過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)NDV和IBDV的殺滅試驗(yàn)

史晨婕，郝利華，白 瑞 ，鄭明學(xué)，蘇文雪，張 黎，席 柔，貢 鑫，蘇曉晴，張李琦

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801 ； 2.太原市動(dòng)物園，山西太原030009)

過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)NDV和IBDV的殺滅試驗(yàn)

史晨婕1，郝利華2，白 瑞1，鄭明學(xué)1，蘇文雪1，張 黎1，席 柔1，貢 鑫1，蘇曉晴1，張李琦1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801 ； 2.太原市動(dòng)物園，山西太原030009)

探討過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅新城疫病毒(NDV)和傳染性囊病病毒(IBDV)的效果，為雞病毒性傳染病的防治提供依據(jù)。分別采用雞胚接種法、血凝試驗(yàn)和懸浮殺滅試驗(yàn)測(cè)定過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)NDV和IBDV的殺滅效果。過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑滅活NDV、IBDV的有效濃度均為0.04%，最快有效時(shí)間分別為10 min和30 min。過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑可有效殺滅NDV和IBDV。在有效殺滅濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)NDV和IBDV的滅活效果增強(qiáng)。

過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑 ； 新城疫病毒 ； 傳染性囊病病毒

過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室研制的對(duì)禽流感病毒(AIV)、大腸桿菌(8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、禽多殺性巴氏桿菌(C48-1)、溶血性鏈球菌C型、蠟樣桿菌(8008)的殺菌作用迅速、高效、長(zhǎng)效、抗干擾的復(fù)方消毒劑，但該消毒劑對(duì)新城疫病毒、傳染性囊病病毒的殺滅效果尚不明確，為探討該消毒劑的適用范圍，在實(shí)踐中得到合理應(yīng)用，本試驗(yàn)依據(jù)《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[1]及《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)[2]對(duì)過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅新城疫病毒(NDV)和傳染性囊病病毒(IBDV)的效果進(jìn)行研究。

新城疫病毒(NDV)是ssRNA病毒，有囊膜，為雙層結(jié)構(gòu)膜，由宿主細(xì)胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結(jié)合衍生而來[3]。高富紅等[4]研究表明，戊二醛苯扎溴銨溶液1 600倍稀釋作用5 min可殺滅NDV。徐繼英等[5]研究表明，復(fù)合亞氯酸鈉粉1∶3 000倍稀釋時(shí)，作用5 min 可100%殺滅NDV。

雞傳染性囊病病毒(IBDV)為雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬[6]。IBDV無囊膜，僅由核酸和衣殼組成。高富紅等[7]研究指出，戊二醛苯扎溴銨溶液100倍稀釋作用60 min可有效殺滅IBDV。

消毒劑對(duì)NDV和IBDV的殺滅作用均可用雞、雞胚和雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定[8]。本試驗(yàn)采用雞胚為試驗(yàn)動(dòng)物，通過觀察接種NDV后雞胚死亡情況及培養(yǎng)結(jié)束后雞胚尿囊液HA滴度來反應(yīng)是否有NDV存活，以及觀察接種IBDV后雞胚死亡情況及雞胚有無典型病變來判定病毒滅活效果。

1 材料與方法

1.1 材料 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑(主要含過氧乙酸、過氧化氫和戊二醛)，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室研制。雞新城疫病毒LaSota株、雞傳染性囊病病毒B87株，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。10日齡SPF雞胚，山西省隆克爾生物制藥有限公司。

1.2 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅NDV效果試驗(yàn)

1.2.1 1%雞紅細(xì)胞懸液的制備 采集青年公雞的血液，滅菌PBS清洗，2 000 r/min離心5 min，吸棄上清液和表面的白細(xì)胞，漂洗3次后收集紅細(xì)胞，吸取1 mL紅細(xì)胞加入9 mL PBS，即配成10%雞紅細(xì)胞，置于4 ℃冰箱備用(不超過2周)[9]。

1.2.2 NDV的EID50的測(cè)定 采用雞胚接種法和血凝試驗(yàn)測(cè)定雞胚尿囊液的HA滴度[10]，并按Karber方法計(jì)算新城疫病毒的EID50。用不同梯度新城疫病毒稀釋液為控制變量，同時(shí)設(shè)立正常雞胚對(duì)照組和PBS對(duì)照組。

1.2.3 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑加中和劑后對(duì)雞胚的影響 用不同濃度的復(fù)方消毒劑加中和劑接種雞胚，孵育，觀察雞胚死亡情況，以測(cè)定復(fù)方消毒劑加中和劑后對(duì)雞胚的影響。

1.2.4 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)NDV的殺滅效果測(cè)定 采用懸浮殺滅試驗(yàn)評(píng)價(jià)復(fù)方消毒劑對(duì)新城疫病毒的殺滅效果。用不同濃度的消毒劑作為控制變量，同時(shí)設(shè)立接種病毒的陽性對(duì)照組和PBS對(duì)照組，并測(cè)定24～72 h內(nèi)雞胚尿囊液的HA滴度，計(jì)算各組病毒滅活率[11]。

試驗(yàn)重復(fù)3次，以病毒滅活率為100%的最大稀釋倍數(shù)作為本消毒劑滅活NDV的有效濃度，以該濃度消毒劑滅活病毒的最短時(shí)間為最快有效時(shí)間。

1.3 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅IBDV效果試驗(yàn)

1.3.1 IBDV的ELD50的測(cè)定 采用雞胚接種法測(cè)定IBDV的ELD50，并通過Karber方法計(jì)算，方法同1.2.2項(xiàng)。

1.3.2 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)IBDV的殺滅效果測(cè)定 采用懸浮殺滅試驗(yàn)評(píng)價(jià)復(fù)方消毒劑對(duì)IBDV的殺滅效果。用不同濃度的消毒劑作為控制變量，同時(shí)設(shè)立接種病毒的陽性對(duì)照組和PBS對(duì)照組，觀察雞胚并檢查死胚有無出血、發(fā)育受阻等典型病變，若有，則為陽性[12-13]，計(jì)算各組病毒滅活率。

試驗(yàn)重復(fù)3次，以病毒滅活率為100%的最大稀釋倍數(shù)作為本消毒劑滅活I(lǐng)BDV的有效濃度，以該濃度消毒劑滅活病毒的最短時(shí)間為最快有效時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅NDV效果試驗(yàn)

2.1.1 NDV的半數(shù)感染量(EID50)。

表1 各稀釋度新城疫病毒接種雞胚72 h后尿囊液HA情況

新城疫病毒尿囊液EID50=10-6.5/0.2 mL

2.1.2 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑加中和劑后對(duì)雞胚的影響 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑加中和劑后，接種雞胚，在24～72 h內(nèi)雞胚均無死亡，說明該消毒劑加中和劑后對(duì)雞胚的生長(zhǎng)無明顯影響。

2.1.3 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)NDV的滅活效果 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑隨稀釋倍數(shù)的減小和作用時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)NDV的滅活效果增高，該消毒劑滅活NDV的有效濃度為2 500倍稀釋(濃度為0.04%)，其有效濃度對(duì)NDV的最快有效時(shí)間為 10 min。該消毒劑125倍稀釋(濃度為0.8%)時(shí)，5 min 即可滅活100%的NDV，見表2。

表2 復(fù)方消毒劑對(duì)新城疫病毒的殺滅效果

2.2 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅IBDV效果

2.2.1 IBDV的ELD50測(cè)定 傳染性囊病病毒尿囊液ELD50=10-3.9/0.2mL。

2.2.2 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)IBDV的殺滅效果 過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑隨稀釋倍數(shù)的減小和作用時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)IBDV的滅活率增高，該消毒劑滅活I(lǐng)BDV的有效濃度為2 500倍稀釋(濃度為0.04%)，其有效濃度對(duì)IBDV的最快有效時(shí)間為30 min。該消毒劑125倍稀釋(濃度為0.8%)作用5 min，即可滅活100%的IBDV，見表4。

表3 傳染性囊病病毒對(duì)雞胚的致死情況

表4 復(fù)方消毒劑對(duì)傳染性囊病病毒的殺滅效果

3 討論與小結(jié)

過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑2 500倍以內(nèi)稀釋作用10 min以上或125倍以內(nèi)稀釋作用5 min以上，即可滅活100%的NDV；過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑2 500倍以內(nèi)稀釋作用30 min以上或125倍以內(nèi)稀釋作用5 min以上，即可滅活100%的IBDV。故過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑滅活NDV、IBDV的有效濃度均為0.04%(即2 500倍稀釋)，最快有效時(shí)間分別為10 min和30 min。而且隨著過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)NDV和IBDV的殺滅效果增強(qiáng)。

過氧乙酸先通過破壞囊膜、芽孢等通透性屏障，進(jìn)而破壞和溶解核心，使DNA、RNA、蛋白質(zhì)及DPA等物質(zhì)破壞漏出，致使細(xì)胞、病毒等死亡。這種破壞主要是通過過氧乙酸釋放的活性氧和酸的雙重作用，其中活性氧起主導(dǎo)作用[14]。過氧化氫可使細(xì)胞膜滲透壓和通透性改變，造成細(xì)胞的死亡，并且破壞胞內(nèi)的細(xì)菌酶、氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA[15]。戊二醛主要通過凝固蛋白質(zhì)、還原氨基酸和使蛋白質(zhì)分子烷基化[16]。

通過對(duì)過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅NDV和IBDV的效果比較，發(fā)現(xiàn)本消毒劑殺滅IBDV時(shí)，其殺毒濃度和時(shí)間均有增大，是因?yàn)镹DV為有囊膜的病毒，其囊膜中的主要成分為蛋白質(zhì)。過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑的主要成分有過氧乙酸、過氧化氫和戊二醛，其作用機(jī)理是通過改變囊膜的滲透壓和通透性，凝固蛋白質(zhì)，進(jìn)而破壞RNA，故而NDV對(duì)外界的抵抗力不強(qiáng)，對(duì)高溫、紫外線和各種消毒劑均敏感[17]。而IBDV為無囊膜病毒，對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，對(duì)反復(fù)凍融、紫外線和超聲波處理抵抗力也較強(qiáng)。對(duì)乙醚、氯仿、胰蛋白酶具有抵抗力。在酸性(pH值3)、中性或弱堿性條件下穩(wěn)定，但在堿性(pH值12)條件下可失活，對(duì)許多化學(xué)物質(zhì)不敏感[18]。故而，殺滅時(shí)間與濃度均有增大。此結(jié)果與高富紅等[4,7]研究結(jié)果相一致。

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The inactivated efficacy of Acetic acid peroxide glutaraldehyde compound disinfectant to NDV and IBDV

SHI Chen-jie1, HAO Li-hua2, BAI Rui1, ZHENG Ming-xue1, SU Wen-xue1, ZHANG Li1, XI Rou1, GONG Xin1, SU Xiao-qing1, ZHANG Li-qi1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801 , China ; 2.Taiyuan Zoo, Taiyuan 030009 , China)

In order to provide the evidence for preventing chicken virus communicable diseases, we evaluated the effect of Acetic acid peroxide glutaraldehyde compound disinfectant on new castle disease virus(NDV) and infectious bursa disease virus(IBDV). Egg inoculation、hemagglutination test were used to and aqecous suspension test determine the effect of Acetic acid peroxide glutaraldehyde compound disinfectant on New castle disease virus and Infectious bursa disease virus. The effective concentration of disinfectant germicidal to kill NDV and IBDV was 1∶2500,10 min was the shortest time to kill NDV and 30 min was the shortest time to kill IBDV. the efficiency of inactivation of NDV and IBDV increased with the extension of function time and the increase of concentration.

Acetic acid peroxide glutaraldehyde compound disinfectant;New castle disease virus;Infectious bursa disease virus

ZHENG Ming-xue

2016-06-29

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD56B06)；山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(2016-11-03)

史晨婕(1993-)，女，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治研究，E-mail：317660260@qq.com

鄭明學(xué)，E-mail：zhengmingxue288@163.com

S852.3

A

0529-6005(2017)04-0033-03