三氯卡班對小鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)影響的代謝組學(xué)研究

周麗麗，謝文平，李海山，陳會明，于文蓮，崔媛，劉偉，宋乃寧，沈國林

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院化學(xué)品安全研究所，北京 100123

三氯卡班對小鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)影響的代謝組學(xué)研究

周麗麗，謝文平，李海山#，陳會明，于文蓮，崔媛，劉偉，宋乃寧，沈國林*

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院化學(xué)品安全研究所，北京 100123

三氯卡班被認定為一種新型的環(huán)境污染物，可能對動植物和人體產(chǎn)生危害，為探究三氯卡班的有害作用機制，選擇C57BL6小鼠作為載體，利用分子生物學(xué)和報告基因方法考察了三氯卡班對肝臟的作用，同時利用代謝組學(xué)技術(shù)考察三氯卡班對血漿內(nèi)源性代謝物變化的影響。結(jié)果表明，三氯卡班是核受體CAR的激活劑，可以提高肝臟CYP2b10的mRNA表達。同時血漿主要的內(nèi)源性代謝物也產(chǎn)生了顯著性變化，血漿中的脂肪酸比例都呈下降趨勢，肉毒堿與乙酰肉堿的比例都呈上升趨勢，花生四烯酸與肌酸的比例都呈上升趨勢，這都與核受體CAR被激活密切相關(guān)，由此說明利用代謝組學(xué)技術(shù)能夠全面地反映三氯卡班所造成的對機體的影響。

三氯卡班；C57BL6小鼠；激活劑；代謝組學(xué)

三氯卡班(triclocarban, TCC)是一種常用的高效廣譜殺菌劑，屬于藥品及個人護理用品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)中一種，被廣泛應(yīng)用于紡織品、洗衣粉、除臭劑、皮膚護理品、牙膏和傷口消毒劑等產(chǎn)品中，起到殺菌、抑菌和除臭的作用[1]。近年來，隨著人們對其環(huán)境穩(wěn)定性、生物富集性以及生物毒性等性質(zhì)的了解加深，TCC被認定為一種新型的環(huán)境污染物，可能對動植物和人體產(chǎn)生危害。據(jù)有關(guān)報告[2-4]，TCC對哺乳動物有慢性毒性，可能干擾哺乳動物繁殖以及引起人類高鐵血紅蛋白癥。美國加州大學(xué)戴維斯分校的一項研究表明，添加在香皂中的抗菌化學(xué)物質(zhì)TCC，有可能與一些小的非固醇類分子作用，從而影響固醇類受體信號系統(tǒng)，引發(fā)包括癌癥、生殖功能障礙和發(fā)育異常等病癥在內(nèi)的諸多問題[5]。Chen等[5]研究了喂食三氯卡班后雄性老鼠，由睪酮控制的器官如前列腺等會異常增大，說明三氯卡班可以加強睪酮在人體細胞中的基因表達的控制，其很有可能成為一種新的動物體內(nèi)內(nèi)分泌干擾物質(zhì)。同時Ahn等[6]研究也證實了TCC可增強雌激素受體依賴和雄激素受體依賴的基因表達，表現(xiàn)出一種新的內(nèi)分泌干擾化合物的作用機制。Hinther等[7]對青蛙進行研究發(fā)現(xiàn)高濃度的TCC能影響哺乳細胞中甲狀腺激素反應(yīng)基因。而且TCC對哺乳動物的繁殖率及后代成活率有影響，同時對人類可能引起高鐵血紅蛋白癥等。在提高pH和溫度時，TCC的芳香胺C-N健斷裂，可釋放出N-羥基化代謝產(chǎn)物，會增強高鐵血紅蛋白癥的發(fā)生率[4,8]。國內(nèi)的李林朋等[9]研究TCC對人肝細胞(LO2)DNA的損傷效應(yīng)發(fā)現(xiàn)在低暴露劑量(2.38 μmol·L-1)下就可以引起DNA斷裂損傷，這為進一步揭示TCC對人體毒害的機制，更全面地評估TCC對人體健康的風(fēng)險提供了依據(jù)。Yueh等[10]研究發(fā)現(xiàn)核受體組成型雄烷受體CAR在hUGT1ACar小鼠模型中可以被三氯卡班激活，同時激活CYP2b。以上研究說明了TCC長期存在于環(huán)境中對人體健康的風(fēng)險在增加，文獻報道小鼠和人之間同源基因有84%[11]，到現(xiàn)在已經(jīng)有40對小鼠和人類的CYP基因被證實，所以小鼠模型是研究環(huán)境污染物對人體健康危害的理想模型，兩者之間具有可比性。本研究利用小鼠作為載體結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)對TCC進行有效試驗和安全評價來確定其長期環(huán)境暴露對人體健康的潛在危害，為其風(fēng)險評估中動物實驗結(jié)果外推到人提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：Thermo Q EXACTIVE高分辨質(zhì)譜配有DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo公司)，微量移液器(北京萊博潤科生物科技有限公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，Thermo Syncronis C18 1.9 μm，2.1 mm×100 mm(美國Thermo公司)。

試劑：三氯卡班(triclocarban, TCC)，純度≥99.0%，購自美國Sigma Aldrich試劑公司，pRL-TK海腎熒光素酶質(zhì)粒購自美國Promega公司，胎牛血清和HepG2細胞培養(yǎng)液購自美國Invitrogen公司。甲醇、乙腈(色譜純)購自美國Fisher公司，其他試劑為分析純，實驗用純凈水由Millipore Milli-Q A10(美國Millipore公司) 水純化系統(tǒng)制備。實驗所使用試劑均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗動物

C57BL6小鼠，體重約18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，實驗前禁食24 h，自由飲水。

1.3 染毒實驗

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，設(shè)置1個空白對照組和3個實驗組，染毒劑量分別為10 mg·kg-1、30 mg·kg-1和90 mg·kg-1，每天灌胃染毒一次，連續(xù)14 d。末次染毒后，空腹，眼球靜脈取血放置于預(yù)放肝素鈉的離心管中，5 000 g離心10 min，取血漿凍存于-80 ℃冰箱，然后立即將小鼠脫頸椎處死，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗肝臟，凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 RT-qPCR測定肝臟CYP2b10的mRNA表達水平

將肝組織塊在液氮中研磨碎，加入trizol裂解，提取總RNA。CYP2b10和β-actin引物設(shè)計如表1，擴增程序為94 ℃、10 min，(94 ℃、15 s，60 ℃、30 s)×40 cycles。采用2-△△Ct法進行相對定量分析。

1.5 報告基因

按照文獻方法構(gòu)建PXR、CAR表達質(zhì)粒，CYP2B6報告基因質(zhì)粒[12-14]。人肝癌細胞系HepG2于37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。按每孔1×105個細胞的密度將人肝癌細胞HepG2培養(yǎng)于24孔板，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境中過夜。更換無抗生素、含10%活性碳過濾血清的細胞培養(yǎng)液，加入質(zhì)粒Fugene6轉(zhuǎn)染試劑混合物(空質(zhì)粒對照孔用空載體質(zhì)粒代替)。24 h后更換培養(yǎng)液，在試驗孔加入受試物(培養(yǎng)液0.1%體積)，對照孔加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)，每個處理3個孔。作用24 h。陽性對照包括PXR特異性激活劑利福平，CAR特異性激活劑CITCO。使用雙報告基因試劑盒中的裂解液裂解細胞，使用雙報告基因試劑，化學(xué)發(fā)光儀檢測發(fā)光信號。結(jié)果以螢火蟲熒光素酶與內(nèi)參照海腎熒光素酶的比值表示，每個處置為獨立的3孔細胞。

1.6 高分辨質(zhì)譜檢測方法

色譜條件：A相為水(2 mmoL·L-1甲酸銨)，D相為乙腈；梯度洗脫(見表2)，分析時間0～18 min，進樣量5 μL，流速0.25 mL·min-1。質(zhì)譜條件：離子源為ESI(±)，離子源參數(shù)如下，噴霧電壓為2 800 V；蒸發(fā)溫度為350 ℃；鞘氣為35 Arb；輔助氣為10 Arb；毛細管溫度為2 350 ℃；S-lens RF為50?；衔飬?shù)如下，一級全掃描(full scan)；分辨率為70 000；AGC target為1e6；Maximun TT為100 ms；掃描范圍為50～750 m/z。

表1 設(shè)計引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR assay

表2 高分辨質(zhì)譜檢測的液相色譜梯度洗脫條件Table 2 Gradient condition for High Resolution Mass Spectrometer

1.7 多元統(tǒng)計分析

利用SIMCA-P+11軟件計算三氯卡班給藥組與對照組內(nèi)源性代謝物的差異，繪制PCA和PLS-DA模型圖，根據(jù)VIP>1選出具有顯著性差異的內(nèi)源性代謝物用于進一步分析。

1.8 代謝通路分析

我們利用MBRole網(wǎng)站(http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/index.jsp)分析VIP值大于1的主要具有差異的內(nèi)源性代謝物，選擇P值小于0.05的作為三氯卡班影響的主要代謝通路，再利用Cytoscape中的Metscape模型(化合物與酶和基因的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系)構(gòu)建與三氯卡班作用相關(guān)的主要內(nèi)源性代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)圖。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或成組t檢驗進行。與對照組相比，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 三氯卡班對小鼠肝臟CYP2b10 mRNA表達的影響

如圖1，RT-qPCR檢測的結(jié)果顯示肝臟CYP2b10的mRNA表達隨著劑量的增加而顯著提高，90 mg·kg-1的作用最明顯。

圖1 三氯卡班對CYP2b10 mRNA表達的影響(n=5)注：*、**分別表示與對照組相比P<0.05、P<0.01。Fig. 1 Effects of triclocarban (TCC) treatment on CYP2b10 mRNA expression (n=5)Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control.

2.2 三氯卡班對肝臟核受體PXR和CAR的影響

如圖2，報告基因檢測的結(jié)果顯示三氯卡班是hCAR的激活劑，對hPXR無作用，這與小鼠肝臟CYP2b10被誘導(dǎo)結(jié)果一致，說明三氯卡班通過激活CAR而誘導(dǎo)CYP2b10的mRNA表達，雖然通過誘導(dǎo)酶活性可以增強其代謝外源性物質(zhì)的能力，但長期CAR的活化會容易形成肝腫瘤的體內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致肝臟內(nèi)源性代謝物的變化[15]。

圖2 三氯卡班對肝臟核受體hPXR和hCAR的影響(n=3)注：*、**分別表示與對照組相比P<0.05、P<0.01。Fig. 2 Effects of TCC treatment on liver hCAR and hPXR (n=3)Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control.

2.3 內(nèi)源性代謝物的鑒定

如圖3C和圖3D，利用精確質(zhì)量數(shù)達到小數(shù)點5位的精確程度，并利用分子量和分子式確定每個內(nèi)源性物質(zhì)，同時在Tracefounder軟件中建立內(nèi)源性物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫，用于定性分析樣品中每個內(nèi)源性物質(zhì)，人工處理每個內(nèi)源性物質(zhì)的峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積，進行對比獲得相對的含量比值用來進一步分析內(nèi)源性物質(zhì)的變化規(guī)律。

2.4 三氯卡班對小鼠血漿內(nèi)源性代謝物變化的影響

利用SIMCA-P+11軟件計算PCA和PLS-DA，如圖4結(jié)果顯示對照組與給藥組個體能徹底分開，說明選擇給藥90 mg·kg-1小鼠血漿作為檢測對象是合理的。如表3結(jié)果顯示血漿中內(nèi)源性代謝物VIP>1的總共有22種，其中8種內(nèi)源性物質(zhì)的比例是下降的，另14種存在上升趨勢。這結(jié)果說明三氯卡班給藥14 d后影響了小鼠體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的代謝分泌，使它們的含量起了變化，主要變化成分是氨基酸和脂肪酸類物質(zhì)。

圖3 (A)一級正離子全掃描特征的血漿樣品總離子流圖；(B)一級負離子全掃描特征的血漿樣品總離子流圖；(C)利用精確質(zhì)量數(shù)提取的精氨酸色譜圖；(D)利用精確質(zhì)量數(shù)和分子式確定色譜峰是精氨酸Fig. 3 (A) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from positive ion scanning; (B) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (C) Accurate mass number of chromatographic peak rendering for arginine; (D) Chromatographic peak is arginine according to the precise mass number and the formula

圖4 高分辨質(zhì)譜QE代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的PLS-DA模型分析(A)和代謝組學(xué)血漿數(shù)據(jù)的PCA分析(B)Fig. 4 PLS-DA models of Q-Exactive Orbitrap-MS metabolomics data(A) and PCA score plots for comprehensive metabolomic data of plasma samples (B)

表3 主要內(nèi)源性代謝物的平均變化(VIP value>1)Table 3 The average changes of main metabolites (VIP value>1)

2.5 血漿中的差異性代謝物代謝通路分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

如表4，三氯卡班影響血漿內(nèi)源性物質(zhì)代謝的通路主要有8條通路，P值小于0.05，最主要的是精氨酸和脯氨酸代謝通路與ABC轉(zhuǎn)運體通路。如圖5，整個代謝網(wǎng)絡(luò)包括95個nodes，116個edges，花生四烯酸與CYP450酶表達具有相關(guān)性，從表3數(shù)據(jù)顯示在小鼠血漿中的花生四烯酸的比例呈上升趨勢，與其相關(guān)聯(lián)的CYP450酶活性也會上升，這與酶活性檢測的結(jié)果一致。說明三氯卡班通過調(diào)控花生四烯酸的變化影響酶的活性。

圖5 內(nèi)源性代謝物的化合物與酶和基因代謝網(wǎng)絡(luò)的分析Fig. 5 Compound-Reaction-Enzyme-Gene network analysis of endogenous metabolites

3 討論(Discussion)

代謝組學(xué)是研究生物體自身生理病理狀態(tài)和生物體對外源性物質(zhì)的生化效應(yīng)的有力手段，它所關(guān)注的是代謝通路中分子量小于1 000的小分子代謝物的變化。它不僅研究代謝產(chǎn)物濃度的變化，還可以研究分子動態(tài)信息，如溶液和完整組織中的分子隨著時間的推移在濃度或結(jié)構(gòu)上的改變。代謝組學(xué)利用波譜或光譜學(xué)方法對生物體液及組織中的代謝產(chǎn)物進行監(jiān)測，將所得數(shù)據(jù)通過多元統(tǒng)計分析和模式識別方法進行分析，了解由外源性物質(zhì)的作用而引起的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，并將這種變化與核磁共振譜或質(zhì)譜的譜圖模式對應(yīng)起來，從而找出外源性物質(zhì)作用的靶器官和作用位點，進而確定與之相關(guān)的生物標(biāo)記物，確定藥物或毒物作用機制，進行毒性分類和篩選。基于代謝組學(xué)這一原理，它已廣泛應(yīng)用于藥物毒性、遺傳變異、環(huán)境毒理和疾病診斷等方面。

本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)研究三氯卡班對小鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)合分子生物學(xué)與報告基因的實驗結(jié)果顯示三氯卡班是核受體CAR的激活劑，但我們預(yù)實驗的結(jié)果顯示三氯卡班低于10 mg·kg-1是不會引起CYP2b10的mRNA表達和酶活性的提高，說明三氯卡班的效應(yīng)是與濃度相關(guān)的。但三氯卡班引起的長期CAR的活化會容易形成肝腫瘤的體內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致肝臟內(nèi)源性代謝物的變化，從而影響血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的變化。能量代謝方面(圖6)，與對照組相比，血漿中的脂肪酸比例都呈下降趨勢，肉毒堿與乙酰肉堿的比例都呈上升趨勢，兩者的趨勢正好印證了小鼠體內(nèi)脂肪酸的變化規(guī)律，脂肪酸主要在肝臟中進行氧化分解，說明可能是肝臟的核受體被激活后相應(yīng)的機體代謝能力增強，需要的能量也相應(yīng)增多所致。氨基酸方面，與對照組相比花生四烯酸與肌酸的比例都呈上升趨勢，花生四烯酸與CYP450酶的表達有相關(guān)性，隨著其在血漿中的比例上升相應(yīng)CYP450酶的活性也會被相應(yīng)激活，這與分子生物學(xué)的結(jié)果一致。肌酸可以快速增加肌肉力量，促進新肌增長，加速疲勞恢復(fù)，提高爆發(fā)力。肌酸在人體內(nèi)儲存越多，力量及運動能力也越強，所以從一個側(cè)面說明核受體CAR的激活導(dǎo)致機體整個生理機能的變化。本研究結(jié)果說明三氯卡班經(jīng)過14 d給藥后，與能量代謝、氨基酸代謝等多種代謝通路的異常相關(guān)，這都可能是核受體CAR被激活造成的結(jié)果，由此說明利用代謝組學(xué)技術(shù)能夠全面地反映三氯卡班對機體所造成的影響，為對人體健康的潛在危害進行評估提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

表4 利用MBRole的血漿代謝通路分析結(jié)果Table 4 Result for plasma pathway analysis with MBRole

圖6 脂肪酸代謝通路Fig. 6 The metabolic pathways related to fatty acid metabolism

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◆

Metabolomics Study on the Effect of Triclocarban on the Endogenous Substances in Mice Plasma

Zhou Lili, Xie Wenping, Li Haishan#, Chen Huiming, Yu Wenlian, Cui Yuan, Liu Wei, Song Naining, Shen Guolin*

Institute of Chemicals Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China

3 August 2016 accepted 24 October 2016

Triclocarban was recently identified as an environmental pollutant that may cause harm to plants, animals and humans. To explore the mechanism underlying this observation, the effects of triclocarban on the liver were investigated using molecular biology and reporter gene methods with C57BL/6 mice as the carrier. Additionally, we used metabolomics technology to investigate the impact of triclocarban on endogenous metabolites in the plasma. The results demonstrated that triclocarban activated the CAR nuclear receptor and improved hepatic CYP2b10 mRNA expression. Furthermore, endogenous plasma metabolites related to CAR nuclear receptor activation were significantly altered. Specifically, plasma aliphatic acid levels were reduced, while carnitine, acetyl carnitine, arachidonic acid and creatine concentrations were elevated. Thus, we conclude that using metabolomics technology can reveal triclocarban-induced effects on the body.

triclocarban; C57BL6 mice; activator; metabolomics

北京市自然科學(xué)基金青年基金(8164071)；質(zhì)檢公益項目(201510203-02，201510024)；院基本科研業(yè)務(wù)費專項基金(2015JK004，2016JK007，2017JK009，2017JK047)

周麗麗(1982-)，女，助理研究員，研究方向為化學(xué)品安全，E-mail：zhoull@aqsiqch.ac.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: shengl@aqsiqch.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160803001

2016-08-03 錄用日期：2016-10-24

1673-5897(2017)2-147-08

X171.5

A

沈國林(1980-)，男，副研究員，主要從事化學(xué)品安全評價研究。

共同通訊作者簡介：李海山(1972-)，男，研究員，主要從事毒理學(xué)研究，承擔(dān)國家自然科學(xué)基金課題多項，發(fā)表SCI論文近50篇。

# 共同通訊作者(Corresponding author)， E-mail: lihs@aqsiqch.ac.cn

周麗麗, 謝文平, 李海山, 等. 三氯卡班對小鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)影響的代謝組學(xué)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(2): 147-154

Zhou L L, Xie W P, Li H S, et al. Metabolomics study on the effect of triclocarban on the endogenous substances in mice plasma [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 147-154 (in Chinese)