河南地區(qū)三黃雞ALV感染的血清學調(diào)查

張桂枝，靳雙星，姬向波

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物科技學院，河南鄭州450046)

河南地區(qū)三黃雞ALV感染的血清學調(diào)查

張桂枝，靳雙星，姬向波

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物科技學院，河南鄭州450046)

采取河南省3個三黃種雞場種雞的泄殖腔棉拭子和蛋清樣本，利用ELISA檢測ALV-p27；檢測血清中ALV-J、ALV-A/B兩種抗體，同時采集其血液接種DF-1細胞，培養(yǎng)9 d后檢測細胞培養(yǎng)液中ALV-p27。結(jié)果表明：3個種雞場泄殖腔棉拭子抗原陽性率分別為12.36%、8.15%和24.28%；蛋清抗原陽性率分別為7.17%、5.09%和14.44%；ALV-A/B抗體陽性率分別為11.96%、6.52%、33.70%；ALV-J抗體陽性率分別為3.26%、2.17%、22.83%；DF-1細胞培養(yǎng)液中ALV-p27陽性率分別為8.57%、6.67%、18.52%。試驗結(jié)果為下一階段各雞場開展凈化工作提供了科學依據(jù)。

三黃雞 ； 禽白血病 ； p27抗原 ； 血清抗體

禽白血病病毒 (ALV)是一種主要通過種雞傳播的致腫瘤性病毒。早期A、B亞群ALV是引起雞群淋巴性白血病和各類型腫瘤的主要亞群，后來又出現(xiàn)致病性更強的J亞群ALV。我國于1999在商品肉雞中分離檢測到ALV-J，由于前幾年一直未采取全面的禽白血病凈化措施，迄今許多地區(qū)蛋雞、肉雞以及地方品種雞群中ALV感染仍較普遍[1-8]。為了解河南地區(qū)三黃雞ALV的感染情況，選取河南省2個不同地區(qū)及1個疑似禽白血病感染的種雞場三黃雞為研究對象，利用酶聯(lián)免疫吸收試驗(ELISA)檢測泄殖腔棉拭子、蛋清ALV-p27抗原；抽取部分雞的血清檢測ALV-J和ALV-A/B兩種抗體；同時抽取部分雞的血液接種DF-1細胞，培養(yǎng)9 d后取細胞上清液檢測ALV-p27，以判斷雞群外源性ALV的感染情況，為實施該地區(qū)三黃雞的凈化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 20～25周齡，3個種雞場1 380只三黃雞。

1.2 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)；NIKON ECLIPSE TS100型倒置顯微鏡，HFsafe-1200生物安全柜，酶標儀(Thermo公司)；微量加樣器等。

1.3 主要試劑 ALV-p27抗原檢測試劑盒，購自BioChek公司；ALV-A/B 和 ALV-J 抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司；DMEM培養(yǎng)液，購自GIBCO公司；新生牛血清，購自GIBCO公司,以及胰酶等。

1.4 細胞 DF-1細胞(河南農(nóng)業(yè)大學保存)。

1.5 方法

1.5.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測 采樣前在樣品管中加入1 mL樣品稀釋液，無菌棉簽采集試驗雞泄殖腔棉拭子，與稀釋液混勻后冷凍。反復(fù)凍融2次，檢測前將樣品恢復(fù)至25 ℃，吸取100 μL上清液，加入到ELISA反應(yīng)板中，按照ELISA試劑盒的操作說明書進行操作。以405 nm的波長于酶標儀測定對照和樣品的吸光度，通過計算檢測樣品與陽性對照比值(S/P)進行樣品的陰、陽性判定。

1.5.2 種蛋ALV-p27抗原的檢測 收集試驗雞的種蛋，每枚種蛋取1 mL蛋清反復(fù)凍融2次后，檢測前將樣品恢復(fù)至25 ℃，吸取100 μL蛋清液,加入到ELISA反應(yīng)板中，按照ELISA試劑盒的操作說明書進行操作。

1.5.3 血清ALV特異性抗體的檢測 采集試驗雞促凝血，4 000 r/min離心10 min分離血清，用稀釋液將血清作1∶500稀釋，然后用禽白血病抗體檢測試劑盒檢測ALV-J亞型及ALV-A/B亞型2種抗體，具體檢測方法參見試劑盒說明書。

1.5.4 DF-1細胞培養(yǎng)液ALV-p27的檢測 無菌采集試驗雞抗凝血，接種于已長成單層的DF-1細胞，37 ℃ 繼續(xù)孵育2 h，棄上清液，更換為含有1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 d。然后冷凍，反復(fù)凍融2次后，取細胞培養(yǎng)液用ELISA試劑盒檢測ALV-p27抗原。

2 結(jié)果與分析

2.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測結(jié)果 ELISA檢測泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原結(jié)果顯示，3個種雞場抗原陽性率均較高，但不同場之間有很大差異，其中疑似ALV感染的C場抗原陽性率最高。A、B、C場泄殖腔棉拭子抗原陽性率分別為12.36%(91/736)、8.15%(30/368)和24.28%(67/276)，檢測結(jié)果見表1。

表1 泄殖腔棉拭子ALV-p27檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.2 蛋清ALV-p27抗原檢測結(jié)果 ELISA檢測蛋清ALV-p27抗原結(jié)果顯示，3個種雞場蛋清樣品中都檢測出抗原陽性個體，其中疑似ALV感染的C場抗原陽性率最高。A、B、C場蛋清抗原陽性率分別為7.17%(33/460)、5.09%(14/275)和14.44%(26/180)，檢測結(jié)果見表2。

表2 蛋清ALV-p27檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.3 血清ALV-A/B和ALV-J抗體檢測結(jié)果 ELISA檢測ALV-A/B和ALV-J兩種抗體結(jié)果顯示，3個種雞場血清樣品中都檢測出ALV-A/B和ALV-J陽性抗體，其中ALV-A/B抗體陽性率均高于ALV-J陽性抗體率。A、B、C場ALV-A/B抗體陽性率分別為11.96%(11/92)、6.52%(6/92)、33.70%(31/92)；A、B、C場ALV-J抗體陽性率分別為3.26%(3/92)、2.17%(2/92)、22.83%(21/92。檢測結(jié)果見表3、表4。

表3 血清ALV-A/B抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計

表4 血清ALV-J抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.4 DF-1細胞培養(yǎng)液中ALV-p27抗原檢測結(jié)果 DF-1細胞培養(yǎng)9 d的上清液用ELISA試劑盒檢測ALV-p27抗原結(jié)果顯示，3個種雞場血液樣品中都檢測出抗原陽性個體，A、B、C三個種雞場抗原陽性率分別為8.57%(3/35)、6.67%(2/30)和18.52%(5/27)，檢測結(jié)果見表5。

表5 DF-1細胞培養(yǎng)液中ALV-p27抗原檢測結(jié)果統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

p27抗原是ALV-亞群共有的主要抗原蛋白，因此,在ALV的檢測和凈化工作中廣泛采用ELISA方法檢測ALV-p27。本試驗采用泄殖腔棉拭子、蛋清及DF-1細胞培養(yǎng)液等多種檢測材料檢測ALV-p27，提高了抗原檢出率。通過研究發(fā)現(xiàn)，3個三黃雞場都不同程度的感染了禽白血病病毒。疑似ALV感染的C場，泄殖腔棉拭子、蛋清及DF-1細胞培養(yǎng)液中ALV-p27抗原陽性率均顯著高于A、B場；ALV-A/B和ALV-J抗體陽性率也顯著高于A、B雞場，說明不同的雞場ALV感染程度有很大差異。另外，從檢測結(jié)果來看，3個雞場都同時存在ALV-A/B抗體陽性個體和ALV-J抗體陽性個體，但均是ALV-A/B抗體陽性率高于ALV-J抗體陽性率，說明3個雞場都存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種外源性病毒同時感染的可能，但A/B亞群的感染率高于J亞群。對檢測結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)雞群中存在無病毒有抗體(V-A+)、有病毒無抗體(V+A-)和有病毒有抗體(V+ A+)個體，說明本地區(qū)ALV 感染的非常復(fù)雜。血清型 V+A-的母雞以不同但較高比例向其子代垂直傳播；血清型V-A+存在，說明雞群中存在間歇排毒雞只。所以在凈化過程中需要進行多次檢測並進行淘汰。

喬新永等[6]從三黃雞臨床多發(fā)性腫瘤病例中分離出J亞群禽白血病病毒，王培坤等[7]從三黃雞臨床血管瘤病例中分離出AJ亞群禽白血病病毒；張勝斌[11]對廣西地區(qū)三黃雞禽白血病進行調(diào)查，結(jié)果表明，廣西ALV 感染在三黃雞品系內(nèi)普遍存在，有的場ALV-A/B抗體陽性率高于ALV-J，有的場ALV-J抗體陽性率高于ALV-A/B，有的場2種抗體陽性率接近；本調(diào)查結(jié)果表明，河南3個三黃雞場ALV-A/B抗體陽性率都高于ALV-J抗體陽性率。以上檢查結(jié)果說明，我國的三黃雞有相當比例雞場存在ALV 感染，但不同雞場ALV 感染亞型有差異。因此，各地方品種雞場應(yīng)根據(jù)ALV感染動態(tài)、公司規(guī)模和發(fā)展實力，制定切實可行的凈化措施和凈化方案，盡量減少ALV感染率，減少對后代的垂直傳播，以保護我國優(yōu)良的地方品種。

[1] 孫淼,李金彩,郭振華,等.J亞型禽白血病病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(10)：46-48.

[2] 常維山,郭慧君,孫淑紅.近年來我國禽白血病流行現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢分析[J].中國家禽，2010，32(1):8-10.

[3] 張洪海,劉青,邱波,等.地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J.畜牧獸醫(yī)學報,2009,40(8):1215-1221.

[4] 王波,李清源,劉紹瓊,等.皖南黃肉種雞種蛋中禽白血病病毒的感染狀態(tài)檢測[J].畜牧獸醫(yī)學報,2011,42(2):224-227.

[5] 高玉龍,邵華斌,羅青平,等.2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2010，32(1):32-35.

[6] 喬新永,張維宜，鞠厚斌,等.三黃雞臨床多發(fā)性腫瘤相關(guān)的亞群禽白血病病毒的分離鑒定及其病理學觀察[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2011，33(2):1-4.

[7] 王培坤,畢玉彧,秦麗莉,等.三黃雞臨床血管瘤病例中分離出A亞群與J亞群禽白血病病毒[J].動物醫(yī)學進展，2015,36(3):13-16.

[8] 張勝斌,吳天威,吳丹,等.廣西三黃雞禽白血病流行病學的調(diào)查[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2010，26(1):12-14.

2016-03-16

河南省科技攻關(guān)計劃項目(142102110044)；?？萍紕?chuàng)新團隊項目(HUAHE2015003)

張桂枝(1970-)，女，副教授，碩士，從事畜禽疫病防治的教學與科研工作，E-mail：zhangguizhi666@126.com

靳雙星,E-mail:jinshuangxing@126.com

S831.7

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0529-6005(2017)04-0086-02