紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞Notch-1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

陳微 曹毅 楊曉紅

紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞Notch-1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

陳微 曹毅 楊曉紅

目的 研究紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞抑制增殖的作用及其作用機(jī)制。方法 倒置顯微鏡下觀察不同濃度紫草素（0、2、5、10、15μmol/L）作用后HaCaT細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測(cè)紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞抑制增殖的作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化；Western blot法檢測(cè)Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白的表達(dá)情況。RT-PCR檢測(cè)下游信號(hào)分子Hes1和Hes5的mRNA表達(dá)。結(jié)果 10μmol/L紫草素即可顯著抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加，紫草素呈劑量依賴(lài)性地抑制HaCaT細(xì)胞的增殖（均P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示10μmol/L紫草素能夠顯著誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。Western bolt法檢測(cè)結(jié)果顯示，Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白表達(dá)逐漸降低。RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，Notch信號(hào)通路下游信號(hào)分子Hes1和Hes5的mRNA表達(dá)水平亦呈劑量依賴(lài)性降低。結(jié)論 紫草素呈劑量依賴(lài)性地抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Notch-1信號(hào)通路在其中起了重要作用。

紫草素 HaCaT Notch-1 Jagged1 Hes1 Hes5 細(xì)胞凋亡

紫草素是中藥紫草已分離出的有效成分，現(xiàn)代臨床研究認(rèn)為紫草素對(duì)銀屑病治療效果顯著，其作用機(jī)制報(bào)道顯示紫草素具有抑制與誘導(dǎo)表皮細(xì)胞凋亡的能力[1]，但是紫草素通過(guò)何種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尚未闡明。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡中起著重要作用，是許多重要細(xì)胞信號(hào)的交匯點(diǎn)。筆者通過(guò)體外研究試驗(yàn)觀察不同濃度紫草素對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞的影響，并且對(duì)Notch-1信號(hào)通路3個(gè)節(jié)點(diǎn)分子Notch-1、Jagged1和Hes5進(jìn)行研究，探討其與Ha－CaT細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以期能為銀屑病治療機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞株由杭州市第三人民醫(yī)院皮膚病研究所惠贈(zèng)，1640培養(yǎng)基（杭州科易公司），胎牛血清（美國(guó)HyCIone公司），2-甲基-正丁酰紫草素（2-Methyl-n-butyl）shikonin（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Amersco公司），二甲基亞砜（dimethy sulfoxide，DMSO）（天津市天河化學(xué)試劑廠），兔抗人多克隆抗體Jagged1、Hes1（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗人多克隆抗體Notch-1、鼠抗人單克隆抗體B-actin（武漢博士德公司）。提取rn-RNA所用的Trizol（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)ABI公司），實(shí)時(shí)定量PCR supermix（美國(guó)Bio-Rad公司），RT-PCR中所用的引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物公司）。生物學(xué)安全臺(tái)（上海上凈凈化公司），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司），電熱恒溫水槽（上海精宏公司），電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Forma公司），倒置生物顯微鏡（美國(guó)COIC公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Bio Tek公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD CantoⅡ公司），蛋白印記檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃、75%N25%CO2和20% O2環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后更換新鮮培養(yǎng)液供下一步實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況 將HaCaT接種于96孔板，密度為8.0×104個(gè)/ml，放置于孵箱中24h后，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)板底50%～80%，移出培養(yǎng)基，加入不同濃度紫草素（0、2、5、10、15μmol/L）的紫草素組，每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml），孵育3h后，吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，溶解震蕩10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值（490nm），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞干預(yù)同1.2.2。用不含EDTA的胰酶消化收集HaCaT細(xì)胞（胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，以防引起假陽(yáng)性），微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速2 000r/ min，離心時(shí)間5min，棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000r/min，離心時(shí)間 5min）。用400μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106個(gè)/ml。在細(xì)胞懸浮液中加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入10μlPI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5min。在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，上樣30μg蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1h，加一抗（b-actin 1∶1 000，Notch-1 1∶500，Jagged1 1∶150，Hes5 1∶600）4℃15h，加入1:1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，顯色并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)Hes1和Hes5 mRNA表達(dá) 根據(jù)TaKaLa公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，從Gene Bank中獲得Notch-1、Hes1、Hes5 mRNA序列，并設(shè)計(jì)如下引物：Hes1引物序列，上游引物5′-TGGAAATGACAGTGAAGCACCT-3′,下游引物5′-GTTCATGCACTCGCTGAAGC-3′；Hes5的引物序列，上游引物5′-TGGAGAAGGCCGACATCCT-3′，下游引物5′-GGCGACGAAGGCTTTGC-3′。Actin引物序列，上游引物5′-TAAGTAGGCGCACAGTAGGTCTGA-3,下游引物5′-AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG-3′。反應(yīng)條件：50℃2 min滅活UTG活性，95℃10 min酶熱啟動(dòng)，95℃15 s變性40循環(huán)，62℃45 s退火及延伸。PCR反應(yīng)結(jié)束后收集溶解曲線(xiàn)判斷反應(yīng)特異性、SDS documents相對(duì)定量方法分析熒光值闡明基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以β-actin的mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度紫草素干預(yù)后HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察倒置顯微鏡下正常角質(zhì)形成細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，伸展，呈多角形，界清排列緊密。隨著紫草素濃度的增加，細(xì)胞變圓或形狀不規(guī)則，細(xì)胞貼壁性降低，部分細(xì)胞裂解成細(xì)胞碎片或脫落，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度紫草素干預(yù)后HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察（a:空白對(duì)照組；b:2μmol/L紫草素組；c:5μmol/L紫草素組；d:10μmol/L紫草素組；e:15μmol/L紫草素組；×100）

2.2 細(xì)胞增殖的測(cè)定 使用MTT法檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)紫草素劑量依賴(lài)性地抑制其增殖能力，與空白對(duì)照組相比，5μmol/L紫草素即可抑制HaCaT細(xì)胞增殖（P＜0.01），10μmol/L紫草素基本達(dá)到最大的效應(yīng)（P＜0.01），詳見(jiàn)表1、圖2。

2.3 不同濃度紫草素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同濃度紫草素處理后，結(jié)果顯示空白對(duì)照組凋亡率為2.1%，2μmol/L紫草素及5μmol/L紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞無(wú)明顯促凋亡作用，凋亡率分別為2.3%和3.1%，10μmol/L紫草素可有效促HaCaT細(xì)胞凋亡，凋亡率為15%。而15μmol/L促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡更加明顯，凋亡率為31%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果相似，見(jiàn)圖2。

表1 紫草素濃度對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（3a:空白對(duì)照組3b:2μmol/L紫草素組3c:5μmol/L紫草素組3d:10μmol/L紫草素組3e:15μmol/L紫草素組）

2.4 不同濃度紫草素處理后Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達(dá) HaCaT細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度紫草素處理24h后，Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達(dá)量呈劑量依賴(lài)性降低，見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度紫草素處理后Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達(dá)

2.5 不同濃度紫草素處理后HaCaT細(xì)胞Hes1和Hes5 mRNA表達(dá) 隨著紫草素濃度的增加，Hes1和Hes5 mRNA表達(dá)呈劑量依賴(lài)性降低，其中 10μmol/L和15μmol/L紫草素處理組Hes1和Hes5 mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 不同濃度紫草素對(duì)Hes1和Hes5 mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖及分化異常為特征的炎癥性皮膚病[2]。調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化已成為治療銀屑病的重要途徑。很多藥物或者物理療法可以通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡來(lái)達(dá)到治療銀屑病的目的[3]。紫草素是傳統(tǒng)中藥紫草的主要有效成分，是一萘醌類(lèi)化合物，藥理研究證實(shí)其抗炎、抗真菌和抗腫瘤等作用顯著[4]，作用機(jī)制包括對(duì) DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I、腫瘤血管生成和細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[1]。研究紫草素抗角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及其機(jī)制有利于開(kāi)發(fā)治療銀屑病的中藥制劑。

Notch信號(hào)在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用目前研究仍存在分歧。近年來(lái)，有文獻(xiàn)支持Notch信號(hào)在促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和抑制凋亡方面發(fā)揮重要作用[5]。在銀屑病皮損中，Notch-1表達(dá)明顯增高，在基底細(xì)胞層，Notch-l的核穿梭現(xiàn)象較為明顯[6]。Jacques Thelu[7]等檢測(cè)銀屑病患者表皮內(nèi)的Notch分子的表達(dá)較健康人下降。作為Notch家族的主要成員之一，Notch-1廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，有研究證實(shí)，Notch-1受體在正常皮膚表皮層均有表達(dá)，且在銀屑病患者表皮中顯著高于正常皮膚[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，10μmol/L紫草素即可顯著抑制Ha－CaT細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加，紫草素呈劑量依賴(lài)性地抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。銀屑病皮損中不僅有角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖同時(shí)還伴有細(xì)胞凋亡異常，在本實(shí)驗(yàn)中筆者應(yīng)用流式法檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，研究發(fā)現(xiàn)10μmol/L紫草素能夠顯著誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究了紫草素誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，對(duì)Notch-1信號(hào)通路的3個(gè)節(jié)點(diǎn)分子Notch-1、Jagged1和Hes5。Jagged1蛋白是細(xì)胞表面的跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于外周免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞[9]，研究已知Jagged1蛋白與Notch受體結(jié)合，激活Notch信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的活化、增殖和分化中發(fā)揮著重要的作用[10]。故筆者選取Jagged1作為活化Notch-1信號(hào)的配體。Hes1和Hes5作為Notch-1信號(hào)途徑的下游靶基因，其表達(dá)與否可以作為Notch-1信號(hào)途徑的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著紫草素濃度的增加，Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達(dá)量呈劑量依賴(lài)性降低，在RT-PCR法檢測(cè)中，筆者發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路下游信號(hào)分子Hes1和Hes5的mRNA表達(dá)水平亦呈劑量依賴(lài)性降低，與Western blot研究結(jié)果吻合，因此筆者推斷Notch-1信號(hào)通路可能與抑制HaCaT細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明紫草素呈劑量依賴(lài)性地抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Notch-1信號(hào)通路在其中起了重要作用。但是本實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)正常HaCaT細(xì)胞進(jìn)行研究，關(guān)于對(duì)造模后高增殖狀態(tài)下的HaCaT細(xì)胞是否有類(lèi)似作用，有待進(jìn)一步證實(shí)。

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Effects of Shikonin on proliferation of HaCaT Cells

CHEN Wei,CAO Yi,YANG Xiaohong.Department of Dermatology,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310005,China

Shikonin HaCaT Notch-1 Jagged1 Hes1 Hes5 Cell apoptosis

2016-11-17）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省自然科學(xué)基金（Y2100759）

310005 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科（陳微）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（曹毅、楊曉紅）

曹毅，E-mail:caoyi1965@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate effects of Shikonin on proliferation of HaCaT cells and its mechanism. Methods Human immortal keratinocyte HaCaT cells were treated with 0,2,5,10 and15μmol/L of Shikonin．The morphology of cells was observed with inverted microscopy,the growth inhibition rate of HaCaT cells was determined with MTT method,the apoptosis rate was detected by flow cytometer(FCM),the expression of Notch-1,Jagged1 and Hes5 proteins was detected by Western blot;the expression of Hes1 and Hes5 mRNA was detected by RT-PCR. Results MTT assay showed that cell growth was significantly inhibited by shitonin in a dose-dependent manner (P＜0.01).FCM showed that the percentage of apoptotic cells was significantly increased and the cell viability was significantly decreased after HaCaT cells were treated with＞10μmol/L shikonin (P＜0.01)．Western blot showed that the expression of Notch-1,Jagged1 and Hes5 was decreased;and RT-PCR showed that the mRNA expression of Hes1 and Hes5 was also decreased. Conclusion Shikonin can inhibit proliferation and induce apoptosis of HaCaT cells,which may be regulated by Notch-1 signal pathway.