Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感大鼠內(nèi)臟敏感性影響機(jī)制的研究

古巧燕，史盛梅，張 軍，年媛媛，馮義朝

1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，陜西 延安 716000； 2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

?

Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感大鼠內(nèi)臟敏感性影響機(jī)制的研究

古巧燕1，史盛梅1，張 軍2，年媛媛2，馮義朝1

1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，陜西 延安 716000； 2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 研究Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感大鼠血液、腦腸軸組織5-HT表達(dá)的影響，探討Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感大鼠內(nèi)臟敏感性影響的機(jī)制，為進(jìn)一步明確內(nèi)臟高敏感形成機(jī)制的研究提供思路。方法 將新生2 d齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為健康對照組和模型組，模型組大鼠通過母嬰分離和醋酸灌腸相結(jié)合的方法制備內(nèi)臟高敏感大鼠模型。模型驗證成功后，模型組分為干預(yù)對照組、低濃度干預(yù)組、中濃度干預(yù)組和高濃度干預(yù)組，應(yīng)用IHC、ELISA、Western blotting方法檢測內(nèi)臟高敏感模型大鼠血液、腦腸軸不同部位5-HT的表達(dá)，對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 (1)不同分組大鼠血清5-HT水平的ELISA檢測結(jié)果：健康對照組、干預(yù)對照組大鼠分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，大鼠血清5-HT水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)不同分組大鼠腦腸軸組織5-HT表達(dá)IHC檢測結(jié)果：健康對照組、干預(yù)對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Nesfatin-1不同濃度組大鼠腦腸軸5-HT陽性表達(dá)明顯高于健康對照組、干預(yù)對照組。(3)不同分組大鼠腦腸軸組織5-HT表達(dá)Western blotting檢測結(jié)果：健康對照組、干預(yù)對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Nesfatin-1通過中樞途徑干預(yù)內(nèi)臟高敏感大鼠，發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1可以上調(diào)內(nèi)臟高敏感大鼠血液、腦腸軸不同部位5-HT水平，推測Nesfatin-1可能通過上調(diào)5-HT的水平影響中樞和外周5-HT信號通路，最終參與內(nèi)臟高敏感的形成及調(diào)控。

Nesfatin-1；內(nèi)臟敏感性； 大鼠

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種最常見的功能性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或間歇加重的腹痛、腹脹、腹瀉、便秘等腸道功能紊亂的癥狀，同時又缺乏腸道生化學(xué)和形態(tài)學(xué)改變[1-2]。2006年首次發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1[3]，它是一種新型的腦腸肽，參與機(jī)體攝食活動、體溫調(diào)控、意識活動、消化液分泌等多種復(fù)雜的生理病理活動[4-9]，我們前期研究[10]顯示,Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感模型大鼠的內(nèi)臟敏感性、結(jié)腸運動有影響，基于此，本研究通過建立內(nèi)臟高敏感性大鼠模型，給予中樞途徑Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感性大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察干預(yù)后內(nèi)臟高敏感性大鼠血液、腦腸軸組織5-HT水平的變化，探討Nesfatin-1影響內(nèi)臟高敏感大鼠內(nèi)臟敏感性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Nesfatin-1(上海吉爾生化有限公司，批號：P140508-SL262333)；大鼠5-HT ELISA檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，貨號：CEA808Ge；批號：L140908201)；羊抗兔二抗(英國Abcam公司，批號：GR101082-1)，工作濃度為1∶500。

1.2 實驗動物分組及藥物干預(yù) 選取實驗大鼠40只，其中內(nèi)臟高敏感模型大鼠32只，健康大鼠8只，模型組大鼠通過母嬰分離醋酸灌腸相結(jié)合的方法制備內(nèi)臟高敏感大鼠模型。模型大鼠隨機(jī)分為4組：干預(yù)對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，每組8只大鼠；各組大鼠具體處理措施如下：健康對照組：大鼠不給予任何處理；干預(yù)對照組：大鼠給予側(cè)腦室注射生理鹽水0.5 μl 0.9%氯化鈉；低濃度組：大鼠給予側(cè)腦室注射0.5 μl 0.5 μmol/L的Nesfatin-1；中濃度組：大鼠給予側(cè)腦室注射0.5 μl 5 μmol/L的Nesfatin-1；高濃度組：大鼠給予側(cè)腦室注射0.5 μl 50 μmol/L的Nesfatin-1。

1.3 ELISA檢測 取實驗大鼠靜脈血2 ml，分離血漿，進(jìn)行5-HT檢測。

1.4 Western blotting檢測 不同分組大鼠腦腸軸不同組織進(jìn)行處理后，進(jìn)行5-HT檢測。

1.5 制作切片及免疫組化檢測 實驗結(jié)束后處死大

鼠，結(jié)腸組織取材部位為降結(jié)腸，脊髓組織取材部位為腰骶段、脊髓背角、胸腰段，腦組織取材部位為大腦皮質(zhì)、海馬、中縫核，組織制片后應(yīng)用免疫組化方法檢測5-HT表達(dá)。采用半定量法分析染色結(jié)果：按照染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比乘積進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠血清5-HT水平的ELISA檢測結(jié)果 健康對照組、干預(yù)對照組大鼠分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，大鼠血清5-HT水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組別只數(shù)5?HT健康對照組871．12±3．73干預(yù)對照組893．11±21．63#低濃度組8118．25±19．93##?中濃度組8146．14±22．64##??高濃度組8163．34±14．08##??

注：與健康對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與干預(yù)對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 實驗大鼠腦腸軸組織5-HT表達(dá)的IHC檢測結(jié)果 健康對照組、干預(yù)對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Nesfatin-1不同濃度組大鼠腦腸軸5-HT陽性表達(dá)明顯高于健康對照組和干預(yù)對照組，且腦組織中5-HT陽性表達(dá)最顯著(見表2、圖1～3)。

2.3 實驗大鼠腦腸軸組織5-HT表達(dá)的Western blotting檢測結(jié)果 健康對照組、干預(yù)對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖4～6)。

組別只數(shù)結(jié)腸脊髓腦健康對照組82．96±0．912．50±0．783．88±1．39干預(yù)對照組83．58±1．21#2．96±0．75#4．92±1．25##低濃度組85．92±1．47##??3．63±1．09##?6．33±1．37##?中濃度組86．33±1．37##??4．29±1．19##??8．08±1．18##??高濃度組88．08±1．18##??5．96±1．19##??9．42±1．95##??

注：與健康對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與干預(yù)對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 不同分組大鼠結(jié)腸組織5-HT陽性表達(dá)(200×) A～B: 健康對照組； C～D： 干預(yù)對照組； E～F： 低濃度組； G～H： 中濃度組； I～J： 高濃度組

Fig 1 Expressions of 5-HT in colon in different groups (200×) A-B: healthy control group; C-D: intervention control group; E-F: low concentration intervention group; G-H: medium concentration intervention group; I-J: high concentration intervention group

圖2 不同分組大鼠脊髓組織5-HT陽性表達(dá)(200×) A～B: 健康對照組； C～D： 干預(yù)對照組； E～F： 低濃度組； G～H： 中濃度組； I～J： 高濃度組

Fig 2 Expressions of 5-HT in spinal cord in different groups (200×) A-B: healthy control group; C-D: intervention control group; E-F: low concentration intervention group; G-H: medium concentration intervention group; I-J: high concentration intervention group

圖3 不同分組大鼠腦組織5-HT陽性表達(dá)(200×) A～B: 健康對照組； C～D： 干預(yù)對照組； E～F： 低濃度組； G～H： 中濃度組； I～J： 高濃度組

Fig 3 Expressions of 5-HT in brain in different groups (200×) A-B: healthy control group; C-D: intervention control group; E-F: low concentration intervention group; G-H: medium concentration intervention group; I-J: high concentration intervention group

組別只數(shù)結(jié)腸脊髓腦健康對照組80．31±0．000．52±0．030．59±0．08干預(yù)對照組80．36±0．02#0．60±0．09#0．71±0．12#低濃度組80．45±0．12##?0．69±0．01##?0．81±0．08##?中濃度組80．52±0．00##??0．72±0．01##?0．93±0．04##??高濃度組60．64±0．06##??0．97±0．09##??1．17±0．04##??

注：與健康對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與干預(yù)對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖4 不同分組大鼠結(jié)腸組織5-HT表達(dá)情況;圖5 不同分組大鼠脊髓組織5-HT表達(dá)情況;圖6 不同分組大鼠腦組織5-HT表達(dá)情況

Fig 4 Expressions of 5-HT in colon in different groups; Fig 5 Expressions of 5-HT in spinal cord in different groups; Fig 6 Expressions of 5-HT in brain in different groups

3 討論

內(nèi)臟高敏感是IBS的重要機(jī)制，但是其具體的形成機(jī)制仍不明確，本研究前期發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1可以增加內(nèi)臟高敏感模型大鼠的內(nèi)臟敏感性和影響模型大鼠結(jié)腸快波、慢波、收縮波，提示Nesfatin-1與內(nèi)臟敏感性有關(guān)[10]，可能參與IBS內(nèi)臟高敏感的形成，我們?nèi)孕枰M(jìn)一步思考研究，Nesfatin-1對IBS內(nèi)臟高敏感形成中的具體作用機(jī)制如何，怎樣通過干預(yù)Nesfatin-1可以有效調(diào)控內(nèi)臟敏感性，進(jìn)而控制IBS呢？

5-HT是一種重要的腦腸肽物質(zhì)，參與機(jī)體復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)控，通過激活相應(yīng)的受體來調(diào)節(jié)腸道動力和腸道敏感性，同時在內(nèi)臟敏感性疼痛產(chǎn)生、調(diào)控、傳遞、情緒調(diào)控及睡眠等生理病理活動中起著正反調(diào)控的重要作用；IBS患者體內(nèi)血清、腸黏膜組織中5-HT水平有不同程度升高，眾多研究從不同角度證實了5-HT信號通路與IBS的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[11-14]，5-HT曾被認(rèn)為是內(nèi)臟高敏感形成的啟動因子，5-HT合成、釋放、與相應(yīng)受體結(jié)合及重攝取等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中任何環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致胃腸道動力、分泌功能異常和內(nèi)臟敏感性的變化，目前，許多5-HT受體及相關(guān)制劑已經(jīng)很廣泛地應(yīng)用到IBS的臨床治療和基礎(chǔ)研究。

一方面，我們基于前期研究結(jié)果即Nesfatin-1與內(nèi)臟高敏感模型大鼠內(nèi)臟敏感性及結(jié)腸動力有關(guān)；另一方面，基于許多研究結(jié)果顯示的Nesfatin-1、5-HT與內(nèi)臟高敏感的相關(guān)性及三者之間各種復(fù)雜關(guān)系，我們這部分研究通過Nesfatin-1中樞途徑干預(yù)模型大鼠后，應(yīng)用ELISA、IHC、Western blotting檢測方法，檢測內(nèi)臟高敏感模型大鼠腦腸軸不同部位5-HT陽性表達(dá)情況，進(jìn)一步探討Nesfatin-1參與內(nèi)臟高敏感形成的可能機(jī)制。本實驗研究首先應(yīng)用ELISA方法檢測各組大鼠血清中5-HT水平，健康對照組和干預(yù)對照組分別與不同濃度組大鼠進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。其次應(yīng)用IHC方法檢測不同實驗分組大鼠腦腸軸不同部位組織5-HT陽性的表達(dá)情況，健康對照組、干預(yù)對照組分別與不同濃度組比較，結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，Nesfatin-1不同濃度組大鼠在結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織三個部位的表達(dá)均高于健康對照組、干預(yù)對照組。最后，應(yīng)用Western blotting方法檢測實驗大鼠腦腸軸不同部位組織5-HT表達(dá)情況，健康對照組和干預(yù)對照組分別與不同濃度組比較，結(jié)腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達(dá)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。由上可見，三種不同的檢測方法從不同的角度對比健康對照組、干預(yù)對照組與不同濃度組大鼠腦腸軸不同部位的5-HT表達(dá)的差異，結(jié)果均提示Nesfatin-1可以上調(diào)模型大鼠外周及中樞5-HT水平，不同方法的差異性不完全一致，有必要調(diào)整實驗條件進(jìn)一步深入研究。

總之，Nesfatin-1能夠通過中樞途徑增加內(nèi)臟高敏感模型大鼠的內(nèi)臟敏感性，改變內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸電生理指標(biāo)，上調(diào)模型大鼠外周及中樞不同部位5-HT表達(dá)，高表達(dá)的5-HT可以作用于胃腸道5-HT受體，激活多種活性生物物質(zhì)釋放，調(diào)控胃腸道運動和分泌功能，并將這種影響傳至中樞，同時高表達(dá)的5-HT還參與中樞對下行神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控；由此推測在內(nèi)臟高敏感大鼠模型中Nesfatin-1可能通過上調(diào)5-HT的表達(dá)水平，進(jìn)而影響中樞和外周5-HT信號通路，導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感模型大鼠的內(nèi)臟敏感性增加，從而參與IBS內(nèi)臟高敏感的形成及調(diào)控，可見Nesfatin-1的參與有可能是形成內(nèi)臟高敏感的一個重要機(jī)制，而且Nesfatin-1參與內(nèi)臟高敏感形成的機(jī)制是多靶點、多通路的，但是關(guān)于Nesfatin-1與IBS之間的研究剛剛開始，尤其是其與內(nèi)臟高敏感的關(guān)系，故還需要進(jìn)一步深入探討Nesfatin-1在內(nèi)臟高敏感形成中的具體作用及影響5-HT信號通路的具體機(jī)制。深入研究這些可以為未來明確IBS發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步闡明內(nèi)臟高敏感機(jī)制及有效控制內(nèi)臟高敏感，提高IBS的治療效果和預(yù)后提供新思路。

[1]Camilleri M, Lasch K, Zhou W. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. The confluence of increased permeability, inflammation, and pain in irritable bowel syndrome [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012, 303(7): G775-G785.

[2]Drossman DA. The functional gastrointestinal disorders and the Rome Ⅲ process [J]. Gastroenterology, 2006, 130(5): 1377-1390.

[3]Oh-I S, Shimizu H, Satoh T, et al. Identification of nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus [J]. Nature, 2006, 443(7112): 709-712.

[4]Shimizu H, Osaki A. Nesfatin/Nucleobindin-2 (NUCB2) and glucose homeostasis [J]. Curr Hypertens Rev, 2014, [Epub ahead of print].

[5]Hatef A, Shajan S, Unniappan S. Nutrient status modulates the expression of nesfatin-1 encoding nucleobindin 2A and 2B mRNAs in zebrafish gut, liver and brain [J]. Gen Comp Endocrinol, 2015, 215: 51-60.

[6]Xu L, Wang Q, Guo F, et al. Nesfatin-1 signaling in the basom edial amygdala modulates the gastric distension-sensitive neurons discharge and decreases gastric motility via melanocortin 3/4 receptors and modified by the arcuate nucleus [J]. Eur J Pharmacol, 2015, 764: 164-172.

[7]Masuo K. Nesfatin-1 could be a strong candidate obesity or diabetes medication, if blood pressure elevation can be controlled [J]. Hypertens Res, 2014, 37(2): 98-99.

[8]Watanabe A, Mochiki E, Kimura A, et al. Nesfatin-1 suppresses gastric contractions and inhibits interdigestive migrating contractions in conscious dogs [J]. Dig Dis Sci, 2015, 60(6): 1595-1602.

[9]Kim J, Chung Y, Kim H, et al. The tissue distribution of nesfatin-1/nucb2 in mouse [J]. Dev Reprod, 2014, 18(4): 301-309.

[10]古巧燕, 張軍, 年媛媛, 等. Nesfatin-1對內(nèi)臟高敏感性大鼠內(nèi)臟敏感性和結(jié)腸動力的影響[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 15(4): 458-462. GU QY, Zhang J, Nian YY, et al. The effect of Nesfatin-1 on visceral sensitivity and colonic motility of visceral sensitivity rats [J]. Journal of Tropical Medicine, 2015, 15(4): 458-462.

[11]D’Amato M. Genes and functional GI disorders: from casual to causal relationship [J]. Neurogastroenterol Motil, 2013, 25(8): 638-649.

[12]Mayer EA, Gupta A, Kilpatrick LA, et al. Imaging brain mechanisms in chronic visceral pain [J]. Pain, 2015, 156 Suppl 1: S50-S63.

[13]Elsenbruch S. Abdominal pain in irritable bowel syndrome: a review of putative psychological, neural and neuro-immune mechanisms [J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(3): 386-394.

[14]Al Omran Y, Aziz Q. Functional brain imaging in gastroenterology: to new beginnings [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014, 11(9): 565-576.

(責(zé)任編輯：王全楚)

The effect of Nesfatin-1 on visceral sensitivity in visceral hypersensitivity rats

GU Qiaoyan1, SHI Shengmei1, ZHANG Jun2, NIAN Yuanyuan2, FENG Yichao1

1.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Yan’an University, Yan’an 716000; 2.Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, China

Objective To study the effect of Nesfatin-1 on 5-HT expression and the mechanism of Nesfatin-1 on visceral sensitivity in visceral hypersensitivity rats, in order to provide the new ideas for clarifying the mechanism visceral hypersensitivity.Methods Two days male Spragne-Dawley rats were divided randomly into healthy control group and model group. The model group was induced to visceral hypersensitivity by maternal separation and acetic acid enema methods. After the model validation succeeded, the rats in model group were divided randomly into intervention control group, low concentration intervention group, medium concentration intervention group and high concentration intervention group. The expressions of 5-HT in blood and the brain gut axis were tested by immunohistochemistry (IHC), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting methods, then the results were analyzed by statistical method.Results (1) The ELISA blood test results of 5-HT in different groups: compered with the healthy control group and the intervention control group respectively, the expression of serum 5-HT in the different concentration groups had statistical difference (P<0.05). (2) The IHC test results of 5-HT expression in different groups: the positive expression of 5-HT in the healthy control group and the intervention control group had statistical difference compared with the different concentration groups (P<0.05), the positive expression of 5-HT was significantly higher in different concentration groups than that in the healthy control group and the intervention control group. (3) The Western blotting test results of 5-HT expression in different groups: compared with the healthy control group and the intervention control group respectively, the expression of 5-HT in the different parts of the brain gut axis in different concentration groups had statistical difference (P<0.05).Conclusion The different concentrations of Nesfatin-1 interven the visceral hypersensitivity rats by the central route, Nesfatin-1 can up-regulate the level of 5-HT in the blood and the brain gut axis of model rats; Nesfatin-1 may affect 5-HT signaling pathways in the central and peripheral parts by increasing the level of 5-HT,finally involves in the formation and the regulation of visceral hypersensitivity.

Nesfatin-1; Visceral sensitivity; Rat

古巧燕，博士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：各種肝病、胃腸動力疾病的診斷與治療。E-mail：guyewuyue@163.com

張軍，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：胃腸動力及食管疾病的診治。E-mail：jun3z@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.06.020

R574.4

A

1006-5709(2017)06-0704-05

2016-12-27