散養(yǎng)土雞J亞群禽白血病病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒混合感染的診斷

劉 蘭，梁雄燕,2，李拓凡，顧玉芳，楊玉瑩

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州434025 ； 2.長江大學農(nóng)學院，湖北荊州434025)

散養(yǎng)土雞J亞群禽白血病病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒混合感染的診斷

劉 蘭1，梁雄燕1,2，李拓凡1，顧玉芳1，楊玉瑩1

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州434025 ； 2.長江大學農(nóng)學院，湖北荊州434025)

湖北某農(nóng)戶散養(yǎng)的土雞，雞群精神委靡、整體消瘦，對病雞進行剖檢，發(fā)現(xiàn)部分雞體表和臟器可見大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)。取病變典型的組織制作病理切片，鏡檢可看到髓樣細胞瘤和網(wǎng)狀細胞。提取病雞組織DNA，用兩組Multi-PCR分別檢測A、B、J亞群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和馬立克病病毒(MDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)。結(jié)果僅擴增出與ALV-J和REV相應(yīng)的條帶，表明該雞群為ALV-J和REV混合感染。

J亞群白血病 ； 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥 ； 混合感染 ； 病理組織切片 ； Multi-PCR

禽白血病(AL)、馬立克病(MD)和網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥(RE)是目前對養(yǎng)禽業(yè)危害最大的三大腫瘤性疾病，分別由致瘤性病毒ALV、MDV和REV引起。它們不僅能引發(fā)腫瘤，還可引起雞群嚴重的免疫抑制，極易繼發(fā)感染其他疾病，導致雞群死亡率增高，造成不可挽回的巨大經(jīng)濟損失。現(xiàn)在的研究證實，AL、MD和RE在我國禽類養(yǎng)殖中均有存在，且ALV、MDV和REV能混合感染雞群[1-2]，表現(xiàn)出協(xié)同致病作用。ALV、MDV和REV混合感染引起的腫瘤眼觀上難以區(qū)分，在臨床上極易混淆，使用常規(guī)的病理組織學方法難以進行鑒別，病毒的分離和鑒定方法所需時間太長，而應(yīng)用PCR技術(shù)能夠進行快速診斷。ALV-J和REV的混合感染在肉雞和蛋雞中都曾有過報道，但地方雞種ALV-J和REV的混合感染卻少見報道。2015年11月，湖北某養(yǎng)殖戶散養(yǎng)的土雞，雞群精神委靡、整體消瘦，10周齡始陸續(xù)死亡。通過觀察臨床癥狀，進而選取癥狀典型的病雞進行病理剖檢，部分雞體表和臟器可見大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)。通過Multi-PCR檢測，確診為ALV-J和REV混合感染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理 湖北某養(yǎng)殖戶送檢的散養(yǎng)土雞，剖檢后取病變典型的組織，一份用甲醛固定，用于制備病理組織切片，另一份存于-80 ℃冰箱，用作PCR檢測。

1.2 主要試劑rTaq、dNTPs等PCR相關(guān)試劑以及DL-2 000 DNA Marker等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。DNA提取相關(guān)試劑，由本實驗室配制。

1.3 臨床診斷與病理學觀察 眼觀雞群臨床癥狀，對臨床癥狀典型的雞群進行病理學剖檢，查看各組織臟器的病理變化情況，按照常規(guī)方法取材后固定，以備組織切片的制作。

1.4 組織DNA的提取 取癥狀典型的病雞的脾、肺、肝、腎，按文獻提取DNA[3]。

1.5 引物設(shè)計 Multi-PCR引物參照相關(guān)文獻[4-5]設(shè)計，由武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司合成，引物序列見表1。

1.6 Multi-PCR檢測 PCR反應(yīng)體系均采用25 μL體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)2 μL，模板DNA 1 μL， rTaq(5 U/μL)0.25 μL，10 pmol/L的引物(ALV-A/B/JF 2 μL，ALV-AR 1 μL，ALV-BR 1 μL，ALV-JR 1 μL)或(REV-F 1 μL，REV-R 1 μL，MDV-F 1 μL，MDV-R 1 μL)，最后用滅菌ddH2O補足至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃(ALV-A/B/J)退火30 s或55 ℃(REV/MDV)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min，4 ℃10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀與病理變化 病雞多消瘦、精神委靡、雞冠蒼白、生長遲緩、羽毛松亂、個別雞眼瞼粘連(見中插彩版圖1A);剖檢病雞腺胃腫大，腺胃乳頭出血(見中插彩版圖1B);病雞心臟腫大，切開有白色結(jié)節(jié)，小腸亦有灰白色腫瘤結(jié)節(jié)； 肝臟腫大暗紅，表面有白色結(jié)節(jié)(見中插彩版圖1C)；將病雞跗關(guān)節(jié)周圍的皮剝離后發(fā)現(xiàn)有腫瘤樣贅生物(見中插彩版圖1D)。跗關(guān)節(jié)切片H.E.染色鏡檢，可見瘤細胞形態(tài)基本一致，排列緊密，瘤細胞體積較大，核較大，細胞空泡化、色淡，胞漿內(nèi)充滿嗜酸性紅染顆粒[見中插彩版圖1E(a為髓細胞)]；脾臟失去原有組織結(jié)構(gòu)，脾臟內(nèi)能看到網(wǎng)狀細胞和大量形態(tài)不一的淋巴細胞增生[見中插彩版圖F(a為網(wǎng)狀細胞，b為大淋巴細胞，c為中淋巴細胞，d為小淋巴細胞)]。

表1 用于檢測ALV-A、ALV-B 、ALV-J和MDV、REV的兩組Multi-PCR引物

2.2 Multi-PCR結(jié)果 以病雞組織DNA為模板，用Multi-PCR方法分別檢測ALV-A、ALV-B、ALV-J和MDV、REV，結(jié)果從病雞組織DNA中擴增出了與ALV-J大小相近的陽性條帶和與REV大小相近的陽性條帶，而未擴增出與ALV-A/B、MDV相對應(yīng)的條帶(圖2)，經(jīng)測序表明二者分別是ALV-J 和REV的核酸序列。結(jié)果表明，病雞為ALV-J和REV混合感染。

3 討論

ALV-J和REV是能引起家禽不同組織臟器發(fā)生腫瘤和造成宿主免疫抑制的兩種反轉(zhuǎn)錄病毒，他們對我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[6]。本試驗對湖北某農(nóng)戶送檢的土雞進行剖檢，病雞肝臟表面有明顯腫瘤結(jié)節(jié)，小腸有大小不等的灰白色結(jié)節(jié)，跗關(guān)節(jié)有腫瘤增生。而ALV-J、ALV-A、ALV-B以及MDV、REV這幾種病毒均能誘發(fā)腫瘤，但是在外觀上不易區(qū)分。病雞心肌肥大增厚，腺胃腫大出血，符合網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥和馬立克病的病理特征，但病雞腔上囊萎縮，卵巢無明顯病理變化，因此僅靠眼觀難以準確判定，確診還須通過PCR等方法。跗關(guān)節(jié)腫瘤的病理切片中可見到大量髓樣瘤細胞，是ALV-J感染的病理特征，但脾臟組織內(nèi)能看到網(wǎng)狀細胞和大量形態(tài)不一的淋巴細胞增生。為弄清是否存在其他病原，進一步取病變典型的組織，提取組織DNA，用針對ALV-A、ALV-B、ALV-J和MDV、REV的兩組Multi-PCR分別進行檢測，結(jié)果僅擴增出與ALV-J和REV前病毒對應(yīng)的核酸條帶，排除了ALV-A、ALV-B及MDV的感染，最后確診該雞群為ALV-J和REV混合感染。

圖2 Multi-PCR電泳圖

M：DNA Marker DL-2 000； 1：ALV-A/B/J Multi-PCR陽性對照；2：樣本ALV-A/B/J DNA Multi-PCR； 3：ALV-A/B/J陰性對照；4：MDV/REV陽性對照； 5：MDV/REV陰性對照；6：樣本DNA MDV/REV Multi-PCR

本次試驗的結(jié)果表明，湖北地區(qū)所飼養(yǎng)的一些土雞中存在ALV-J和REV的混合感染，應(yīng)引起土雞養(yǎng)殖者的重視，在引進雞苗時需要提高警惕，同時還需加強ALV-J和REV的凈化工作。

[1] 張洪海，劉青，邱波，等．地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J]．畜牧獸醫(yī)學報，2009，40(8)：1215-1221．

[2] 宿靖偉，滕蔓，羅俊，等．馬立克病毒與網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒的混合感染及在傳代過程中的重組[J]．畜牧獸醫(yī)學報，2016，47(1)：128-134．

[3] 梁雄燕，楊玉瑩，顧玉芳，等．湖北部分肉種雞群J亞群禽白血病血清學調(diào)查及PCR檢測[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48(11)：2636-2638．

[4] Gao Q 1, Yun B, Wang Q,etal. Development and application of a multiplex PCR method for rapid differential detection of subgroup A, B, and J avian leukosis viruses[J]. J Clin Microbiol, 2013, 52(1):37-44.

[5] Sathish G, Parthiban M, Kumanan K,etal. Differential detection of avian oncogenic viruses in poultry layer farms and turkeys by use of multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(8): 2668-2673.

[6] 秦立廷，高玉龍，潘偉，等．我國部分地區(qū)蛋雞ALV-J及與REV、MDV、CAV混合感染檢測[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2010，32(2)：90-93．

2016-05-30

國家自然科學基金項目(31060342)

劉蘭(1992-)，女，碩士，主要研究方向為動物病原分子生物學，E-mail： liulan222@hotmail.com

楊玉瑩，E-mail：yangyycn@gmail.com

S858.31

B

0529-6005(2017)04-0047-02