花背蟾蜍性腺抗氧化酶對稀土尾礦庫污染脅迫的響應

司萬童，蔣海明，栗利曼，劉莎，劉菊梅，沈渭壽，朱曉東

1. 南京大學環(huán)境學院污染控制與資源化利用國家重點實驗室，南京 2100232. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 2100423. 內蒙古科技大學生命科學與技術學院，包頭 014010

花背蟾蜍性腺抗氧化酶對稀土尾礦庫污染脅迫的響應

司萬童1,2,3，蔣海明3，栗利曼3，劉莎3，劉菊梅3，沈渭壽2,*，朱曉東1,#

1. 南京大學環(huán)境學院污染控制與資源化利用國家重點實驗室，南京 2100232. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 2100423. 內蒙古科技大學生命科學與技術學院，包頭 014010

本研究以花背蟾蜍(Bufo Raddei)作為實驗動物，以某稀土尾礦庫周邊受污染的水域濕地為研究樣地，以相對無污染的小白河黃河濕地自然保護區(qū)為對照樣地。通過檢測兩地花背蟾蜍精巢和卵巢的臟器系數、MDA和GSH含量、SOD、GSH-Px、GST、CAT和GR活性、T-AOC等相關指標。研究花背蟾蜍性腺抗氧化酶對該稀土尾礦庫污染脅迫的響應效應。結果顯示：與黃河濕地相比，稀土尾礦庫濕地復合污染對花背蟾蜍精巢和卵巢臟器系數的影響差異不顯著。稀土尾礦庫花背蟾蜍精巢和卵巢中MDA含量、GPx、GST和CAT活性顯著高于黃河濕地(P<0.05)，而GSH含量表現(xiàn)出相反的趨勢。精巢中T-AOC顯著高于卵巢(P<0.01)，但相同組織在兩地間差異不顯著。結果表明該稀土尾礦庫復合污染對花背蟾蜍精巢和卵巢抗氧化能力有一定的毒害效應，且精巢和卵巢對污染脅迫的響應有明顯的差異性。在應對稀土尾礦庫濕地復合污染脅迫時，精巢更傾向于調用SOD-CAT系統(tǒng)的抗氧化機制，而在卵巢內GSH系統(tǒng)發(fā)揮作用更大。

尾礦庫；花背蟾蜍；精巢；卵巢；臟器系數；抗氧化；毒性效應

近年來，隨著各種礦產資源的相繼開采，為社會帶來巨大的經濟效益和方便的同時，也產生大量的廢礦渣和廢液[1]。其中含有大量未完全利用的重金屬、稀土元素以及放射性元素等多種污染物質。這些廢棄物大多堆積在一些尾礦庫中，由于大多數尾礦都是露天開放式存放，廢液會通過尾礦庫體和庫基滲漏，隨地表水和地下水擴散，加上裸露的礦渣粉塵隨風飛揚飄散，嚴重污染了周邊水體和土壤環(huán)境[2]。

花背蟾蜍(Bufo raddei)屬于兩棲類動物，皮膚具有較強的滲透性，因此對環(huán)境中污染物尤其是水體和沉積物污染具有極強的靈敏性，是一種良好的生物監(jiān)測指示物種，常被用來評估環(huán)境復合污染引起的綜合生物學效應[3-5]。已經有相關研究表明重金屬會對兩棲類生物的跳躍能力、骨骼發(fā)育、生長發(fā)育、抗氧化能力等都會產生一定的負面影響[6-8]，并且會增加花背蟾蜍的死亡率和畸形率[4,8-9]。有關污染物對兩棲類性腺的研究主要集中在性腺發(fā)育分化、組織學形態(tài)觀察和精巢酶活性、毒性效應等方面[3,10-12]，而有關稀土尾礦庫復合污染對花背蟾蜍性腺抗氧化能力的毒性效應以及抗氧化酶對污染脅迫的響應方面的研究報道較少。

因此，本實驗選取內蒙古某稀土尾礦庫周邊受污染的水域和相對無污染的黃河濕地自然保護區(qū)作為對照樣地，以花背蟾蜍為實驗動物，以花背蟾蜍精巢和卵巢的臟器系數和抗氧化相關酶系統(tǒng)和物質作為生物標志物監(jiān)測指標，包括丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，和在抗氧化生化反應中重要的反應物質谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量，超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)、過氧化氫酶(catalase, CAT)以及谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)活性和總體抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)。探討該稀土尾礦庫復合污染對花背蟾蜍性腺抗氧化能力的毒性效應以及抗氧化酶對污染脅迫的響應，為兩棲類動物的保護和當地稀土尾礦庫污染監(jiān)測、防控和評價提供參考依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗樣地

研究樣地選擇內蒙古包頭市某稀土尾礦庫周邊由滲漏水形成的受污染水域濕地；對照樣地選擇相對無污染的黃河自然保護區(qū)小白河濕地(圖1)。

圖1 稀土尾礦庫和黃河濕地樣地Fig. 1 The sampling sites of rare earth tailings wetland and the Yellow River wetland

尾礦庫地勢北高南低，地下水流向為從東北到西南[13]。滲漏水在尾礦庫南側形成了大約1×105m2的水域濕地，黃河在流經包頭小白河時，形成了十幾個小型濕地。本研究分別在尾礦庫南側和小白河兩地選擇了地形比較規(guī)則，采樣比較容易的地方作為實驗樣地，兩處樣地設置大小均約為1萬m2。

1.2 水體和底泥中的污染物分析

測定了兩地水體和底泥(0～20 cm)中的污染物元素。其中重金屬鎘、鉻、銅、鎳、鉛和鋅元素含量采用原子吸收分光光度法測定，砷元素含量采用原子熒光法測定。元素分析測試時進行空白實驗(消解時不加土壤樣品)和有證標準物質(土壤成分分析標準物質，GBW07407)的分析測試，進行質量控制。所有結果滿足實驗室質控要求，標準偏差控制在±10%之間。

1.3 實驗動物采集與解剖

于2015年5月初分別在兩地采集剛剛結束冬眠而未抱對的花背蟾蜍，每個樣地分別挑選雌、雄蟾蜍各18只。統(tǒng)計結果顯示雌性體重為25.70～31.47 g，體長為6.6～7.5 cm；雄性體重為15.40～20.18 g，體長為5.3～5.6 cm。將2個樣地采集到的蟾蜍帶回實驗室，雌雄蟾蜍隨機各取8只，每2只做為一個平行實驗，各做4個平行實驗(n=4)。當天采用雙毀髓法處死，解剖后摘取精巢和卵巢組織置于冰浴磷酸緩沖液(PBS)中待用。

1.4 動物指標測定

對精巢和卵巢稱重并計算性腺臟器系數。根據精巢和卵巢的質量按照1∶99的比例加入預冷的PBS緩沖液(pH=7.0)迅速勻漿(冰浴)，勻漿液轉置于50 mL EP管中，4 ℃，2 000 r·min-1離心10 min。取上清液進行MDA和GSH含量、SOD、GSH-Px、GST、CAT和GR活性、T-AOC等8種指標的測定。所有指標均采用南京建成生物試劑盒測定，實驗步驟均按照試劑盒說明書操作。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

利用SPSS 17.0進行數據統(tǒng)計與分析，數據均以平均值±標準偏差表示。利用One-way ANOVA進行數據比較。

2 結果(Results)

經檢測發(fā)現(xiàn)，表1中的各項污染物質在尾礦庫周邊濕地水體和底泥中均顯著(P<0.05)高于黃河濕地，這與當地的地理環(huán)境有很大關系。該處地勢北高南低，潛層地下水流向為東北至西南，導致尾礦庫滲漏水在南側大量聚集，水體中污染物含量較高。加上常年以西北風為主，尾礦庫中裸露的礦渣粉塵隨風擴散，導致污染物在周邊濕地底泥中大量沉積和富集。

由圖2可知與黃河樣地相比，尾礦庫樣地花背蟾蜍精巢與卵巢的臟器系數差異不顯著，可見尾礦庫復合污染對花背蟾蜍性腺的臟器系數并沒有造成顯著影響。由圖3到圖10可知，兩大樣地的花背蟾蜍性腺中，尾礦庫濕地的花背蟾蜍的MDA含量顯著高于黃河濕地(P<0.01)，精巢的MDA含量顯著高于卵巢(P<0.01)。SOD活性在尾礦庫濕地的蟾蜍精巢中顯著高于黃河濕地(P<0.01)，但在卵巢內兩地差異不顯著。GSH含量在尾礦庫濕地的花背蟾蜍中顯著低于黃河濕地(P<0.05)，精巢顯著低于卵巢(P<0.01)。GR活性兩地間相比和組織間相比差異均不顯著。GSH-Px和GST活性變化趨勢相似，在尾礦庫濕地蟾蜍精巢和卵巢中均顯著高于黃河濕地(P<0.05)，但同地精巢和卵巢間差異不顯著。CAT活性在尾礦庫濕地的花背蟾蜍中顯著高于黃河濕地(P<0.01)。T-AOC能力表現(xiàn)為精巢顯著高于卵巢(P<0.01)，但同組織兩地間差異不顯著。

表1 黃河和尾礦庫周邊濕地中水體和底泥污染物濃度(Mean±SD, n=3)Table 1 The pollutant concentrations in the water and sediment of the Yellow River and tailings wetlands (Mean±SD, n=3)

3 討論(Discussion)

通常情況下，生物體內氧自由基的生成與清除處于動態(tài)平衡。如果體內產生的自由基得不到及時有效的清除，就會通過損傷生物大分子破壞細胞的結構和功能，造成氧化損傷。氧化損傷是環(huán)境污染物引起生物毒性一個重要機理。其中MDA是生物體內的脂質過氧化產物，可以很好反映生物體內精巢和卵巢的氧化損傷程度。由實驗結果可知，尾礦庫樣地精巢和卵巢中MDA含量都高于黃河樣地，可能與尾礦庫濕地中水體和底泥污染程度高有很大關系(表1)。由于花背蟾蜍精巢和卵巢長期受到污染脅迫，導致其體內脂質過氧化反應更加嚴重[14]。Mendoza-Wilson等[15]和苗菲菲等[16]研究泥鰍的抗氧化能力時發(fā)現(xiàn)，當抗氧化系統(tǒng)長期不能及時清除自由基而或自由基超過一定閾值，就會對機體造成脂質過氧化反應。另外精巢中的脂質過氧化水平顯著高于卵巢(P<0.01)，表明精巢受到的毒害效應更加嚴重。

圖2 花背蟾蜍精巢、卵巢臟器系數注：WL表示尾礦庫蟾蜍卵巢；WJ表示尾礦庫蟾蜍精巢；HL表示黃河蟾蜍卵巢；HJ表示黃河蟾蜍精巢；## 表示相同濕地不同性腺組織間相比差異顯著(P<0.01)。下同。Fig. 2 The organ coefficients of B. raddei testis and ovariesNote: WL indicates toad’s ovary in tailings wetland; WJ indicates toad’s testis in tailings wetland; HL indicates toad’s ovary in the Yellow River wetland; HJ indicates toad’s testis in the Yellow River wetland. ## indicates significant differences between the different sex gland tissues in the same wetland at P<0.01 level. The same below.

圖3 花背蟾蜍精巢、卵巢MDA含量注：**表示相同性腺組織不同濕地間相比差異顯著(P<0.01)；# 表示相同濕地不同性腺組織間相比差異顯著(P<0.05)。下同。Fig. 3 The MDA contents of B. raddei testis and ovariesNote: ** indicates significant differences between the different wetlands in the same sex gland tissue at P<0.01; # indicates significant differences between the different sex gland tissues in the same wetland at P<0.05 level. The same below.

圖4 花背蟾蜍精巢、卵巢SOD活性Fig. 4 The SOD activities of B. raddei testis and ovaries

圖5 花背蟾蜍精巢、卵巢GSH含量注：*表示相同性腺組織不同濕地間相比差異顯著(P<0.05)。下同。Fig. 5 The GSH contents of B. raddei testis and ovariesNote: * indicates significant differences between the different wetlands in the same sex gland tissue at P<0.05. The same below.

圖6 花背蟾蜍精巢、卵巢GR活性Fig. 6 The GR activities of B. raddei testis and ovaries

圖7 花背蟾蜍精巢、卵巢GSH-Px活性Fig. 7 The GSH-Px activities of B. raddei testis and ovaries

圖8 花背蟾蜍精巢、卵巢GST活性Fig.8 The GST activities of B. raddei testis and ovaries

圖9 花背蟾蜍精巢、卵巢CAT活性Fig. 9 The CAT activities of B. raddei testis and ovaries

圖10 花背蟾蜍精巢、卵巢T-AOC含量Fig. 10 The T-AOC contents of B. raddei testis and ovaries

生物體內主要通過抗氧化酶系統(tǒng)和清除劑來清除氧自由基[17]。SOD和GSH都是生物體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，當生物體受到外界脅迫，體內產生大量有害自由基后，就可通過這2種酶以及相關酶的聯(lián)合作用來消除。其中SOD是生物個體在清除體內由新陳代謝產生的自由基的主要物質，主要催化過氧化氫反應將體內多余的超氧自由基還原，繼而由CAT和GSH-Px進一步還原為無害的水。GSH是重要的抗氧化劑和自由基清除劑，不僅是GSH-Px與GST這2種酶分解過氧化物必需的反應底物，也是GR酶的反應產物。其中GR在生物機體的氧化還原反應中有非常重要的作用，GST是生物體內一類與肝臟解毒密切相關的酶類[17]，GSH在這些酶的催化作用下，不僅可以清除體內過多自由基、過氧化物，而且可以通過轉移作用將體內有害物質排出體外，進而達到抗氧化損傷的作用。

本實驗通過2個濕地比較發(fā)現(xiàn)，稀土尾礦庫濕地花背蟾蜍精巢中SOD、GSH-Px、GST和CAT活性都顯著高于黃河濕地，可能是由于SOD活性受到稀土尾礦庫濕地中各類污染物質的誘導而上升[15]，進而使得CAT和GSH-Px活性升高，將過多的氧自由基進行了分解，來應對外界環(huán)境的變化，這是一種應激反應[19]。卵巢的SOD活性和精巢里的GSH-Px活性差異不顯著，可能由于不同的酶在不同組織中對環(huán)境變化響應程度不同所致。尾礦庫樣地花背蟾蜍精巢和卵巢中GSH含量低于黃河樣地，而與其相關的酶類GSH-Px和GST活性與黃河濕地相比均有所升高(圖5、6和7)，并且GR活性小于GSH-Px和GST活性，可見GSH生成速度小于其消耗速度，表明稀土尾礦庫濕地水體污染對花背蟾蜍精巢和卵巢的抗氧化能力有明顯的影響。

另外，尾礦庫樣地的精巢和卵巢相比，尾礦庫濕地蟾蜍精巢中SOD、CAT活性和MDA含量均顯著高于卵巢(P<0.01)，表明蟾蜍精巢主要通過SOD和CAT來應對外界污染脅迫。而卵巢中的GSH含量和GST活性顯著高于精巢(P<0.01)。與精巢相比，卵巢內涉及到GSH家族抗氧化酶系統(tǒng)普遍有較高的濃度或活性，表明在受到外界環(huán)境脅迫時，精巢可能更傾向于采用SOD-CAT抗氧化系統(tǒng)，而卵巢中GSH系統(tǒng)發(fā)揮的作用更大一些。這表明當受到環(huán)境污染脅迫時花背蟾蜍體內氧化應激系統(tǒng)具有一定的組織差異性，這可能與精、卵巢的結構和功能不同有很大關系。同時當地復合污染中不同污染物質對精、卵巢中各類抗氧化物酶活性的影響作用也存在差異。T-AOC代表機體內各種酶性和非酶性抗氧化能力的總體水平，其強弱與生物體自身的健康程度有著直接關系。由本實驗結果可知，尾礦庫樣地精巢和卵巢T-AOC能力與黃河樣地相比較大，但差異不顯著。整體而言，在一定程度上可以看出花背蟾蜍在長期受到尾礦庫濕地水體污染的影響下，機體內部受到了氧化損傷，并且能夠通過多種應激途徑共同作用來對污染脅迫做出響應，增強自身的氧化能力，調整機體更好地去適應生存環(huán)境。

綜上，該稀土尾礦庫周邊濕地水土復合污染對本土花背蟾蜍的精巢和卵巢組織造成了明顯的氧化損傷作用，具有顯著的生態(tài)毒性效應。在對抗逆境的過程中，蟾蜍精巢和卵巢對污染脅迫的響應方式和應激途經具有組織差異性，精巢更傾向于SOD-CAT系統(tǒng)的抗氧化機制，而卵巢中GSH系統(tǒng)發(fā)揮作用更大。

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◆

The Response of Antioxidant Enzyme inBuforaddeiGonad to Rare Earth Tailings Pollution Stress

Si Wantong1,2,3, Jiang Haiming3, Li Liman3, Liu Sha3, Liu Jumei3, Shen Weishou2,*, Zhu Xiaodong1,#

1. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210042, China2. Nanjing Institute of Environmental Science, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China3. School of Life Science and Technology, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China

30 March 2016 accepted 8 June 2016

This study uses Bufo raddei as the experimental animal. The polluted wetland at south side of a rare earth tailing was chosen as the study site, and the Yellow River’s Xiaobaihe wetland as the control site. The indicators including organ coefficients, MDA and GSH contents, and SOD, GSH-Px, GST, CAT and GR activities, and T-AOC were measured to study the response of antioxidant system in Bufo raddei gonad to rare tailings pollution stress. The results showed that the testis and ovary organ coefficients of B. raddei in rare earth tailings site had no obvious difference compared with that in the Yellow River site. The MDA contents, and GPx, GST and CAT activities in testis and ovary of B. raddei in rare earth tailings site were significantly higher than that in the Yellow River site (P<0.01), while the GSH contents were lower than that in the Yellow River site. In both tailings and the Yellow River sites, T-AOC in the testis were significantly higher than that in the ovary (P<0.05), but there was no obvious difference between two sites in the same organ. The results indicated that the pollution of this rare earth tailing had certain toxic effects on antioxidant capacities in the testis and ovary of B. raddei. The testis’ and ovary’s antioxidant enzymes showed different responses to the rare tailings pollution stress. The SOD/CAT antioxidant system contributed more to the tolerance to the stress in the testis, while the GSH-related antioxidant enzymes play a more important role in the ovary of B. raddei.

tailings; Bufo raddei; testis; ovary; organ coefficient; antioxidant; toxic effect

國家科技基礎性工作專項(2014FY110800)；國家自然科學基金(31460142)；中國博士后科學基金面上項目(2015M571663)；內蒙古科技大學創(chuàng)新基金青年學術骨干培養(yǎng)專項(2015QNGG05)

司萬童(1986-)，男，副教授，研究方向為生態(tài)毒理學和環(huán)境生物學，E-mail: siwt02@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: shenweishou@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160330005

2016-03-30 錄用日期：2016-06-08

1673-5897(2017)2-209-07

X171.5

A

沈渭壽(1958—)，男，生態(tài)學博士，研究員，主要研究方向為生態(tài)保護與修復。

共同通訊作者簡介：朱曉東(1963—)，男，環(huán)境科學博士，教授，主要研究方向為城市生態(tài)規(guī)劃與管理。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: xdzhu@nju.edu.cn

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