水培實(shí)驗(yàn)中不同粒徑納米TiO2對(duì)蘆葦種子發(fā)芽和植株生長(zhǎng)和生理的影響

文雙喜, 王毅力,2,*

1. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 北京 1000832. 北京林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 100083

水培實(shí)驗(yàn)中不同粒徑納米TiO2對(duì)蘆葦種子發(fā)芽和植株生長(zhǎng)和生理的影響

文雙喜1, 王毅力1,2,*

1. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 北京 1000832. 北京林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 100083

納米二氧化鈦(TiO2-NPs)是目前應(yīng)用最為廣泛的納米材料之一，進(jìn)入到天然濕地和人工濕地中的TiO2-NPs會(huì)在濕地生物、基質(zhì)、水體之間進(jìn)行遷移轉(zhuǎn)化和歸趨。目前針對(duì)TiO2-NPs對(duì)濕地植物蘆葦?shù)亩拘匝芯亢苌?。本文采用水培?shí)驗(yàn)方法，研究了不同粒徑TiO2對(duì)蘆葦種子發(fā)芽和植株生長(zhǎng)的影響，解析了TiO2-NPs對(duì)蘆葦?shù)纳鷳B(tài)毒理效應(yīng)。研究結(jié)果表明：幾種粒徑的TiO2-NPs在較低濃度(≤200 mg·L-1)下對(duì)蘆葦種子發(fā)芽均具有一定的促進(jìn)作用，高濃度處理會(huì)抑制蘆葦種子發(fā)芽；當(dāng)TiO2-NPs濃度為500 mg·L-1時(shí)，處理后的蘆葦種子的發(fā)芽指標(biāo)較空白對(duì)照均出現(xiàn)顯著降低，4 nm和20 nm的TiO2-NPs對(duì)蘆葦種子發(fā)芽的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為1 075 mg·L-1和1 680 mg·L-1。 TiO2-NPs對(duì)蘆葦植株的毒害作用表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)速度減緩甚至停滯、葉片失綠、植株萎焉或枯死、蘆葦?shù)苟~面積增長(zhǎng)率降低，并且TiO2-NPs的粒徑越小、濃度越高毒害作用越明顯。隨TiO2-NPs濃度升高，處理后蘆葦葉片的葉綠素含量和植株體內(nèi)的Mg含量均降低，根系的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)均升高，而且越小粒徑的TiO2-NPs對(duì)蘆葦?shù)奶幚硇Ч矫黠@。3種粒徑的TiO2-NPs均能進(jìn)入蘆葦體內(nèi)，粒徑越小、濃度越高進(jìn)入的量越多，但是TiO2-NPs比較難以從根遷移轉(zhuǎn)運(yùn)至莖和葉。

納米二氧化鈦；蘆葦；生態(tài)毒理；累積；分布

納米技術(shù)是21世紀(jì)最為重要和發(fā)展最為迅速的研究領(lǐng)域之一。近年來(lái)，應(yīng)用在不同領(lǐng)域的商用納米材料在急劇增加[1]。據(jù)保守估計(jì)，到2020年全世界僅人工金屬氧化物納米材料的年產(chǎn)量就將由2012年的270 041 t增加到1 663 168 t[2]。納米二氧化鈦(TiO2-NPs)作為一種人工金屬氧化物納米材料，具有優(yōu)異的吸收紫外線能力、高效的光催化效果、良好的抗光化學(xué)腐蝕能力及導(dǎo)電能力，因而被大量應(yīng)用在醫(yī)療、食品、化妝品、廢水處理、能量?jī)?chǔ)存、油漆及建筑材料等關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的各行各業(yè)中[1,3-5]，預(yù)計(jì)其全球年產(chǎn)量在2025年將達(dá)到2 500 000 t[6]。

大量的納米材料在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用的過(guò)程中將不可避免地被釋放到周圍環(huán)境中[7]。研究表明，TiO2-NPs已經(jīng)在城市污染水處理廠的出水、污泥以及地表水體中均有檢出。付佳璐等[8]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江口外取水點(diǎn)水樣中的納米顆粒形態(tài)的鈦濃度達(dá)89.0 μg·L-1；劉志遠(yuǎn)等[9]報(bào)道，曲陽(yáng)污水處理廠水體中的鈦濃度達(dá)到了768 μg·L-1；Kiser等[10]研究發(fā)現(xiàn)亞利桑那州生活污水廠中鈦濃度在0.1～3.0 mg·L-1的范圍內(nèi)波動(dòng)。

自然水體是經(jīng)多種途徑釋放到環(huán)境介質(zhì)中的納米顆粒的最終受納體，因此進(jìn)入到天然濕地和人工濕地中的TiO2-NPs會(huì)在濕地生物、基質(zhì)、水體之間進(jìn)行遷移轉(zhuǎn)化和歸趨。已有的研究表明，植物可以作為納米材料進(jìn)入環(huán)境及其在食物鏈中的向上傳遞和生物富集重要通道之一[11]。因此，研究納米材料對(duì)濕地植物的影響特征可以揭示該材料在環(huán)境中的歸趨、生態(tài)毒理效應(yīng)及其去除機(jī)制。蘆葦是濕地中常見的植物，目前關(guān)于納米材料對(duì)蘆葦污染生態(tài)效應(yīng)方面的文獻(xiàn)還比較缺乏。因此，本研究選取蘆葦作為研究對(duì)象，考察不同粒徑TiO2-NPs對(duì)蘆葦種子發(fā)芽、植株生長(zhǎng)形態(tài)和生理特征的影響，同時(shí)研究蘆葦植株對(duì)不同粒徑TiO2-NPs的吸收、累積及TiO2-NPs進(jìn)入植株后的分布特征。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用蘆葦種子購(gòu)自南京景香園有限公司，所用蘆葦植株(展葉期，采于當(dāng)年5月)采自圓明園九州景區(qū)池塘。SOD試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，培養(yǎng)植物所用1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液按照文獻(xiàn)[12]中的方法配制。

4 nm、20 nm、50 nm的TiO2-NPs購(gòu)于北京安特普納科貿(mào)責(zé)任有限公司(含量≥99.5%；銳鈦礦:金紅石 = 71:29)，本研究中對(duì)3種粒徑TiO2-NPs的TEM圖像、各粒徑不同濃度TiO2-NPs在25 ℃、pH = 6.5±0.1的1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位值及XRD圖譜(20 nm)進(jìn)行了表征。

主要儀器：帶能譜儀的透射電鏡(TEM-EDX, JEM-2100, JEOL, Japan)；Reichert超薄切片機(jī)；X射線衍射儀(XRD, BruckerD-8 Diffractometer, 德國(guó))；Zeta電位分析儀(Zetasizer 2000, Malvern, UK)；光照培養(yǎng)箱(MGC-300B, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPS-1000IV, Shimadzu, 日本)；氣浴恒溫振蕩器(RH-8811，常州潤(rùn)華電器有限公司)；7230 型分光光度計(jì)(上海)；立式高速冷凍離心機(jī)(GL-25MS, 匡貝實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 種子發(fā)芽試驗(yàn)

為了保證發(fā)芽試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，挑選形態(tài)豐滿、品相良好的蘆葦種子(百粒重0.0334 g)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，考察不同濃度的TiO2-NPs對(duì)蘆葦種子的發(fā)芽影響。

種子和實(shí)驗(yàn)器材消毒滅菌，TiO2-NPs處理濃度分別為 0, 20, 100, 200, 500, 1 000, 2 000 mg·L-1，按文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行種子暴露處理，按文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每天(6 d)記錄種子發(fā)芽數(shù)，發(fā)芽結(jié)束測(cè)定種子發(fā)芽重量，所有發(fā)芽試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。按照文獻(xiàn)[15]中的公式計(jì)算蘆葦種子的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及活力指數(shù)等發(fā)芽指標(biāo)。

1.3 植株暴露培養(yǎng)

為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，所有蘆葦植株從圓明園取回后都先放入裝有1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液的50 cm×40 cm×35 cm玻璃水族箱中25 ℃下馴化培養(yǎng)15 d。

取馴化后高度與生長(zhǎng)情況相當(dāng)?shù)奶J葦植株放入裝有含不同濃度TiO2-NPs的1/4濃度霍格蘭氏植物培養(yǎng)液的1 000 mL燒杯中進(jìn)行TiO2-NPs暴露培養(yǎng)。把裝有植株的燒杯放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：白天/黑夜溫度為(26±1)℃/(22±1) ℃；光照/黑暗周期為16 h/8 h；光照強(qiáng)度為300 μE·m-2·s-1，培養(yǎng)時(shí)間為12 d。

TiO2-NPs的濃度梯度設(shè)置為：0, 1, 10, 100, 200和500 mg·L-1，每個(gè)燒杯放入4株蘆葦植株，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，每天記錄植株生長(zhǎng)情況。

1.4 植株生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

每2天取1.3節(jié)中經(jīng)不同濃度TiO2-NPs溶液培養(yǎng)的蘆葦樣品進(jìn)行MDA、葉綠素含量測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束取樣進(jìn)行SOD活性測(cè)定。 SOD活性和MDA含量取根進(jìn)行測(cè)定。

其中，SOD酶活性按南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定；MDA和葉綠素含量分別按照文獻(xiàn)[16]和[17]中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 TiO2-NPs在植株體內(nèi)的分布與累積

培養(yǎng)結(jié)束，取1.3中經(jīng)不同濃度TiO2-NPs溶液培養(yǎng)的蘆葦植株分成根、莖、葉3部分按文獻(xiàn)[18]中的方法進(jìn)行TEM-EDX觀察。另取適量樣品按文獻(xiàn)[19]中的方法利用ICP-MS測(cè)定樣品中的Ti含量。同時(shí)，由于鎂(Mg)是植物正常生長(zhǎng)所必需的微量元素之一，是構(gòu)成葉綠素的中心分子，有促進(jìn)植物光合碳同化的作用，考慮到Mg含量和葉綠素之間的關(guān)系，在測(cè)定Ti含量的同時(shí)也測(cè)定樣品中Mg的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有處理均設(shè)3次重復(fù)，以 3 個(gè)平行組數(shù)據(jù)計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，采用ANOVA(Analysis of variance, LSD檢驗(yàn)法)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P < 0.05)。

2 結(jié)果與討論 (Results and discussion)

2.1 TiO2-NPs表征結(jié)果

3種粒徑TiO2-NPs的TEM圖像、不同濃度TiO2-NPs在25 ℃、pH = 6.5±0.1的1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位值及XRD圖譜(20 nm)如圖1所示。

圖1a～c中的TEM圖像顯示各粒徑的TiO2-NPs均呈圓形、橢圓形或長(zhǎng)方形顆粒，平均粒徑與商家所標(biāo)基本吻合；TiO2-NPs(20 nm)的XRD圖譜如圖1d所示，在25.24°、37.7°、48.0°、55.04°、62.76°、70.22°和75.06°檢測(cè)到了峰的存在，其中25.24° 到48.0°之間的峰為區(qū)分特征峰，與粉體衍射標(biāo)準(zhǔn)卡聯(lián)合委員會(huì)(JCPDS)數(shù)據(jù)庫(kù)No.21-1272號(hào)卡片吻合，表明本試驗(yàn)所用TiO2-NPs的主要成分為銳鈦礦，滿足試驗(yàn)需求。從圖1e中可以看出：各粒徑不同濃度的TiO2-NPs在1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位整體數(shù)值范圍在±10.0～±30.0之間，說(shuō)明分散體系不太穩(wěn)定[20]。因此，在培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中需要每天定時(shí)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行攪動(dòng)數(shù)次，保證 TiO2-NPs顆粒在溶液中保持良好的分散狀態(tài)。

2.2 TiO2-NPs對(duì)蘆葦種子發(fā)芽的影響

不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs溶液處理后的蘆葦種子發(fā)芽率及發(fā)芽重量見圖2，主要發(fā)芽指數(shù)如表1所示。

從圖2a中可以看到，3種粒徑的TiO2-NPs在濃度<200 mg·L-1時(shí)對(duì)蘆葦種子發(fā)芽的促進(jìn)不明顯，且粒徑間的差異性不顯著。之前也有低濃度的納米材料促進(jìn)植物發(fā)芽的報(bào)道，Khodakovskaya等[21]發(fā)現(xiàn)：濃度為10～40 mg·L-1的多壁碳納米管(MWCNTs)能夠促進(jìn)西紅柿種子的發(fā)芽和其植株的生長(zhǎng)，可能是由于碳納米管可以穿透種子外皮從而促進(jìn)西紅柿種子對(duì)水分的吸收，而水分在種子發(fā)芽過(guò)程中起著十分重要的作用，因?yàn)楦稍锏姆N子要萌發(fā)需要一定的水分來(lái)促進(jìn)種子的新陳代謝和生長(zhǎng)。但隨著暴露濃度的升高，3種粒徑處理均使蘆葦種子的發(fā)芽率下降，當(dāng)濃度為500 mg·L-1時(shí)，3種粒徑TiO2-NPs處理的蘆葦種子發(fā)芽率較空白對(duì)照均出現(xiàn)顯著降低，4 nm和20 nm的TiO2-NPs對(duì)蘆葦種子發(fā)芽的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為1 075和1 680 mg·L-1，當(dāng)濃度為2 000 mg·L-1時(shí)，3種粒徑TiO2-NPs處理的蘆葦種子的發(fā)芽率由空白處理的85%分別下降到24%(4 nm)、30%(20 nm)和46.67%(50 nm)。

圖1 TiO2-NPs的TEM表征(a-4 nm；b-20 nm；c-50 nm)以及XRD圖譜(d-20 nm)和25 ℃下不同濃度的TiO2-NPs在1/4濃度的霍格蘭氏植物培養(yǎng)液中的Zeta電位Fig. 1 TEM images (a-4 nm; b-20 nm; c-50 nm) and physical properties of TiO2-NPs: (d-20 nm) XRD patterns; (e) zeta potential vs. different TiO2-NPs concentrations in 25% strength Hoagland nutrient solution at 25 ℃

圖2 TiO2-NPs處理后蘆葦種子的發(fā)芽率(a)和發(fā)芽重量(b)注：*代表不同處理與空白對(duì)照之間存在顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Germination rates (a) and seedling masses (b) of Phragmites australis seeds under TiO2-NPs treatmentNote: *indicates a significant difference between the treatment and the control groups (P<0.05).

圖3 不同粒徑的TiO2-NPs處理下蘆葦植株的生長(zhǎng)形態(tài)Fig. 3 Phragmites australis cultured under different sizes of TiO2-NPs

從圖2b中可以看出，TiO2-NPs處理后蘆葦種子發(fā)芽幼苗重量的變化趨勢(shì)基本與發(fā)芽率的變化趨勢(shì)一致，當(dāng)濃度為2 000 mg·L-1時(shí)，3種粒徑TiO2-NPs處理的蘆葦種子的發(fā)芽幼苗重量由空白處理的43 mg分別下降到9 mg(4 nm)、14 mg(20 nm)和22 mg(50 nm)?？赡苁且?yàn)楦邼舛鹊腡iO2-NPs處理后進(jìn)入蘆葦種子的TiO2-NPs量增加，對(duì)蘆葦種子的生理機(jī)能造成損傷，并且隨著顆粒尺度變小，TiO2-NPs表面晶格破損程度更高，產(chǎn)生活性位點(diǎn)更多，形成超氧自由基及其他活性氧化物質(zhì)(ROS)更多，氧化壓力(OS)提高，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞種子細(xì)胞膜，因此對(duì)蘆葦種子發(fā)芽產(chǎn)生抑制作用[22]。

由表1可以看出，各粒徑TiO2-NPs處理的蘆葦種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)也是在低濃度下有所升高，高濃度處理則快速下降，且粒徑越小變化幅度越大，說(shuō)明粒徑越小的TiO2-NPs對(duì)蘆葦種子的發(fā)芽影響作用越大。

2.3 TiO2-NPs對(duì)蘆葦植株生長(zhǎng)與生理的影響

2.3.1 植株生長(zhǎng)形態(tài)

不同粒徑的TiO2-NPs處理下蘆葦植株的生長(zhǎng)形態(tài)如圖3所示。

從圖中可以看出：經(jīng)過(guò)12 d的培養(yǎng)后，空白對(duì)照(0 mg·L-1)處理的蘆葦植株整體生長(zhǎng)狀況良好，葉片無(wú)失綠現(xiàn)象發(fā)生；不同粒徑的TiO2-NPs處理后，蘆葦?shù)纳L(zhǎng)狀況均受到不同程度的抑制，表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)速度減緩甚至停滯，葉片失綠，植株萎焉，且TiO2-NPs的粒徑越小，上述影響越顯著。Asli等[23]研究發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs對(duì)玉米的生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。培養(yǎng)于TiO2-NPs溶液中的玉米其根部的導(dǎo)水率降低，且其根細(xì)胞的細(xì)胞壁孔徑從空白培養(yǎng)下的6.6 nm降低到了3 nm，從而導(dǎo)致玉米植株的蒸騰作用減弱，致使葉片的生長(zhǎng)受到了抑制。這主要是因?yàn)門iO2-NPs的物理阻塞作用致使玉米的根細(xì)胞細(xì)胞壁的孔徑變小，導(dǎo)致根系對(duì)水分的吸收能力減弱，從而抑制了葉片的蒸騰作用，抑制了葉片的生長(zhǎng)。

表1 TiO2-NPs處理對(duì)蘆葦種子發(fā)芽的影響Table 1 The germination of Phragmites australis seeds treated with TiO2-NPs

2.3.2 蘆葦?shù)苟~面積變化

不同粒徑的不同濃度TiO2-NPs處理對(duì)蘆葦植株倒二葉面積的影響如表2所示。

由表2可知，不同粒徑的TiO2-NPs培養(yǎng)處理的蘆葦?shù)苟~面積的增長(zhǎng)率均隨著處理濃度的升高而顯著降低。在同一高濃度TiO2-NPs處理下，粒徑越小蘆葦?shù)苟~面積的增長(zhǎng)率也越小，說(shuō)明在高濃度處理下，TiO2-NPs粒徑越小對(duì)蘆葦?shù)纳L(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)。

2.3.3 葉綠素與Mg含量

不同粒徑、不同濃度的TiO2-NPs處理對(duì)蘆葦葉片葉綠素含量的影響結(jié)果如圖4所示。培養(yǎng)12 d后，空白處理(0 mg·L-1)下的蘆葦葉片的總?cè)~綠素含量在12 d的培養(yǎng)期間基本穩(wěn)定在同一濃度水平；而不同粒徑TiO2-NPs處理下蘆葦葉綠素含量均隨處理濃度的升高而下降，且粒徑越小下降幅度越大。在經(jīng)過(guò)濃度為500 mg·L-1的不同粒徑的TiO2-NPs暴露培養(yǎng)12 d后，蘆葦葉片的總?cè)~綠素含量從剛移栽的2.67 mg·L-1分別下降到1.55(4 nm)、1.83(20 nm)和1.95 mg·L-1(50 nm)。

表2 TiO2-NPs處理對(duì)蘆葦植株倒二葉面積的影響Table 2 The area of the top second leaf of Phragmites australis treated with TiO2-NPs

注：同列數(shù)值后的不同字母代表處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

Note: Different letters in the same column indicate a significant difference at P<0.05.

圖4 不同濃度TiO2-NPs處理后蘆葦植株葉綠素含量(a-4 nm; b-20 nm; c-50 nm) Fig. 4 Chlorophyll content of Phragmites australis cultured under different TiO2-NPs concentrations (a-4 nm; b-20 nm; c-50 nm)

圖5 不同濃度TiO2-NPs處理后蘆葦植株不同部位Mg含量的變化(a-根; b-莖; c-葉)Fig. 5 Mg content of Phragmites australis cultured under different TiO2-NPs concentrations (a-roots; b-stems; c-leaves)

從圖5中可以看出，隨著暴露培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和TiO2-NPs處理濃度的升高蘆葦植株體內(nèi)不同組織部位的Mg含量均出現(xiàn)不同程度的減少，整體變化趨勢(shì)與葉片總?cè)~綠素含量的變化趨勢(shì)相仿。說(shuō)明TiO2-NPs處理影響了蘆葦植株對(duì)Mg的吸收，進(jìn)而影響到了植株葉綠素的合成。

2.3.4 SOD活性和MDA含量

SOD是生物體內(nèi)清除自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷的首要物質(zhì)。它可阻止氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害并修復(fù)受損細(xì)胞[24]。不同粒徑、不同濃度的TiO2-NPs處理對(duì)蘆葦植株SOD酶活性和MDA含量的影響結(jié)果如圖6所示。從圖6a中可知：培養(yǎng)結(jié)束后隨著TiO2-NPs濃度的不斷升高，蘆葦根系的SOD活性也不斷增強(qiáng)，且TiO2-NPs的粒徑越小蘆葦植株體內(nèi)的SOD活性越高，可能是因?yàn)榱叫〉腡iO2-NPs更容易進(jìn)入蘆葦體內(nèi)，從而對(duì)蘆葦植株產(chǎn)生更強(qiáng)的毒害作用，致使對(duì)蘆葦?shù)难趸{迫水平升高。當(dāng)TiO2-NPs濃度升高到500 mg·L-1時(shí)，不同粒徑TiO2-NPs處理的蘆葦根系的SOD活性從空白處理的25.52 U·g-1FW分別升高到88.60(4 nm)、71.59(20 nm)和60.57 U·g-1FW(50 nm)。表明TiO2-NPs對(duì)蘆葦具有一定的毒害作用，蘆葦體內(nèi)SOD活性升高以清除納米脅迫產(chǎn)生的ROS，各種酶活性的調(diào)節(jié)是植物自我保護(hù)的體現(xiàn)。

圖6b～d表明了蘆葦根系的MDA含量與不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs暴露培養(yǎng)處理的關(guān)系，由圖中可以看到：空白處理下的蘆葦根系的MDA含量在整個(gè)培養(yǎng)期間(0～12 d)內(nèi)都保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，沒有出現(xiàn)大幅波動(dòng)；但當(dāng)各粒徑TiO2-NPs濃度為1～500 mg·L-1時(shí)，蘆葦根系內(nèi)的MDA水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的推進(jìn)而不斷升高，隨著TiO2-NPs濃度的升高而快速上升，并且粒徑越小上升幅度越大。不同粒徑在TiO2-NPs濃度為500 mg·L-1時(shí)蘆葦根系的MDA含量由移栽時(shí)的1.35 μmol·g-1分別上升到4.33(4 nm)、3.81(20 nm)和3.50 μmol·g-1(50 nm)，分別出現(xiàn)了高達(dá)320.74%、282.22%和259.26%的增長(zhǎng)。表明TiO2-NPs對(duì)蘆葦有一定的毒害作用，能迫使蘆葦植株體內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生大量MDA，且TiO2-NPs的粒徑越小對(duì)蘆葦?shù)亩竞ψ饔迷綇?qiáng)。

2.4 TiO2-NPs顆粒在蘆葦植株體內(nèi)的分布

經(jīng)500 mg·L-1不同粒徑TiO2-NPs暴露培養(yǎng)12 d后，蘆葦植株各組織部位切片的TEM-EDX分析結(jié)果如圖7所示。

圖6 不同濃度TiO2-NPs處理對(duì)蘆葦根系SOD酶活性(a)和MDA(b-4 nm; c-20 nm; d-50 nm)含量的影響Fig. 6 SOD activity (a) and MDA content (b-4 nm; c-20 nm; d-50 nm) of Phragmites australis roots treated with TiO2-NPs

圖7 500 mg·L-1 TiO2-NPs處理蘆葦植株不同部位的TEM-EDX觀察:根(a-4 nm; c-20 nm; e-50 nm); 莖(b-4 nm; d-20 nm; f-50 nm); 葉(g-20 nm); EDX掃描表明了Ti的存在(h)Fig. 7 TEM analysis of TiO2-NPs distribution in plants exposed to 500 mg·L-1 of TiO2-NPs: roots (a-4 nm; c-20 nm; e-50 nm); stems (b-4 nm; d-20 nm; f-50 nm); leaves (g-20 nm); EDX analysis of the bright zone showing the presence of Ti (h)

圖8 ICP-MS測(cè)定Ti在蘆葦根(a)、莖(b)和葉(c)里的累積量Fig. 8 ICP-MS observations of Ti accumulation in Phragmites australis: (a) roots; (b) stems; (c) leaves

從圖中可以看出，3種粒徑TiO2-NPs處理的蘆葦植株根中都發(fā)現(xiàn)了顆粒沉積物的存在，且粒徑越小蘆葦根中的沉積物越多；4 nm和20 nm TiO2-NPs處理的蘆葦莖中都發(fā)現(xiàn)了顆粒沉積物的存在，但是要明顯的少于相應(yīng)根中的沉積量，而50 nm TiO2-NPs處理的蘆葦莖中則觀察不到明顯的沉積物；3種粒徑處理的蘆葦葉中都觀察不到明顯沉積物存在。EDX能譜分析結(jié)果表明顆粒沉積物中有很高含量的Ti存在，表明顆粒沉積物應(yīng)該為進(jìn)入蘆葦體內(nèi)的TiO2-NPs顆粒。說(shuō)明在12 d的培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)蘆葦植株根吸收的TiO2-NPs只有少部分能被轉(zhuǎn)運(yùn)到了蘆葦?shù)那o中，而這些顆粒沉降物基本不能從莖中轉(zhuǎn)移到蘆葦?shù)娜~片中。

2.5 Ti在蘆葦體內(nèi)的累積量

通過(guò)ICP-MS檢測(cè)經(jīng)不同粒徑、不同濃度TiO2-NPs暴露培養(yǎng)后蘆葦植株不同組織部位的Ti元素累積量(圖8)，發(fā)現(xiàn)各粒徑TiO2-NPs處理后Ti在蘆葦根系和莖里的累積量均隨著TiO2-NPs處理濃度的升高而不斷增加，且增加量隨粒徑的增大而減少。

當(dāng)TiO2-NPs濃度為500 mg·L-1時(shí)不同粒徑培養(yǎng)處理的蘆葦根中的Ti含量分別可以達(dá)到993(4 nm)、829(20 nm)和722 μg·g-1(50 nm)，蘆葦莖中的Ti累積量分別可達(dá)45(4 nm)、28(20 nm)和23 μg·g-1(50 nm)，根系中Ti含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于莖中的Ti含量，證明TiO2-NPs顆粒容易被蘆葦根系吸收，但是比較難從根系中向上轉(zhuǎn)移到莖里；3種粒徑TiO2-NPs培養(yǎng)處理的蘆葦葉片中只有在4 nm、濃度大于100 mg·L-1的TiO2-NPs暴露處理下才檢測(cè)到了Ti的存在，其他處理蘆葦葉片中的含量低于檢測(cè)限，這和組織切片的TEM觀察結(jié)果相一致，證明在12 d的培養(yǎng)時(shí)期里各粒徑TiO2-NPs都很難從莖中運(yùn)輸至葉片，且粒徑越大轉(zhuǎn)移運(yùn)輸難度越大。

[1] Hossain F, Perales-perez O J, Hwang S, et al. Antimicrobial nanomaterials as water disinfectant: Applications, limitations and future perspectives [J]. Science of the Total Environment, 2014, 466-467: 1047-1059

[2] He X J, Aker W G, Fu P P, et al. Toxicity of engineered metal oxide nanomaterials mediated by nano-bio-eco-interactions: A review and perspective[J]. Environmental Science: Nano, 2015, 2: 434-438

[3] Aitken R J, Chaudhry M Q, Boxall A B A, et al. Manufacture and use of nanomaterials: Current status in the UK and global trends [J]. Occupational Medicine-Oxford, 2006, 56: 300-306

[4] Sharma V K. Aggregation and toxicity of titanium dioxide nanoparticles in aquatic environment—A review [J]. Journal of Environmental Science and Health, Part A Toxic, 2009, 44: 1485-1495

[5] Weng Z Y, Guo H, Liu X M, et al. Nano-structured TiO2for energy conversion and storage [J]. RSC Advance, 2013, 3: 24758-24775

[6] Robichaud C O, Uuar A E, Darby M R, et al. Estimates of upper bounds and trends in nano-TiO2production as a basis for exposure assessment [J]. Environmental Science Technology, 2009, 43: 4227-4233

[7] Macwan D P, Dave P N, Chaturvedi S. A review on nano-TiO2sol-gel type syntheses and its applications [J]. Journal of Materials Science, 2011, 46: 3669-3686

[8] 付佳露, 楊毅, 彭歡, 等. 長(zhǎng)江口水環(huán)境中納米顆粒物初探[J]. 環(huán)境科學(xué), 2011, 32(2): 1024-1031

Fu J L, Yang Y, Peng H, et al. Study on nanoparticles in Yangtze Estuary [J]. Environmental Science, 2011, 32(2): 1024-1031 (in Chinese)

[9] 劉志遠(yuǎn), 于水利, 劉貴彩, 等. 不同消解方法對(duì)納米二氧化鈦濃度測(cè)定的影響[J]. 環(huán)境化學(xué), 2013, 32(4): 666-669

Liu Z Y, Yu S L, Liu G C, et al. Effect of different digesting methods on the detection of titanium dioxide nanoparticles concentration [J]. Environmental Chemistry, 2013, 32(4): 666-669 (in Chinese)

[10] Kiser M A, Westerhoff P, Benn T, et al. Titanium nanomaterial removal and release from wastewater treatment plants [J]. Environmental Science and Technology, 2009, 43(17): 6757-6763

[11] Remya N, Saino H V, Baiju G N, et al. Nanoparticulate material delivery to plants [J]. Plant Science, 2010, 179: 154-163

[12] Gao X P, Zou C Q, Wang L J, et al. Silicon decreases transpiration rate and conductance from stomata of maize plant [J]. Journal of Plant Nutrition, 2006, 29: 1637-1647

[13] Song U, Shin M, Lee G, et al. Functional analysis of TiO2nanoparticle toxicity in three plant species [J]. Biological Trace Element Research, 2013, 155: 93-103

[14] Lin D, Xing B. Phytotoxicity of nanoparticles: Inhibition of seed germination and root growth[J]. Environmental Pollution, 2007, 150: 243-250

[15] 肖密. 哈茨木霉T2-16對(duì)西瓜枯萎病防治效果及機(jī)理初探[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015

Xiao M. Effect and mechanism of trichoderma inducing watermelon to resistance Fusarium wilt [D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2015 (in Chinese)

[16] Buege J A, Aust J D. Microsomal lipid peroxidation [J]. Methods in Enzymology, 1978, 52: 302-310

[17] 楊遠(yuǎn)強(qiáng). 納米氧化銅的植物吸收累積與毒性效應(yīng)初探 [D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2012

Yang Y Q. The uptake, accumulation and phytotoxicity of CuO nanoparticles[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2012 (in Chinese)

[18] Larue C, Laurette J, Herlin-boime N, et al. Accumulation, translocation and impact of TiO2nanoparticles in wheat (Triticum aestivum spp.): Influence of diameter and crystal phase [J]. Science of the Total Environment, 2012, 431: 197-208

[19] 巴翠蘭. 納米二氧化鈦在植物體內(nèi)吸收,轉(zhuǎn)運(yùn)和蓄積及與蛋白作用機(jī)理的研究[D]. 保定: 河北大學(xué), 2010

Ba C L. Absorption and transport and accumulation of Titanium dioxide in plants and function methods between protein and metal [D]. Baoding: Hebei University, 2010 (in Chinese)

[20] 高嫄. 納米TiO2、納米CuO對(duì)青萍生長(zhǎng)影響及機(jī)理探討[D]. 淄博: 山東理工大學(xué), 2012

Gao Y. Effect and mechanism of TiO2and CuO nano-particles on Lemna minor growth [D]. Zibo: Shandong University of Technology, 2012 (in Chinese)

[21] Khodakovskaya M, Dervishi E, Mahmood M, et al. Carbon nanotubes are able to penetrate plant seed coat and dramatically affect seed germination and plant growth [J]. ACS Nano, 2009, 3(10): 3221-3227

[22] 林道輝, 冀靜, 田小利, 等. 納米材料的環(huán)境行為與生物毒性[J]. 科學(xué)通報(bào), 2009, 54(29): 3590-3604

Lin D H, Ji J, Tian X L, et al. Environmental behavior and toxicity of engineered nanomaterials [J]. Chinese Science Bulletin, 2009, 54(29): 3590-3604 (in Chinese)

[23] Asli S, Neumann P M. Colloidal suspensions of clay or titanium dioxide nanoparticles can inhibit leaf growth and transpiration via physical effects on root water transport [J]. Plant, Cell and Environment, 2009, 32(5): 577-584

[24] 鄒麗莎. 納米氧化鋅的玉米吸收積累與毒性效應(yīng)初探[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2014

Zou L S. The uptake, accumulation and phytotoxicitv of ZnO nanoparticles to maize (Zea mays L.) [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014 (in Chinese)

◆

Effect of Nano Titanium Dioxide with Different Particle Size on the Seed Germination and Plant Growth and Physiology of Phragmites australis in Hydroponic Experiments

Wen Shuangxi1, Wang Yili1,2,*

1. College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China2. College of Environmental Science and Engineering, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

9 November 2016 accepted 3 March 2017

Nano titanium dioxide (TiO2-NPs) is one of the most widely used nanometer materials, which will migrate and transform among the wetland biotas, substrate and water body as entering the natural wetland and constructed wetland. At present, there are few studies on the toxicity of TiO2-NPs to the Phragmites australis. In this study, the effect of TiO2-NPs with different sizes on the seed germination and plant growth of typical constructed wetland plant—P. australis was explored through hydroponic experiments, and their ecotoxicological effects were also determined. The results showed that the seed germination of P. australis was promoted at low concentration (less than 200 mg·L-1) treatment by TiO2-NPs with different sizes, while was hindered at high concentration treatment. When the concentration of TiO2-NPs was higher than 500 mg·L-1, the seed germination indexes of treated P. australis significantly decreased in comparison with control samples. Moreover, the EC50of 4 nm and 20 nm TiO2-NPs on the seed germination of P. australis were determined as 1 075 and 1 680 mg·L-1, respectively. The toxic effects of TiO2-NPs on P. australis were characterized as growth retardation and even stagnation, leaf chlorosis, plant wilting or death, and decrease in the area growth rate of second leaf from the top. Moreover, the decreased size and increased concentration of TiO2-NPs could strengthen the aforementioned toxic effects. With the increase of TiO2-NPs concentration, the chlorophyll in leaf and Mg content in plant of treated P. australis decreased, while the superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in the root system increased, and such treatment effect was more obvious as the smaller TiO2-NPs were used. TiO2-NPs with different sizes could enter the P.australis, and small size or high concentration could favor this entrance. However, it was difficult for TiO2-NPs to transfer from roots to stems and leaves.

TiO2nanoparticles; ecotoxicological effects; Phragmites australis; accumulation; distribution

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07105-002-03)；國(guó)家自然科學(xué)基金(51478041，21177010)

文雙喜(1986-)，男，博士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境修復(fù)與污染生態(tài)學(xué), E-mail: wenshuangxide@126.com;

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: wangyilimail@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20161109002

2016-11-09 錄用日期：2017-03-03

1673-5897(2017)2-071-10

X171.5

A

王毅力(1972-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，美國(guó)特拉華大學(xué)土木與環(huán)境系訪問學(xué)者(2008.10-2009.09)。2006年入選北京市科技新星計(jì)劃A，并于同年入選教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃。主要研究方向?yàn)椋核w污染防治，污泥表征、調(diào)理脫水與資源化，分形與流變學(xué)，飲用水物理化學(xué)處理技術(shù)，污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)技術(shù)。

文雙喜, 王毅力. 水培實(shí)驗(yàn)中不同粒徑納米TiO2對(duì)蘆葦種子發(fā)芽和植株生長(zhǎng)和生理的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(2): 71-80

Wen S X, Wang Y L. Effect of nano titanium dioxide with different particle size on the seed germination and plant growth and physiology of Phragmites australis in hydroponic experiments [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 71-80 (in Chinese)