三峽庫區(qū)仔豬傳染性腹瀉病原調(diào)查

廖勤豐，李文娟，向邦全，程文超，徐茂森，王 敬，譚素雯

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系，重慶萬州404155)

三峽庫區(qū)仔豬傳染性腹瀉病原調(diào)查

廖勤豐，李文娟，向邦全，程文超，徐茂森，王 敬，譚素雯

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系，重慶萬州404155)

為了弄清三峽庫區(qū)仔豬傳染性腹瀉病原的感染及流行規(guī)律，本試驗于2013-2015年從三峽庫區(qū)的18個規(guī)?；i場采集了180份發(fā)生腹瀉的病料進行豬致病性大腸桿菌(EPEC)、豬流行性腹瀉病病毒(FEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病病毒(RDV) 4種病原的檢測，結(jié)果表明，三峽庫區(qū)6個地區(qū)4種仔豬腹瀉傳染性病原檢出率由高至低順序為PEDV、RDV、TGEV和EPEC，依次為22%、12.7%．5.5%和3.8%，表明三峽庫區(qū)規(guī)?；i場PEDV和RDV感染廣泛，且三峽庫區(qū)規(guī)?；i場存在多種病原混合感染情況。

仔豬腹瀉 ； 豬致病性大腸桿菌 ； 豬流行性腹瀉病毒 ； 豬傳染性胃腸炎病毒 ； 豬輪狀病病毒

在規(guī)?；i場，仔豬腹瀉是一種典型的多因素性疾病。近年來，許多豬群仔豬腹瀉性疾病的發(fā)病率高達(dá)50%以上，病死率高達(dá)15%～20%左右，由腹瀉引起的仔豬死亡數(shù)占仔豬死亡總數(shù)的39.8%，其中哺乳仔豬至斷奶前后發(fā)生腹瀉而引起死亡的約占20%～25%[1-2]。2010年冬至2011年春，在我國華東、華南和華北部分省份，出現(xiàn)了流行范圍廣、疫情嚴(yán)重及危害嚴(yán)重的豬群腹瀉性疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[3]。

許多研究證明，引起仔豬腹瀉的主要傳染性病原有細(xì)菌性和病毒性兩種，主要包括致病性大腸桿菌、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病病毒等[4-8]。為了弄清三峽庫區(qū)仔豬傳染性腹瀉病原的感染及流行規(guī)律，本調(diào)查于2013-2015年從三峽庫區(qū)的18個規(guī)?；i場采集了180份發(fā)生腹瀉的病料進行豬致病性大腸桿菌、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病病毒4種病原的檢測，為三峽庫區(qū)的仔豬傳染性腹瀉疫病的防治和流行病學(xué)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

2013-2015年，在三峽庫區(qū)的萬州、開縣、巫溪、云陽、忠縣、奉節(jié)6個地區(qū),從每個地區(qū)各選擇3家規(guī)?；B(yǎng)殖場，在每個養(yǎng)殖場各采集腹瀉仔豬的新鮮糞便10份，共180份樣品用于本試驗。

2 方法

2.1 致病性大腸桿菌的分離純化 將腹瀉仔豬的新鮮糞便樣品無菌接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取紅色典型菌落于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)，-20 ℃保存。

2.2 致病性大腸桿菌的PCR鑒定 參照文獻[4-5]設(shè)計菌毛K88和K9的檢測引物P1/P2和P3/P4(表1)，挑取純化培養(yǎng)的菌落重懸1 mL于去離子水中作為PCR反應(yīng)模板。建立25 μL PCR反應(yīng)體系：2×PCR Super Mix 12.5 μL、上下引物(20 pmol / μL)各1 μL、模板5 μL；PCR程序為：在94 ℃預(yù)變性4 min，隨后用94 ℃變性50 s、45 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s的程序運行30個循環(huán)，最后在72℃下延伸5 min，PCR產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。

2.3 腹瀉病毒性病原的檢測

2.3.1 樣品處理 將豬糞便樣品用無菌PBS稀釋按1∶5比例(w/v)稀釋，加入雙抗，研磨或振蕩制成勻漿，13 800 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清，用0.22 μm濾器過濾，將濾液置-20 ℃保存。

表1 試驗所用的4種病原檢測引物

2.3.2 RNA提取及cDNA模板制備 取200 μL上述濾液，用RNeasy Mini kit提取樣品RNA，取5 μL RNA與20 pmol隨機引物混合，在70 ℃作用5 min，置4 ℃作用5 min；然后依次加入5 μL 5×RT Buffer、5 μL dNTP(10 mmol/L)、7 μL RNA-free H2O、1μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)、1μL RNase inhibitor(40 U/μL)，補ddH2O至25 μL。在42 ℃反應(yīng)1 h，置94 ℃作用5 min。

2.3.3 PEDV、RDV、GEV的檢測 用文獻[6-8]報道的引物進行檢測。建立25 μL PCR反應(yīng)體系：2×PCR Super Mix 12.5 μL、PEDV、RDV、GEV的上下游引物(20 pmol/μL)(表1)各1 μL、cDNA模板5 μL；PCR程序參考文獻[6-8]，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。

3 結(jié)果

3.1 致病性大腸桿菌的PCR檢測結(jié)果 從7份發(fā)病豬場樣本分離到的大腸桿菌，從7份樣品中檢出大腸桿菌K88的201 bp條帶(圖1)，RT-PCR陽性率為3.8%(表2)。

圖1 大腸桿菌K88的PCR檢測電泳圖

M：DNA Marker； 1～5：部分樣品K88的檢測PCR產(chǎn)物；6：陽性對照； 7：陰性對照； 8～13：部分樣品K88的檢測PCR產(chǎn)物

3.2 PEDV、RDV、GEV的RT-PCR檢測結(jié)果 從40份樣品中檢出PEDV的423 bp條帶(圖2)，RT-PCR陽性率為22%(表2)。從25份樣品中檢出RDV的750 bp條帶(圖3)，RT-PCR陽性率為13.8%(表2)。從10份樣品中檢出TGEV的546 bp條帶，RT-PCR陽性率為5.5%(表2)。

圖2 PEDV的PCR檢測電泳圖

M：DNA Marker； 1～13：部分樣品PEDV的檢測PCR產(chǎn)物； 14：陽性對照； 15：陰性對照； 16～22：部分樣品PEDV的檢測PCR產(chǎn)物

圖3 PRV的PCR檢測電泳圖

M：DNA Marker； 1～3：部分樣品PRV的檢測PCR產(chǎn)物；4：陽性對照； 5：陰性對照； 6～10：部分樣品PRV的檢測PCR產(chǎn)物

3.3 腹瀉病料中病原檢測結(jié)果 2013-2015年，應(yīng)用細(xì)菌分離、PCR及RT-PCR方法對收集于三峽庫區(qū)6個地區(qū)的18個規(guī)?；i場具有明顯腹瀉癥狀仔豬的180份病料樣品，進行EPEC 、PEDV、TGEV、RV核酸檢測，按不同地區(qū)進行比較(表2)，部分陽性病料PCR和RT-PCR檢測電泳圖(圖1～圖3)。陽性率由高至低順序為PEDV、RDV、TGEV和EPEC，分別為22%、12.7%．5.5%和3.8%。PEDV從2013-2015年不同年份的陽性率依次為23.3%、26.7%、16.7%；RDV從2013-2015年不同年份的陽性率依次為8.33%、11.7%、21.7%；TGEV從2013-2015年不同年份的陽性率依次為0、5%、11.7%；EPEC僅在2013年檢出11.7%。

表2 三峽庫區(qū)仔豬腹瀉4種病原檢測結(jié)果

3.4 規(guī)模化豬場4種病毒混合感染檢測結(jié)果 對收集于三峽庫區(qū)6個地區(qū)的18個規(guī)?；i場具有明顯腹瀉癥狀仔豬的180份病料樣品，進行4種病原檢測結(jié)果顯示，其中1個豬場存在EPEC 、PEDV的混合感染，陽性樣品為3份，陽性率為1．7%；另1個豬場存在PEDV與TGEV混合感染，陽性樣品為4份，陽性率為2.2%；另外2個豬場存在PEDV與RDV混合感染，陽性樣品為5份，陽性率為2.8%；還有1個豬場存在TGEV與RDV混合感染；陽性樣品為3份，陽性率為1．67%；其余豬場均為單一感染(表2)。

3.5 各病原陽性地區(qū)分布 對三峽庫區(qū)6個地區(qū)的病料樣品的陽性結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示，萬州、開縣、巫溪、云陽、忠縣、奉節(jié)6個地區(qū)的仔豬腹瀉病料樣品中均檢出PEDV，其中萬州和巫溪的PEDV感染率較高，萬州PEDV陽性率為33.3%，巫溪PEDV陽性率為26.7%；除萬州外檢測出RDV，其中開縣的感染率RDV最高為30%；TGEV只在萬州、云陽及奉節(jié)3個地區(qū)檢出，EPEC只在萬州、云陽2個地區(qū)檢出。

4 討論

豬流行性腹瀉最早發(fā)生于1976年[9]，此后豬流行性腹瀉時有發(fā)生，而由2010年10月開始，中國南部地區(qū)超過10個省份暴發(fā)PED，并導(dǎo)致100萬頭以上的仔豬死亡[10]。楊紹林等[11]對2011-2012年期間四川地區(qū)7個縣市的規(guī)?；B(yǎng)殖場仔豬腹瀉疫情調(diào)查結(jié)果顯示，豬流行性腹瀉病毒陽性率為42.47%，并認(rèn)為此次仔豬腹瀉疫情的主要病原為豬流行性腹瀉病毒。本調(diào)查對收集于三峽庫區(qū)6個地區(qū)的18個規(guī)?；i場具有明顯腹瀉癥狀仔豬的180份病料樣品進行EPEC 、PEDV、TGEV、RV核酸檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三峽庫區(qū)6個地區(qū)4種仔豬腹瀉傳染性病原檢出率由高至低順序為PEDV、RDV、 TGEV和EPEC，其中PEDV陽性率最高為為22%，表明三峽庫區(qū)規(guī)模化豬場PEDV感染率高，三峽庫區(qū)仔豬腹瀉傳染性主要病原為PEDV，其次為RDV。對4種病原3年間的流行情況分析表明，PEDV感染率在2014年達(dá)到高值，而在2015年其感染率開始下降，；RDV、TGEV感染率在從2013-2015年逐年上升；而EPEC僅在2013年檢出。三峽庫區(qū)規(guī)模化豬場4種病毒混合感染檢測結(jié)果顯示，萬州有1個豬場存在EPEC 、PEDV的混合感染，奉節(jié)1個豬場存在PEDV與TGEV混合感染，巫溪和云陽各有1個豬場PEDV與RDV混合感染，表明三峽庫區(qū)規(guī)?；i場存在多種病原混合感染情況。本課題調(diào)研的三峽庫區(qū)6個地區(qū)均檢出PEDV，除萬州外檢出RDV，表明三峽庫區(qū)規(guī)模化豬場PEDV和RDV感染廣泛。

[1] 黨安坤, 張棟, 杜蘭榮, 等. 山東省仔豬腹瀉情況調(diào)查報告[J]. 中國動物檢疫, 2012, 29(6): 62-63.

[2] 楊國麗, 王軍, 李紅魁，等.遼寧地區(qū)豬腹瀉病發(fā)病情況調(diào)查[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012(9)：31-32.

[3] 甘海霞, 梁晟, 韋顯凱, 等. 2011年廣西豬群豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎調(diào)查[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2012, 33 (10)：125-127.

[4] 陸桂平, 華榮虹, 張書霞, 等．檢測K88腸毒索性大腸桿菌PCR方法的建立[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2002, 34(12): 7-9.

[5] 鄧光存, 王玉炯, 許崇波, 等. 大腸桿菌苗毛抗原K(99)基因的亞克隆及核苷酸序列測定[J]. 寧夏大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版，2002，23(1)：76-78．

[6] 毛黎紅, 王開功, 周碧君, 等．貴州省部分地區(qū)規(guī)?；i場仔豬4種致豬腹瀉病病毒感染調(diào)查[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2015，36(5)：121-124.

[7] 楊群, 何孔旺, 陸承平, 等. 應(yīng)用多重RT-PCR方法檢測158例豬糞樣中的兩種冠狀病毒[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2006, 28(4): 431-435．

[8] 秦谷雨, 楊勇, 李郁, 等. 安徽省仔豬腹瀉5種病毒感染情況的調(diào)查研究[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2012，33(12)：59-63.

[9] 蔡寶祥, M.B.Pensaert．豬流行性腹瀉[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 1982，9(2)：57-59.

[10] Sun R Q, CaiR J, Chen Y Q,etal. Outbreak of por cine epidemicdiarrhea in sucking pipets，China[J]．Emerg Infect Dis，2012，18(1)：161-163．

[11] 楊紹林，郭玲，顏其貴，等. 2011年四川地區(qū)豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎流行病學(xué)調(diào)查[C]. 成都：四川省畜牧獸醫(yī)學(xué)會第九次會員代表大會暨2012年學(xué)術(shù)年會.2012：367-371.

Investigation on Pathogens with Causing piglet Diarrhea From Three Gorges Reservoir of Chongqing

LIAO Qin-feng , LI Wen-juan , XIANG Bang-quan , CHENG Wen-chao , XU Mao-sen ,WANG Jing , TAN Su-wen

(Department of Animal Science and Technology, Chongqing Three Gorges Vocational College, Chongqing 404155，china)

In order to investigate the pathogens and epidemics of piglet Diarrhea From Three Gorges Reservoir of Chongqing, we collected 180 occurred diarrhea feces samples from 18scale pigfarms in the Three Gorges Reservoir area from 2013 to 2015 .Using PCR or RT-PCR, those samples were detected for Enteropathogenic Escherichia coli(EPEC), Porcine epidemic diarrhea virus of swine (FEDV), Transmissible gastroenteritis virus of swine (TGEV) and Rotavirus of swine(RDV). The results showed that detection rate of PEDV,RDV, TGEV and EPEC were 22%, 12.7%, 5.5% and 3.8%,respectively.In six areas of Three Gorges Reservoir of Chongqing. The results also showed that diarrhea happened in large scaled pig farms in partial areas of Three Gorges Reservoir of Chongqing mainly resulted from PEDV, and RDV. Mixed infection was found in those areas.

piglet Diarrhea; Enteropathogenic Escherichia coli; Porcine epidemic diarrhea virus of swine; Tansmissible gastroenteritis virus of swine; Rotavirus of swine

2016-06-15

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目資助(KJ1733440)

廖勤豐(1980—)，男，副教授，博士，研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)，E-mail：lqf1980love@126.com

S852.65+1

A

0529-6005(2017)04-0009-04