青蒿素對(duì)ApoE-/-基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

曹 乾，杜洪姣，史 瑾，李曉東

·論著·

青蒿素對(duì)ApoE-/-基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

曹 乾*，杜洪姣，史 瑾，李曉東

目的 探討青蒿素對(duì)ApoE-/-基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化以及炎癥因子的影響。方法 將20只ApoE-/-基因敲除小鼠分為青蒿素組和PBS處理組，每組10只，經(jīng)高脂喂養(yǎng)8周，與對(duì)照組小鼠(C57BL/6J標(biāo)準(zhǔn)飲食小鼠，10只)比較，通過(guò)血管大體油紅O染色評(píng)價(jià)斑塊面積；HE染色觀察病變形態(tài)及血漿中炎癥因子的變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，PBS處理組及青蒿素組均可見(jiàn)動(dòng)脈硬化斑塊，炎癥因子水平升高。青蒿素組的動(dòng)脈硬化程度及炎癥因子水平均明顯低于PBS處理組。結(jié)論 青蒿素可以改善ApoE-/-基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

青蒿素；ApoE-/-基因敲除小鼠；動(dòng)脈粥樣硬化

0 引言

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種全身性慢性動(dòng)脈疾病，可以侵害大、中動(dòng)脈，造成血管內(nèi)膜增厚、僵硬、管腔面積狹窄。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和遷移與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，同時(shí)動(dòng)脈粥樣硬化整個(gè)過(guò)程都有炎性反應(yīng)參與[1]。有研究表明，炎性細(xì)胞因子及抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)失衡參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化。青蒿素(Artemisinin，ART)又名黃花蒿素，是由菊科植物黃花蒿所提煉出來(lái)的倍半萜內(nèi)酯化合物，除具有抗瘧疾作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，其還具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗炎[4-5]等廣譜的生物學(xué)和藥理學(xué)活性。

由于ApoE-/-基因敲除小鼠動(dòng)脈硬化模型與人體相似度高，近年來(lái)已經(jīng)成為研究動(dòng)脈硬化的重要模型[6]。本研究通過(guò)建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察青蒿素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化以及炎癥因子的影響，為臨床治療AS提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J小鼠10只，健康雄性ApoE-/-基因敲除小鼠20只，體重16～20 g，由華阜康公司提供，青蒿素，ELISA試劑盒，多聚甲醛、無(wú)水乙醇、二甲苯、水合氯醛、蘇木精、伊紅、戊二醛等均由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供，青蒿素：Dalian Meilun Biotech Co.，Dalian。

1.2 動(dòng)物分組與模型建立

1.2.1 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及分組 對(duì)照組：C57BL/6J小鼠10只，每日給予標(biāo)準(zhǔn)飼料20 g，喂養(yǎng)8周；相同標(biāo)準(zhǔn)劑量生理鹽水腹腔注射，注射8周。PBS處理組：健康雄性ApoE-/-基因敲除小鼠10只，每日給予高脂飼料20 g，喂養(yǎng)8周；相同標(biāo)準(zhǔn)劑量生理鹽水腹腔注射，注射8周。青蒿素組：健康雄性ApoE-/-基因敲除小鼠10只，每日給予高脂飼料20 g，同時(shí)腹腔注射青蒿素(參考劑量：100 mg/kg)，喂養(yǎng)8周。

8周后，留取血清標(biāo)本，處死小鼠后各組留取主動(dòng)脈，部分經(jīng)液氮速凍后置于-70 ℃保存，部分置于甲醛中固定48 h，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 組織染色 油紅O染色確定斑塊面積及部位。油紅O染色：①用干凈清潔的硅化載玻片粘取冷凍切片，切片干燥后入60%異丙醇浸洗10 min。②油紅O工作液染色10 min，避光。③ddH2O漂洗15 s，60%異丙醇分化3～10 s至間質(zhì)清晰，水洗。④Mayer蘇木精復(fù)染1 min，自來(lái)水返藍(lán)。⑤濾紙小心吸干水分，甘油明膠封片。

HE染色觀察病變分級(jí)。HE染色：將主動(dòng)脈置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，切至7 μm薄片，置于蘇木精中染色1 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，伊紅染液染色2 min，切片入無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1 min，入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各3 min后，滴加適量中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法 以體視顯微鏡及光學(xué)顯微鏡觀察三組標(biāo)本。用斑塊百分比(動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積/動(dòng)脈總面積)反映動(dòng)脈硬化程度。圖片經(jīng)Photoshop、Image-Pro-Plus 6.0等軟件對(duì)紅色斑塊面積進(jìn)行圈定計(jì)算，以及對(duì)小鼠主動(dòng)脈總面積的圈定計(jì)算，結(jié)果以斑塊百分比=動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積/動(dòng)脈總面積表示。分別計(jì)算各組小鼠的平均百分比，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

飼養(yǎng)后8周的小鼠血脂情況見(jiàn)表1。

表1 小鼠血脂指標(biāo)(mmol/L)

體視顯微鏡觀察顯示，PBS處理組主動(dòng)脈大部分灰白不透明，弓斑塊明顯，大小不等，管壁彈性差。青蒿素組主動(dòng)脈大部分呈透明狀，主動(dòng)脈可見(jiàn)灰白色斑塊，呈斑點(diǎn)狀，但面積明顯小于PBS處理組，且管壁彈性較好。對(duì)照組主動(dòng)脈管壁透明，無(wú)AS病灶。見(jiàn)圖1。光學(xué)顯微鏡觀察：PBS處理組主動(dòng)脈管壁可見(jiàn)由泡沫細(xì)胞形成的脂紋脂斑和膽固醇結(jié)晶，管壁厚薄不均。青蒿素組主動(dòng)脈管壁可見(jiàn)輕度增厚隆起，厚薄較均勻，少量炎癥細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖1 油紅染色

圖2 HE染色

對(duì)照組動(dòng)脈管腔面積(363.95±32.17)×10-3mm2；PBS處理組動(dòng)脈管腔面積(334.53±45.40)×10-3mm2，斑塊面積43.58 mm2，比例13.03%；青蒿素組動(dòng)脈管腔面積(350.36±39.73)×10-3mm2，斑塊面積28.22 mm2，比例8.05%。青蒿素處理后的 ApoE-/-小鼠心臟三尖瓣部位的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積平均值較PBS處理組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PBS處理組和青蒿素組間的主動(dòng)脈部位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比平均值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.03% vs.8.05%，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠主動(dòng)脈管腔面積

PBS處理組炎癥因子的TNF-α、hs-CRP表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，SOD明顯下降(P<0.05)；青蒿素組炎癥表達(dá)有所改變，與PBS處理組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 三組小鼠炎癥因子表達(dá)情況

3 討論

動(dòng)脈硬化是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，發(fā)病率和致殘率均高，其防治日益受到重視[7-8]。動(dòng)脈硬化可能與內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、平滑肌增殖等多方面因素有關(guān)[9]。ApoE-/-基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型由于造模較容易，并且與人類動(dòng)脈硬化相似度高，而被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究[10]。

青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在內(nèi)過(guò)氧橋，斷裂后產(chǎn)生的碳中心自由基分子和ROS是其發(fā)揮藥理學(xué)和毒理學(xué)作用的共同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來(lái)，關(guān)于青蒿素的研究已經(jīng)從抗瘧疾治療領(lǐng)域擴(kuò)展到針對(duì)炎癥、氧化及平滑肌增殖等諸多領(lǐng)域[11-12]。筆者前期試驗(yàn)中進(jìn)行了不同劑量的篩選以及細(xì)胞毒理學(xué)研究。本研究選取100 mg/kg的青蒿素[13-14]，針對(duì)青蒿素對(duì)ApoE-/-基因敲除小鼠早期動(dòng)脈硬化程度的影響以及動(dòng)脈硬化中的炎癥因子進(jìn)行了檢測(cè)。從炎癥角度評(píng)價(jià)青蒿素延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)程的作用。體視顯微鏡及光鏡下均顯示，對(duì)于易患個(gè)體(ApoE-/-基因敲除小鼠)，高脂飲食明顯促進(jìn)主動(dòng)脈動(dòng)脈硬化程度進(jìn)展。給予干預(yù)因素(青蒿素治療)后，動(dòng)脈硬化程度得到延緩。青蒿素干預(yù)組的斑塊百分比明顯降低，主動(dòng)脈管腔面積增加，同時(shí)炎癥因子CRP、腫瘤壞死因子水平明顯降低。提示青蒿素具有通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、改善氧化應(yīng)激等途徑延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)程的作用。研究表明，其通過(guò)NF-κB和 MAPK調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15-16]。具體劑量方法、作用環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步研究證實(shí)[17-18]。

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Effect of artemisinin on atherosclerosis of ApoE-knockout mice

CAO Qian*,DU Hong-jiao,SHI Jin,LI Xiao-dong

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the influence of artemisinin on atherosclerosis and the inflammatory factors of ApoE-knockout mice.Methods Twenty rigorously selected ApoE-knockout mice were randomly divided into artemisinin-treated group (ATG) and PBS-treated group (PTG),and 10 C57 mice were chosen as control group (CHFG).After 8 weeks of high-fat diet,HE staining and oil-red staining were administrated to evaluate the degree of artery atherosclerosis,and detect the plasma levels of inflammatory cytokine.Results Compared with CHFG,the degrees of artery atherosclerosis of ATG group and PTG group exacerbated and the plasma levels of inflammatory cytokine were dramatically elevated (P<0.05).The degree of artery atherosclerosis and plasma levels of inflammatory cytokine in ATG groups were lower than those of PTG group (P<0.05).Conclusion Artemisinin can inhibit the atherosclerotic progress of high-fat fed ApoE-knockout mice.

Artemisinin;ApoE knock-out mice;Atherosclerosis

2017-01-23

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng) 110004

遼寧省省直醫(yī)院改革重點(diǎn)臨床科室診療能力建設(shè)項(xiàng)目(LNCCC-D10-2015)；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院優(yōu)秀博士課題資助項(xiàng)目(201608)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706001

*通信作者