肺表面活性蛋白B的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展

劉 欽，顧仕苓，唐曉蓮，王萬(wàn)能，周繼紅

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 第四研究室，重慶 400042)

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肺表面活性蛋白B的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展

劉 欽1，顧仕苓1，唐曉蓮1，王萬(wàn)能1，周繼紅2

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 第四研究室，重慶 400042)

肺表面活性蛋白B；結(jié)構(gòu)；構(gòu)效關(guān)系；脂質(zhì)-蛋白相互作用

肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)是肺表面活性物質(zhì)發(fā)揮功能作用不可缺少的重要組成成分，約占總量的10%[1-2]。 SP按其被認(rèn)為的先后順序分別命名為SP-A、SP-B、SP-C和SP-D 4種， 其中SP-B為小分子疏水性蛋白，其主要功能是降低肺表面張力，維持正常肺呼吸功能[3-5]。SP-B作為維持肺正常呼吸作用的關(guān)鍵物質(zhì)，它的異常會(huì)引起肺部疾病，如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，是目前臨床上肺部疾病中較為常見(jiàn)的呼吸病，一直困擾著國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界[6]。對(duì)于這類(lèi)疾病的治療主要是外源性SP-B替代療法，而目前用于治療的SP-B主要來(lái)自于動(dòng)物肺部提取物和基于其結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的類(lèi)似物，但外來(lái)的異源性蛋白會(huì)被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，治療性外源性SP-B的開(kāi)發(fā)和改進(jìn)已成為目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)，只有開(kāi)發(fā)新的制劑才能更好地用于疾病的治療。

雖然當(dāng)前SP-B的研究是個(gè)熱點(diǎn)，但大多數(shù)都集中在對(duì)其功能和生產(chǎn)的研究，而對(duì)于SP-B發(fā)揮其活性的結(jié)構(gòu)特征及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究報(bào)道還比較缺乏，而其結(jié)構(gòu)決定了SP-B的一些作用機(jī)制。

1 肺表面活性蛋白SP-B的合成分泌

SP-B的合成、分泌與表達(dá)具有較為嚴(yán)格的組織細(xì)胞特異性，主要在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯后形成前體蛋白原，再在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工形成含有381個(gè)氨基酸的SP-B前體蛋白(precursor surfactant protein B，proSP-B)，然后進(jìn)入高爾基復(fù)合體經(jīng)糖基化、酶切作用加工處理，最終形成只有79個(gè)氨基酸的成熟SP-B單體。SP-B單體以多囊體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，最后包裝形成板層體，從而作為主要的貯存形式。當(dāng)其需分泌到細(xì)胞外時(shí)，在多囊體中以囊泡出胞的方式進(jìn)入分泌途徑，從而在肺泡氣液界面形成具有降低表面張力的磷脂單分子層膜。另外Clara(終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞)細(xì)胞也能轉(zhuǎn)錄、翻譯形成成熟的SP-B蛋白，但由于其缺乏多囊體，因此不能分泌蛋白進(jìn)入肺泡間隙，發(fā)揮降低氣液界面表面張力的作用。proSP-B的相對(duì)分子質(zhì)量約為42 kDa，具有一個(gè)典型的疏水性氨基酸起始序列NproSP-B，使之能順利通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)孔并進(jìn)入高爾基復(fù)合體進(jìn)行加工處理。成熟的SP-B單體的相對(duì)分子質(zhì)量約為8.7 kDa，兩個(gè)成熟的SP-B分子通過(guò)Cys48鏈間二硫鍵形成同源二聚體，這有利于維持SP-B的穩(wěn)定性，且具有抗酸和抗蛋白降解的作用。SP-B在肺泡II上皮細(xì)胞中的合成、分泌路徑見(jiàn)圖1[7]。

圖1 SP-B在肺泡II上皮細(xì)胞中的合成、分泌路徑

2 SP-B獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征

SP-B蛋白序列中疏水性氨基酸，如亮氨酸、半胱氨酸等，約占50%以上，且呈現(xiàn)周期性排列。在SP-B的疏水性區(qū)域中含有8個(gè)帶正電的和1個(gè)帶負(fù)電的保守性氨基酸殘基。SP-B中存在的7個(gè)半胱氨酸是其形成獨(dú)特結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，其中的6個(gè)通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵連接C8-C77、C11-C71和C35-C46，參與穩(wěn)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)，第7個(gè)半胱氨酸殘基(C48)通過(guò)分子間二硫鍵的形式參與蛋白的共價(jià)二聚體形成，如圖2所示[8-9]，而其獨(dú)特的二硫鍵存在形式促使SP-B形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其空間結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。

圖2 SP-B蛋白二級(jí)空間結(jié)構(gòu)

由于SP-B的疏水性強(qiáng)且難以通過(guò)基因重組技術(shù)生產(chǎn)，故其三維結(jié)構(gòu)仍是不清楚的，而SP-B與鞘脂激活蛋白樣蛋白超家族蛋白(Saposin-like proteins，SAPLIPs)具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，因此基于SAPLIPs結(jié)構(gòu)，理論上可以模擬出SP-B的結(jié)構(gòu)模型[10-11]。Zaltash等[12]基于NK-lysin核磁共振結(jié)構(gòu)模擬了SP-B同源二聚體的結(jié)構(gòu)模型，如圖3所示，兩個(gè)單體通過(guò)Cys48-Cys48’之間二硫鍵共價(jià)連接，且呈對(duì)應(yīng)排列，使Glu51-Arg52’和Arg52-Glu51’之間連接形成互補(bǔ)離子對(duì)，這個(gè)模型使帶電殘基處在同一平面，促進(jìn)了SP-B單體之間和SP-B與磷脂雙分子層的交叉效應(yīng)，增強(qiáng)了SP-B的生理功能。

圖3 疏水性SP-B天然蛋白模擬結(jié)構(gòu)

Parra等[13]研究認(rèn)為SP-B能通過(guò)低聚化的方式參與SP-B與脂質(zhì)的結(jié)合，穩(wěn)定SP-B與脂質(zhì)的相互作用，故SP-B能與磷脂膜牢固地結(jié)合而發(fā)揮表面活性功能。基于NK-lysin的序列特點(diǎn)，SP-B的螺旋結(jié)構(gòu)較多，是第1個(gè)被認(rèn)為具有4個(gè)兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，其中螺旋結(jié)構(gòu)1和4被二硫鍵連接在蛋白結(jié)構(gòu)的第1域中，而螺旋結(jié)構(gòu)2和3在蛋白結(jié)構(gòu)的第2域中，4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)二硫鍵形成類(lèi)似發(fā)卡結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)1和4起到疏水域的開(kāi)關(guān)作用，決定著蛋白的功能[14-15]。根據(jù)序列比對(duì)分析可知，SP-B的多種結(jié)構(gòu)形態(tài)中的一種結(jié)構(gòu)模型類(lèi)似于球形閉合環(huán)狀的鞘脂結(jié)合蛋白B(saposin B)，而其中存在的4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)是SP-B發(fā)揮功能作用必不可少的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，螺旋結(jié)構(gòu)能影響SP-B與膜上的蛋白相互作用，促進(jìn)膜表面活性物質(zhì)的分布[16-17]。此結(jié)構(gòu)模型也被mini-B(MB，由起始SP-B序列和SP-B折疊的8-25和63-78殘基共同構(gòu)成)合成肽結(jié)構(gòu)的分析所證實(shí)，且根據(jù)紅外光譜IR和分子建模及NMR的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析證實(shí)了之前的推測(cè)[18-19]。此外模擬設(shè)計(jì)的SP-B結(jié)構(gòu)模型具有緊密折疊區(qū)域，形成了類(lèi)似于口袋狀的封閉結(jié)構(gòu)，疏水性磷脂質(zhì)進(jìn)入其內(nèi)部并穩(wěn)定存在，從而發(fā)揮蛋白的脂質(zhì)重排功能，進(jìn)一步引起表面張力的改變[12,20]。因此，SP-B構(gòu)象的可變性可能是其表面活性功能的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

Zaltash等認(rèn)為SP-B二聚體不僅能通過(guò)二硫鍵形成螺旋結(jié)構(gòu)，且參與形成反離子對(duì)形式，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是SP-B序列殘基所決定的[12]。無(wú)論體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)斷裂SP-B分子C48分子間二硫鍵均會(huì)影響其表面活性，從而進(jìn)一步證實(shí)了SP-B的表面活性功能與其二聚體的狀態(tài)具有明顯的相關(guān)性[21]。但Zaltash等[22]后來(lái)的研究認(rèn)為C48的存在與否并不是SP-B發(fā)揮其表面活性功能的必要成分，且SP-B蛋白的大部分功能依賴(lài)于其濃度，可能SP-B間還存在其他的作用方式，例如非共價(jià)鍵結(jié)合或離子相互作用力。

3 SP-B與膜脂質(zhì)的相互作用

通過(guò)熒光標(biāo)記的ESR和NMR實(shí)驗(yàn)可知SP-B與膜脂質(zhì)的相互作用是其表面活性功能的主要體現(xiàn)[23-24]。SP-B與膜脂質(zhì)的相互作用是由SP-B中的螺旋結(jié)構(gòu)折疊區(qū)域與磷脂?；ㄟ^(guò)疏水性相互作用連接為基礎(chǔ)的。然而，SP-B與膜脂質(zhì)不同程度的相互作用似乎取決于分子重排及脂蛋白的比例，脂蛋白的脂質(zhì)部分交聯(lián)進(jìn)入SP-B二聚體的核心域，而大量的SP-B二聚體又相互聚集形成一個(gè)類(lèi)似球狀的低聚體，當(dāng)膜上存在較多的脂蛋白時(shí)，SP-B與脂質(zhì)形成脂蛋白復(fù)合物，使得SP-B與脂蛋白重排形成脂蛋白復(fù)合物有機(jī)體[25-26]。另外，通過(guò)對(duì)Zaltash提出的結(jié)構(gòu)模型的分析，發(fā)現(xiàn)極性殘基很可能聚集在SP-B二聚體的外圍，而不是分子疏水性的核心部分，或作為一個(gè)跨膜蛋白存在于液狀DPPC膜上[27]。

Ryan 等[28-29]基于SP-B序列設(shè)計(jì)的短肽的生理活性及其與膜的相互作用的研究表明：SP-B中的幾個(gè)主要片段對(duì)SP-B的結(jié)構(gòu)具有明顯的影響，參與膜上蛋白的定向排列。由于SP-B的N-端位于膜的表面，因此SP-B的N-端被認(rèn)為是降低其表面張力作用的主要區(qū)域，而其中的芳香族殘基更為重要，因?yàn)榉枷阕鍤埢膫?cè)鏈能自發(fā)地與膜的磷脂頭部和?；渽^(qū)域形成牢固的結(jié)合，因此SP-B上的2、4、6位脯氨酸，9位色氨酸的存在對(duì)于SP-B的表面活性作用是必不可少的[30-31]。 另外，SP-B上10～22位殘基帶有正電荷，能通過(guò)靜電相互作用與磷脂陰離子頭部相結(jié)合，從而使得SP-B結(jié)合在磷脂膜的表面而發(fā)揮其表面活性功能[32-33]。蛋白的結(jié)構(gòu)及蛋白-脂質(zhì)的相互作用關(guān)系，決定了SP-B的表面活性功能，且SP-B的螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于膜的融合和重排均有一定的促進(jìn)作用，SP-B中26-37氨基酸殘基是SP-B融合功能的最主要區(qū)段，其可能是通過(guò)膜交聯(lián)的介導(dǎo)作用促進(jìn)蛋白-蛋白的相互作用[29]。此外，SP-B單體間通過(guò)半胱氨酸形成的二硫鍵連接形成二聚體，從而進(jìn)一步形成低聚體，發(fā)揮其功能作用[34-35]。另外，SP-B的C-端主要是43-79殘基，似乎也是蛋白參與膜融合和重排的重要組成部分，也可以降低表面張力，只是其活性并沒(méi)有SP-B的N-端高[28,36]。

SP-B的C-和N-端具有明顯的兩親性。在SP-B 的4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域中，兩親性中的親水性部分鑲嵌在膜的表面，疏水性部分通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定在核心域,SP-B序列與鞘脂結(jié)合蛋白序列高度同源，且其二硫鍵結(jié)合方式是高保真區(qū)域。SD和IR實(shí)驗(yàn)表明：SP-B模擬肽和鞘脂結(jié)合蛋白同樣具有高含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)[37-38]。此外，SP-B能影響鞘脂結(jié)合蛋白與膜脂質(zhì)雙分子層的關(guān)聯(lián)，在其開(kāi)環(huán)狀態(tài)下，SP-B螺旋結(jié)構(gòu)的疏水性部分與磷脂的側(cè)鏈結(jié)合，插入磷脂分子層的內(nèi)部，帶正電的和電中性的殘基與極性脂質(zhì)頭部相結(jié)合[39-40]。IR結(jié)果表明：SP-B的螺旋結(jié)構(gòu)部分與膜相互平行，SP-B疏水性部分則插入磷脂雙分子層內(nèi)部，此結(jié)構(gòu)對(duì)SP-B發(fā)揮功能作用具有重要意義[26,41]。SP-B通過(guò)疏水性區(qū)域形成一個(gè)凹行中心腔域，并與極性帶電殘基形成的凸形域相適配，N端作用于特異性的結(jié)合脂質(zhì)分子層[42-43]。

4 SP-B的表面活性功能作用機(jī)制

SP-B的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是其發(fā)揮功能作用的關(guān)鍵，SP-B與膜脂質(zhì)的相互作用及其肺表面活性作用均依賴(lài)SP-B的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，且其作用模式具有一定的規(guī)律性。對(duì)于疏水性SP-B蛋白，其表面活性功能的規(guī)律即其作用機(jī)制如圖4[44-45]所示。SP-B單體通過(guò)分子間的相互作用聚集形成二聚體，大量的二聚體聚合一起形成寡聚體，多個(gè)寡聚體聚集形成一個(gè)疏水性部分在里，親水性部分在外的開(kāi)放低聚體結(jié)構(gòu)域，再與膜脂質(zhì)通過(guò)疏水性互相作用形成一個(gè)整體，形成膜嵌和結(jié)構(gòu)，膜脂質(zhì)分子隱藏在其疏水性部分中，使得SP-B與膜磷脂上的?；溝嗷プ饔眯纬捎袡C(jī)整體[46-49]。由于磷脂膜的流動(dòng)性，一部分低聚體攜帶磷脂從磷脂膜上獨(dú)立出來(lái)，游離于水環(huán)境下，由于氣液界面的表面張力作用，在液體環(huán)境下游離的脂質(zhì)通過(guò)表面吸附作用從低聚體中分離出來(lái)分布于氣液界面上從而降低表面張力，而二聚體則繼續(xù)參與下一次的轉(zhuǎn)運(yùn)工作。至此，SP-B完成了1個(gè)循環(huán)，從而發(fā)揮了其降低氣液界面表面張力的作用。SP-B分子中的堿性氨基酸殘基與磷脂負(fù)離子相互作用，促進(jìn)磷脂形成單分子層膜，增強(qiáng)磷脂膜的表面活性，且使磷脂單分子層穩(wěn)定存在于肺泡表面，從而維持肺泡的正常生理功能。

圖4 SP-B的作用機(jī)制

SP-B與膜脂質(zhì)相互作用的形式是依靠疏水相互作用使得SP-B的N-和C-端的螺旋疏水性結(jié)構(gòu)與蛋白中的氨基酸殘基側(cè)鏈相互作用，SP-B再與脂質(zhì)囊泡融合，促進(jìn)與膜的結(jié)合。SP-B的N-端帶有正電性，能與帶負(fù)電的脂質(zhì)結(jié)合，維持表面張力，支撐表面界面的延展[50]。由SP-B的C-和N-直接相連組成的MB具有比SP-B更強(qiáng)的功能，其能直接形成二聚體形式，而SP-B的C-和N-是SP-B與脂質(zhì)作用的主要作用位點(diǎn)，且MB能折疊形成螺旋發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并通過(guò)二硫鍵的連接穩(wěn)定存在[51-52]。此外，MB模擬肽在體外活性研究認(rèn)為：其降低表面張力的作用極強(qiáng)，表面張力幾乎為零；而體內(nèi)研究表明：MB還能抵抗磷脂酶A的降解作用[19]。Frans等[53]認(rèn)為，MB的立體結(jié)構(gòu)中含有α螺旋和β折疊，并有大量環(huán)狀結(jié)構(gòu),而MB的N端是其發(fā)揮功能作用的主要部分，此外，N端還維持其二聚體狀態(tài)，N端形成的β折疊能促進(jìn)二聚體的自連，通過(guò)疏水性側(cè)鏈的非特異性作用力聚合。

5 結(jié)束語(yǔ)

SP-B屬于SAPLIPs家族成員，具有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，特別是其周期性的疏水性氨基酸排列和兩親性螺旋結(jié)構(gòu)可形成高穩(wěn)定性的α螺旋結(jié)構(gòu)，這些都是其發(fā)揮功能作用必不可少的基礎(chǔ)。而且，SP-B與膜脂質(zhì)形成一個(gè)有機(jī)整體，參與膜脂質(zhì)層重排，影響磷脂雙分子層的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能活性。因此，可基于SP-B的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和其膜相容性，設(shè)計(jì)出基于類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)，為SP-B的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和肺損傷的治療提供理論基礎(chǔ)。

雖然目前的研究認(rèn)為肺損傷的機(jī)制是多種多樣的，與呼吸系統(tǒng)發(fā)育和其他疾病導(dǎo)致的繼發(fā)性病理等有關(guān)，而并不只與肺表面活性蛋白相關(guān)，但肺表面活性蛋白無(wú)疑是其中一個(gè)十分重要的因素，SP-B作為肺表面活性蛋白中最為重要的一種，對(duì)其的研究是十分必要的。目前對(duì)SP-B的結(jié)構(gòu)功能研究均基于正常生理狀態(tài)下，但在病理狀態(tài)下(如急性呼吸窘迫癥)，SP-B的結(jié)構(gòu)變化及構(gòu)效關(guān)系目前仍是不清楚的，SP-B的作用機(jī)制受病理狀態(tài)的影響也不清楚，且SP-B的治療作用是如何發(fā)揮作用及相應(yīng)的構(gòu)象變化都是不清楚的，因此弄清這些問(wèn)題將能更好地設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)利用SP-B。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Research Progress in Structural-Function Relationship of Pulmonary Surfactant Protein B

LIU Qin1，GU Shi-ling1，TANG Xiao-lian1，WANG Wan-neng1，ZHOU Ji-hong2

(1.College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China; 2.Department Four, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)

Pulmonary surfactant is a type of phospholipoprotein complex distributed in the alveolar lining. Because of its amphiphilic, phospholipids can interact with specific proteins in the pulmonary surfactant and form monolayer of phospholipids in the alveoli, and exerting the effect of decreasing the surface tension of the gas-liquid interface. Surfactant protein B (SP-B) is the most important specific protein of pulmonary surfactant protein, and its abnormalities often cause lung diseases, so it plays an irreplaceable role in the maintenance and repair of lung function. The structure of SP-B is similar to that of amoebapore protein superfamily, and belongs to superfamily protein of saposin-like protein (SAPLIPs). In this paper, the lipid-protein interaction and the structural-function relationship of SP-B were analyzed to provide theoretical support for analogue-based drug development.

pulmonary surfactant B; structure; structural-function relationship; lipid-protein interactions

2017-02-18 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81471865)

劉欽(1990—)，男，碩士研究生，主要從事基因工程藥物研究，E-mail:1950028911@qq.com。

劉欽，顧仕苓，唐曉蓮，等.肺表面活性蛋白B的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2017(5):91-98.

format：LIU Qin，GU Shi-ling，TANG Xiao-lian,et al.Research Progress in Structural-Function Relationship of Pulmonary Surfactant Protein B[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(5):91-98.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.05.016

R914

A

1674-8425(2017)05-0091-08