稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的分子克隆及序列分析

洪響聲，覃劍暉，王子健，查金苗,*

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 4300702. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點實驗室，北京 100085

稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的分子克隆及序列分析

洪響聲1,2，覃劍暉1，王子健2，查金苗2,*

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 4300702. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點實驗室，北京 100085

成體神經(jīng)發(fā)生是脊椎動物中廣泛存在的一種生物學(xué)特征。成體硬骨魚類的腦展現(xiàn)出強(qiáng)烈的神經(jīng)活性以及出色的腦修復(fù)能力，這使得硬骨魚類成為研究成體神經(jīng)發(fā)生和腦修復(fù)的一個理想的模型。本文克隆了成體稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)腦組織中神經(jīng)發(fā)生及腦修復(fù)相關(guān)的hes5、pax6、sox11和prox1基因的部分cDNA序列并進(jìn)行了序列分析。序列分析結(jié)果表明，pax6和sox11基因片段與斑馬魚(Danio rerio)對應(yīng)的基因片段的同源性最高，分別為97%和94%； hes5基因與鯉魚(Cyprinus carpio)相對應(yīng)的基因片段的同源性最高，為92%；prox1基因在物種間的同源性最低?；谙∮絮L鯽和已知物種相應(yīng)基因的核苷酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽prox1基因與其他硬骨魚類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。本文為進(jìn)一步開展神經(jīng)毒性類化學(xué)品對水生生物魚類的成體神經(jīng)毒性作用機(jī)制研究提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

稀有鮈鯽；神經(jīng)發(fā)生；基因克??；同源性分析；系統(tǒng)發(fā)育樹

神經(jīng)發(fā)生是指未分化的神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞(neural stems/progenitor cells, NSPCs)產(chǎn)生成熟、有功能的神經(jīng)元細(xì)胞的過程，這個過程在脊椎動物間高度保守[1]。長久以來，人們認(rèn)為隨著生物早期發(fā)育的結(jié)束，神經(jīng)發(fā)生也隨之逐漸停止。然而，隨著研究的不斷進(jìn)行，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動物的大腦在整個生命階段仍然保留生成新神經(jīng)細(xì)胞的能力[2]。

在成體神經(jīng)發(fā)生過程中，有許多重要的基因參與調(diào)控。例如，在哺乳動物腦部，轉(zhuǎn)錄因子超家族堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)之一的hes5 基因主要參與維持海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層(subgranular zone, SGZ)的NSPCs細(xì)胞狀態(tài)[3]；最早在研究果蠅時，發(fā)現(xiàn)另一轉(zhuǎn)錄因子pax6是果蠅眼發(fā)育所必需[4]，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種作用在人和鼠眼的發(fā)育過程中也保守[5]。除此之外，研究者發(fā)現(xiàn)在哺乳動物腦發(fā)育期間，pax6基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)特定的時空行為，并且主要在神經(jīng)組織中表達(dá)[6]。目前的研究表明，pax6在能以對稱或非對稱方式分裂產(chǎn)生NSPCs的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，它通過調(diào)節(jié)NSPCs庫水平從而調(diào)控胚胎及成體神經(jīng)發(fā)生[7]。當(dāng)靜息NSPCs增殖時，它們可分裂產(chǎn)生具有分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞潛能的短暫擴(kuò)充祖細(xì)胞(transit amplifying progenitors, TAPs)[8]。

然而，與處于成年期的哺乳類動物相比，脊椎動物中的有尾目兩棲類和硬骨魚類在細(xì)胞、組織及器官方面的再生能力明顯更強(qiáng)。更為重要的是，成年魚類的內(nèi)層腦室增殖活性區(qū)域更廣[9]。因此，硬骨魚類成體腦部所具有的這些獨(dú)有的特性，使其成為在研究控制成體神經(jīng)發(fā)生和腦修復(fù)的分子機(jī)制方面的一個重要研究模型。

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus) 是我國特有的小型鯉科魚類，自然分布于四川省境內(nèi)的漢源縣、石棉縣和都江堰市等地。早在1993年，王劍偉等[10]已對其生物學(xué)進(jìn)行了多方面的深入研究，其的研究結(jié)果表明，與國際上常用的實驗動物，如斑馬魚(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)和黑頭軟口鰷(Pimephales promelas)等實驗魚相比，稀有鮈鯽具有許多與之相似的優(yōu)點，如胚胎透明、實驗室飼養(yǎng)條件下可周年產(chǎn)卵、體積小、生長快、便于飼養(yǎng)及管理等。周永欣等[11]通過研究比較毒物對稀有鮈鯽與黑頭軟口鰷和斑馬魚的急性毒性大小，發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽對毒物的敏感性與黑頭軟口鰷和斑馬魚之間并無顯著性差異。因此，稀有鮈鯽目前已正式被認(rèn)定為我國在水生毒理研究方面的實驗生物，并被多個研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如生態(tài)、遺傳、發(fā)育、生理和毒理等[12]。然而，當(dāng)前關(guān)于稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生相關(guān)基因的生物信息學(xué)背景相對不足。本文通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法，同源克隆了稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生相關(guān)基因hes5、pax6、sox11和prox1的cDNA片段，并進(jìn)行同源性比較以及系統(tǒng)發(fā)育分析，為今后對于稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生相關(guān)基因功能研究的開展提供背景資料，同時也為闡明外源性的環(huán)境污染物對魚類的神經(jīng)毒理學(xué)機(jī)制研究方面提分子水平上的依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗魚飼養(yǎng)及取材

實驗用稀有鮈鯽為中國科學(xué)院水生生物研究所惠贈，并在本實驗室飼養(yǎng)。養(yǎng)殖用水為經(jīng)活性炭過濾并曝氣的自來水，控制pH值在7.2～7.6，溫度為(25 ± 1) ℃，水體硬度為44.0～61.0 mg·L-1(以CaCO3計算)，光照周期為16 h : 8 h (晝:夜)。飼養(yǎng)期間投喂適量顆粒性飼料(TetraMin)和新孵化的豐年蟲(Artemia nauplii)，早晚各喂1次，并及時吸出排泄物。選取健康的性成熟個體(5月齡)，解剖鏡下取其腦組織于液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄

使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa，大連)提取稀有鮈鯽的總RNA，具體步驟參考說明書進(jìn)行。 RNA濃度采用紫外分光光度計測定A260/A280為1.8～2.1；取1 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)18S rRNA和28S rRNA條帶的完整性來評價RNA的提取質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行，取2 μg總RNA用于合成cDNA。

1.3 引物設(shè)計及RT-PCR

首先，在GenBank網(wǎng)站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上搜索目的基因的同源關(guān)系較近的序列并下載。使用Primer Premier 5軟件在目的基因保守性最高的區(qū)域設(shè)計引物，目的基因擴(kuò)增引物見表1。取200 ng稀有鮈鯽腦組織的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括cDNA模板2 μL，正向和反向引物各2 μL (0.5 μmol·L-1)，Go Taq?qPCR Master Mix (Promega，USA) 25 μL以及無核酸酶水19 μL。qPCR反應(yīng)程序為：95 ℃，10 min；40個循環(huán), 95 ℃、15 s → 57 ℃、40 s → 72 ℃、30 s。反應(yīng)完畢后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Bio-Rad凝膠成像儀掃描記錄圖像。最后，委托北京生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將克隆測序成功的擴(kuò)增片段序列在GenBank上進(jìn)行BLAST分析，并將能比對到目的基因的序列用DNAMAN 8軟件進(jìn)行氨基酸推導(dǎo)并提交到GenBank，獲得的GenBank登錄號見表1。從GenBank上下載與目的基因相似度較高的核苷酸序列，利用ClustalW軟件進(jìn)行核苷酸序列的多重排列并將結(jié)果輸入到MEGA 6軟件中，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 成年稀有鮈鯽神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因克隆所用的PCR引物序列及基因片段GenBank序列號Table 1 PCR primers used for cloning neurogenesis related genes of adult Gobiocypris rarus and the GenBank accession numbers of genes

圖1 稀有鮈鯽hes5核苷酸序列與已知同源基因的比較注：涉及物種包括人Homo sapiens (DQ_272660.1)、小鼠Mus musculus (NM_010419.4)、非洲爪蟾Xenopus laevis (NM_001095627.1)、褐家鼠Rattus norvegicus (NM_024383.1)、大西洋鮭Salmo salar (XM_014146367.1)、羊頭魚Cyprinodon variegatus (XM_015377747.1)、斑馬魚Danio rerio (XM_003199526.3)。Fig. 1 Nucleotide sequence comparison of Gobiocypris rarus hes5 with known orthologsNote: The species involved Homo sapiens (DQ272660.1), Mus musculus (NM_010419.4), Xenopus laevis (NM_001095627.1), Rattus norvegicus (NM_024383.1), Salmo salar (XM_01414647.1), Cyprinodon variegatus (XM_015377747.1), Danio rerio (XM_003199526.3).

2 結(jié)果 (Results)

2.1 成年稀有鮈鯽神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的克隆

本文克隆了hes5、pax6、sox11和prox1共4個稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生相關(guān)基因并測定了其相應(yīng)的核苷酸序列，對應(yīng)基因的序列大小分別為364 bp、274 bp、351 bp以及300 bp。將克隆的基因片段以及推導(dǎo)出的相應(yīng)氨基酸序列提交至GenBank，獲得各基因片段的登錄號，分別為：KX132900、KX132901、KX132903和KX132902 (表1)。

2.2 同源性分析

通過BLASTN分析，我們獲得了各基因與其他物種的相應(yīng)基因的同源性大小 (表2)。結(jié)果顯示，pax6和sox11基因片段與斑馬魚對應(yīng)的基因片段的同源性最高，分別為97%和94%，hes5與鯉魚相對應(yīng)的基因片段的同源性最高，為92% (圖1)。此外，prox1基因片段在物種間同源性最低，其中與同源性最高的金線鲃相對應(yīng)的該基因片段的同源性為89%，而與斑馬魚的同源性為80%。

表2 稀有鮈鯽核苷酸序列同其他已知魚類相應(yīng)核苷酸序列的同源比較Table 2 Homology comparision of nucleotide sequences between Gobiocypris rarus and other fish species

圖2 基于NJ(neighbor-joining)法構(gòu)建的稀有鮈鯽與其他物種的神經(jīng)發(fā)生基因核苷酸進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of nucleotide sequences of neurogenesis genes between Gobiocypris rarus and other organisms based on NJ (neighbor-joining) method

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

運(yùn)用MEGA 6軟件分別構(gòu)建了hes5、pax6、sox11和prox1共4個稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生相關(guān)基因的核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2中可以看出，稀有鮈鯽hes5、pax6和sox11在進(jìn)化關(guān)系上與斑馬魚最接近，首先聚為一支。另外，稀有鮈鯽prox1與硬骨魚類的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一支。

3 討論 (Discussion)

稀有鮈鯽作為我國特有的一種小型鯉科魚類，已被廣泛地應(yīng)用到遺傳發(fā)育、生理生態(tài)以及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域，并且由于其對環(huán)境污染物的高靈敏性，已經(jīng)成為我國在水生毒理研究領(lǐng)域的魚類實驗動物[12]。此外，與其他的脊椎動物相比，硬骨魚類腦所具有的一些獨(dú)有的特征，如前腦具有高水平的細(xì)胞增殖活性等，使其在成體神經(jīng)發(fā)生及腦修復(fù)等方面研究中成為極為有效的研究模型。

在成體神經(jīng)發(fā)生及再生過程中有許多關(guān)鍵因子的參與。例如，sox家族轉(zhuǎn)錄因子在TAPs轉(zhuǎn)化成未成熟和成熟顆粒細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。Haslinger等[13]發(fā)現(xiàn)，在成體SGZ區(qū)域的神經(jīng)發(fā)生中，SoxC亞家族成員之一的sox11表達(dá)水平的高低是能否促進(jìn)神經(jīng)分化的關(guān)鍵因素。類似地，prox1 (prospero related homeobox gene 1) 也是成體神經(jīng)元生成及成熟所必需的一個轉(zhuǎn)錄因子。Jessberger 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，prox1的表達(dá)水平在神經(jīng)發(fā)生晚期3型細(xì)胞中首次上調(diào)，之后在未成熟和成熟的顆粒神經(jīng)元細(xì)胞中均持續(xù)表達(dá)[14]。因此，prox1被廣泛用作顆粒神經(jīng)元細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。

本研究克隆獲得了4個稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生相關(guān)基因，包括hes5、pax6、sox11和prox1。通過與其他已知魚類核苷酸序列的同源比較發(fā)現(xiàn)，pax6和sox11基因片段與斑馬魚對應(yīng)的基因片段的同源性最高，分別為97%和94%，而hes5與鯉魚相對應(yīng)的核苷酸序列的同源性最高(92%)。此外，prox1基因在物種間的同源性較低，與斑馬魚的同源性僅為80%。目前，在水生態(tài)毒理學(xué)研究中，有關(guān)具有神經(jīng)毒性污染物對水生生物成體神經(jīng)發(fā)生及再生的研究工作還相當(dāng)有限。Shiraki等[16]在成年大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，丙硫氧嘧啶暴露28 d后大鼠海馬齒狀回中hes5基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。研究表明，雌激素在哺乳動物以及鳥類腦部神經(jīng)發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。然而，目前有關(guān)雌激素對硬骨魚類成體腦部神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生模式的影響尚未完全了解。為了探究雌激素的效應(yīng)，Makantasi等利用雌性成年斑馬魚模型研究了17β-雌二醇(E2)暴露7 d后腦區(qū)細(xì)胞的增殖模式。研究結(jié)果表明：E2顯著影響斑馬魚的成體神經(jīng)發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種影響極有可能是通過調(diào)控腦室神經(jīng)發(fā)生區(qū)域處于減數(shù)分裂后期的細(xì)胞造成[17]。除了E2外，當(dāng)前具有神經(jīng)毒性或潛在神經(jīng)毒性的物質(zhì)還有很多，如毒死蜱、滴滴涕和有機(jī)磷酸酯阻燃劑中的磷酸三(1,3-二氯丙基)酯(TDCPP)等[18-20]。鑒于魚類模型在成體神經(jīng)發(fā)生研究中所展現(xiàn)出的獨(dú)特優(yōu)勢，這些神經(jīng)毒性類物質(zhì)對水生生物魚類的成體神經(jīng)毒性的評價工作亟待開展，并且其潛在的神經(jīng)毒性機(jī)制也需要更為深入的研究。

本文通過分子克隆的手段獲得了稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生及再生過程中hes5、pax6、sox11和prox1等相關(guān)基因的片段和序列的分子生物學(xué)信息。這些結(jié)果將為進(jìn)一步開展神經(jīng)毒性類化學(xué)品對水生生物魚類的成體神經(jīng)毒性作用機(jī)制的研究提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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◆

Cloning and Sequence Analysis of Genes Involved in Adult Neurogenesis of Rare Minnow (Gobiocyprisrarus)

Hong Xiangsheng1,2, Qin Jianhui1, Wang Zijian2, Zha Jinmiao2,*

1. College of Fisheries, Huazhong Agriculture University, Wuhan 430070, China2. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

13 May 2016 accepted 31 May 2016

Adult neurogenesis is a widespread trait of vertebrates. The brain of the adult teleost fish exhibits intense neurogenic activity and outstanding capability for brain repair, which makes teleost fish a ideal model for the study of adult neurogenesis and brain regeneration. In this paper, we cloned the partial cDNA sequence of hes5, pax6, sox11, and prox1 from the brain of Gobiocypris rarus, which are involved in neurogenesis and brain regeneration, and analyzed the sequences. Sequence analysis showed that pax6 and sox11 genes shared the highest sequence affinity with genes of Danio rerio (97% and 94%, respectively); hes5 gene shared the highest sequence affinity with the gene of Cyprinus carpio (92 %); prox1 gene shared the lowest sequence affinity among species. The phylogenetic trees were developed based on the nucleotide sequences of the corresponding genes of known species, which showed the fartherest phylogenetic relationship of rare minnow prox1 gene and other teleosts. In this paper, we provide a basic molecular biological basis for the further research on the mechanism of neurotoxicity of aquatic organisms

Gobiocypris rarus; neurogenesis; clone; homology analysis; phylogenetic trees

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2014zx-07204-008-003)

洪響聲(1990-)，男，碩士，研究方向為水生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: Soundhong@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jmzha@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160513001

2016-05-13 錄用日期：2016-05-31

1673-5897(2017)2-056-07

X171.5

A

查金苗(1975—)，男，博士，研究員，主要研究方向包括水生模型生物體系的構(gòu)建和發(fā)展、水環(huán)境生物毒性測試方法、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的篩選技術(shù)研究、環(huán)境污染物對水生生物分子毒理機(jī)制、水生態(tài)系統(tǒng)完整性評估方法等方面的研究，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文70余篇，SCI論文40余篇。

洪響聲, 覃劍暉, 王子健, 等. 稀有鮈鯽成體神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的分子克隆及序列分析[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(2): 56-62

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