次樣品進行了檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ESI TQD三重四極桿質(zhì)譜儀，XEVO超高效液相色譜儀，BEH Shield RP18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Oasis HLB固相萃取柱，均購于美國Waters公司；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；渦旋混合儀(德國IKA公司)；高速冷凍離心機(美國熱電公司)；氮吹儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；氯化鈉、氨水(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

14種喹諾酮類標準品包括氟羅沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.6%)、氧氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.0%)、諾氟沙星(中國食品藥品檢定研究院，99.5%)、依諾沙星(中國食品藥品檢定研究院，91.1%)、環(huán)丙沙星(中國食品藥品檢定研究院，84.2%)、恩諾沙星(Dr.Ehrenstorfer，98.5%)、鹽酸洛美沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.0%)、甲磺酸達氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，94.0%)、奧比沙星(Dr.Ehrenstorfer，97.8%)、鹽酸雙氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，98.0%)、鹽酸沙拉沙星(Dr.Ehrenstorfer，95.0%)、司帕沙星(中國食品藥品檢定研究院，99.8%)、氟甲喹(Dr.Ehrenstorfer，98.3%)、培氟沙星(中國食品藥品檢定研究院，71.1%)；3種內(nèi)標物標準品氘代諾氟沙星、氘代環(huán)丙沙星和氘代恩諾沙星均購自Witega。

分別精密稱取各標準品、內(nèi)標標準品適量，各加入0.2 mL甲酸，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度約1 000 mg/L的單標準儲備液，置于棕色瓶中，于-18 ℃冰箱中保存。將上述儲備液用甲醇稀釋為0.5 mg/L的混合標準中間液，用于質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。使用時根據(jù)需要，以0.1%甲酸-乙腈(95∶5)溶液逐級稀釋為混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2%甲酸乙腈溶液的配制：量取490 mL乙腈，向其中加入10 mL甲酸，混合均勻即得。

1.3 樣品處理

稱取勻質(zhì)后的試樣5.00 g于50 mL離心管中，加入100 ng/mL混合內(nèi)標溶液0.2 mL，加入10 mL 2%甲酸乙腈溶液，擰緊上蓋，于渦旋混合儀上渦旋30 s；以7 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，殘留物再用10 mL 2%甲酸乙腈溶液提取2次，合并3次提取液；向提取液中加入3.0 g氯化鈉，擰緊上蓋，于渦旋混合儀上渦旋30 s，將上清液(乙腈層)轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋30 s，棄去正己烷層，乙腈層于氮氣流下吹至近干，加入5 mL水，渦旋混合30 s，10 000 r/min離心10 min，待用。

依次用6 mL甲醇、6 mL水活化HLB小柱(200 mg，6 mL)，將樣品溶液轉(zhuǎn)移至小柱中，以6 mL 5%甲醇洗滌小柱，抽干后，用6 mL甲醇洗脫樣品，收集洗脫液于氮氣流下吹至近干，用1.00 mL初始比例流動相溶解，渦旋混合30 s，過0.22 μm濾膜供LC-MS/MS分析。

1.4 空白基質(zhì)匹配混合標準溶液的配制

取空白基質(zhì)麻辣燙樣品，按“1.3”方法處理樣品，濃縮至近干，加入混合標準工作溶液1.00 mL復(fù)溶，渦旋混合30 s，過0.22 μm濾膜，即得空白基質(zhì)匹配混合標準溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：BEH Shield RP18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈溶液；流速：0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0 min，96%A；0～1 min,96%～90%A；1～3 min,90%～40%A；3～4 min,40%～96%A。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓3 kV；離子源溫度：450 ℃；霧化氣流速：0.8 L/min；質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件 本研究選擇乙腈作為流動相有機相，分別考察了在水相中不加酸以及分別加0.1%乙酸、0.2%乙酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸后對色譜分離和質(zhì)譜靈敏度的影響。結(jié)果表明，在水相中加酸后，各化合物的離子化效率明顯提高，峰形更好；在水相中各添加相同體積分數(shù)的甲酸和乙酸時，由于甲酸的酸性高于乙酸，添加甲酸的效果略優(yōu)于乙酸，且在質(zhì)譜流動相中甲酸的使用更為普遍；向水相中添加不同體積分數(shù)的甲酸時，各化合物的離子化效率無明顯變化。因此，選擇加入0.1%甲酸溶液即可滿足要求。

圖1 麻辣燙中14種喹諾酮類藥物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 14 kinds of quinolones standard

以0.1%甲酸溶液作為水相，分別以乙腈和0.1%甲酸乙腈溶液作為有機相，實驗結(jié)果表明，以0.1%甲酸-乙腈作為流動相時，14種喹諾酮類化合物響應(yīng)較好；以0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相時，除氟甲喹的響應(yīng)較前者有明顯增強之外，其余喹諾酮類藥物的響應(yīng)均降低，因此最終選擇0.1%甲酸-乙腈為流動相。

采用選定的流動相，對混合標準溶液進行分離，優(yōu)化梯度洗脫程序，使所有待測化合物均具有良好的峰形和靈敏度，優(yōu)化后的梯度洗脫程序見“1.5”。由于各喹諾酮類化合物的性質(zhì)相近，保留時間較為接近，本研究通過碎片離子的差異進行區(qū)分。圖1為4 μg/kg添加水平下，麻辣燙中目標化合物的總離子流色譜圖。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用質(zhì)譜直接進樣的方式將0.5 mg/L的混合標準中間液進樣，分別進行正離子和負離子全掃描分析，所有待測化合物的最佳準分子離子峰均在正離子掃描模式下獲得，母離子均為[M+H]+。以各化合物的準分子離子為母離子，通過改變錐孔電壓，選擇準分子離子響應(yīng)最好的電壓作為錐孔電壓；對準分子離子進行二級全掃描，得到其碎片離子信息；通過改變碰撞能量，選擇穩(wěn)定且響應(yīng)最好的兩個碎片離子作為特征子離子，其中豐度相對較強的為定量離子，另一個作為定性離子，再對兩個碎片離子的碰撞能量進行優(yōu)化，使定量離子和定性離子的響應(yīng)最優(yōu)。優(yōu)化后得到的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 麻辣燙空白樣品中14種喹諾酮類藥物的基質(zhì)效應(yīng)、回收率與精密度(n=6)

*quantitative ion

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 麻辣燙樣品的種類繁多，成分復(fù)雜，所以樣品前處理過程中提取溶劑的選擇尤為重要。有機溶劑中乙腈和甲醇對喹諾酮類化合物具有較好的提取效果，同時兩種溶劑具有沉淀蛋白的作用；但由于甲醇極性大于乙腈，采用甲醇提取時，會提取出更多的極性雜質(zhì)，增加了后續(xù)除雜難度，因此選擇乙腈為提取溶劑。麻辣燙中的喹諾酮類藥物應(yīng)為人為添加，藥物在樣品中的存在形式以游離態(tài)為主，且該類化合物大多帶有伯胺或仲胺基團，具有一定的弱堿性，因此考察了添加不同體積分數(shù)甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑的提取效果，實驗表明，2%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑時提取效率最優(yōu)，因此最終選擇其為最佳提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化 本研究采用2%甲酸乙腈溶液作為麻辣燙樣品中喹諾酮類藥物的提取液，因麻辣燙樣品本身含水量較大，且乙腈和水互溶，因此本文采用氯化鈉作為鹽析劑，以緩解提取中的乳化現(xiàn)象，并將大量的水溶性雜質(zhì)除去，減少質(zhì)譜污染。

麻辣燙樣品中含有的大量油脂會隨著2%甲酸乙腈溶液一并提取出來，為了減少最終檢測溶液中油脂的含量，需對提取液進行除油操作。考慮到常用除油試劑石油醚、乙醚較易揮發(fā)，所以選擇乙腈飽和的正己烷進行除油。

選用Waters Oasis HLB 固相萃取柱進行后續(xù)凈化，考察了淋洗液濃度和洗脫液體積，最終選擇6 mL 5%甲醇溶液作為淋洗液，6 mL甲醇作為洗脫液。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價 基質(zhì)效應(yīng)是存在于樣品前處理過程直至最終測試溶液中的干擾物在質(zhì)譜中與目標化合物競爭電離，進而影響目標化合物的檢測靈敏度和重現(xiàn)性的現(xiàn)象。本研究中，分別配制了相同含量的基質(zhì)工作曲線和溶劑標準曲線，進樣測試，得到兩條標準曲線，通過計算同一目標化合物兩條曲線的斜率比值，來評價各目標化合物基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果見表2，其中奧比沙星呈現(xiàn)較為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，為了得到更準確的定量結(jié)果，本研究中采用基質(zhì)工作曲線。

2.2.4 線性方程、檢出限與定量下限 按照“1.4”方法配制濃度為7.5，15，30，50，75，100 μg/L 6個濃度水平的混合基質(zhì)工作溶液，并在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進行檢測。以目標化合物定量離子的峰面積與內(nèi)標物定量離子峰面積的比值(y)作為縱坐標、質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標繪制曲線。結(jié)果顯示，14種喹諾酮類藥物在7.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.990 1～0.999 3。實驗采用空白樣品中添加混合目標組分的方法，按照前處理過程和儀器條件進行樣品前處理和檢測，以定量離子色譜峰信噪比(S/N)大于3作為檢出限，S/N>10作為定量下限，確定麻辣燙中14種喹諾酮類藥物的檢出限均為0.5 μg/kg，定量下限均為1.5 μg/kg。

2.2.5 回收率與精密度 在空白麻辣燙樣品中添加14種喹諾酮類藥物的混合標準溶液，制備含量分別為1.5，3.0，15 μg/kg的加標樣品，按照“1.3”處理方法及“1.5”和“1.6”的測定條件進行回收率實驗，每個加標水平平行6份，結(jié)果見表2。各化合物的平均回收率為75.4%～110.0%，相對標準偏差為1.3%～10.1%。

圖2 陽性樣品的代表譜圖Fig.2 Representative chromatograms of positive sampleA：chromatogram of ciprofloxacin's quantitative ion;B:chromatogram of deuterated ciprofloxacin's quantitative ion

2.3 實際樣品的檢測

采用本文建立的方法，對185批麻辣燙和15批麻辣燙底料食品進行檢測，樣品采自沈陽、大連、本溪、撫順、鐵嶺、盤錦、鞍山、阜新、遼陽、營口各地，覆蓋了以上各城市的麻辣燙店、燒烤店、飯店、小吃街和批發(fā)市場等，結(jié)果在麻辣燙底料中未檢出本文的14種喹諾酮類化合物，有8批次麻辣燙中檢出喹諾酮類藥物，其中檢出恩諾沙星為3.3 μg/kg，諾氟沙星2.6 μg/kg，環(huán)丙沙星分別為2.4,6.3,137,3.5,3.0,166,6.8 μg/kg。陽性樣品的代表譜圖見圖2。

3 結(jié) 論

本研究采用酸化乙腈提取麻辣燙樣品中的喹諾酮類化合物，結(jié)合固相萃取凈化方法，建立了UPLC-MS/MS同時檢測麻辣燙及底料中14種喹諾酮類藥物的分析方法。該方法操作簡便、快速、準確，其靈敏度、回收率和精密度均符合檢測技術(shù)的要求，可為食品檢驗檢測機構(gòu)進行麻辣燙及其底料中的喹諾酮類藥物檢測提供技術(shù)支持。

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Determination of Quinolones in Hotpot Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Fei*,GAO Guang-hui,JIA Hong-xin

(Liaoning Institute for Food Control,Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was established for the determination of 14 quinolones in hotpot.Samples were extracted with acidified acetonitrile,defated withn-hexane,separated on a C18solid phase extraction(SPE) column,and analyzed by LC-ESI-MS/MS under the positive mode with multiple reaction monitoring(MRM).The method showed good linearities for 14 quinolones over the range of 7.5-100 μg/L with correlation coefficients(r) more than 0.990.The detection limits of 14 quinolones were 0.5 μg/kg,and the quantitation limits were 1.5 μg/kg.The recoveries of all analytes in hotpot ranged from 75.4% to 110.0%with relative standard deviations(RSD,n=6)of 1.3%-10.1%.The method has the advantages of simplicity,rapidness,good purifying effect and sensitivity,and is suitable for the simultaneous determination of quinolones in hotpot.

SPE;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);quinolones;hotpot

2017-01-22；

2017-02-15

國家質(zhì)檢總局科研計劃項目(2016IK169)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.011

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0768-05

*通訊作者：趙 飛，碩士，工程師，研究方向：理化分析，Tel：13940021647，E-mail：60340837@qq.com