改良皮膚癬菌培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室研究

江情，李婕，金云，羅云鵬，陶麗，高仰敏，占萍

(江西省皮膚病?？漆t(yī)院江西省皮膚病研究所，江西南昌330000)

改良皮膚癬菌培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室研究

江情，李婕，金云，羅云鵬，陶麗，高仰敏，占萍

(江西省皮膚病?？漆t(yī)院江西省皮膚病研究所，江西南昌330000)

目的探討改良DTM培養(yǎng)基對皮膚癬感染的診斷價(jià)值。方法采用三點(diǎn)接種法，將臨床常見的8種皮膚癬菌、9種非皮膚癬菌和11份臨床皮膚病皮屑標(biāo)本接種于DTM培養(yǎng)基及2種改良DTM培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d，每24h觀察一次菌落生長及三種培養(yǎng)基顏色變化情況。結(jié)果皮膚癬菌中除紫色毛癬菌外均可使原DTM（橙黃→紅色）和溴百里酚藍(lán)改良DTM變色（土黃→深藍(lán)），而紫色石蕊改良后DTM無顏色變化。其中須癬毛癬菌、許蘭毛癬菌與絮狀表皮癬菌在溴百里酚藍(lán)改良DTM上培養(yǎng)3d變色明顯，而在原DTM上需培養(yǎng)4d才會出現(xiàn)明顯顏色變化；非皮膚癬菌致DTM變色均需培養(yǎng)5d以上。結(jié)論皮膚癬菌使溴百里酚藍(lán)改良DTM變色跨度大，肉眼易判讀；且比原DTM培養(yǎng)基更為敏感，有利于皮膚癬菌感染的快速診斷，值得大力推廣應(yīng)用。

皮膚癬菌培養(yǎng)基；溴百里酚藍(lán)；快速診斷

皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基（dermatophyte test medium，DTM）于1969年由Taplin等發(fā)明，應(yīng)用于頭癬致病真菌的分離與鑒定，其原理是在沙煲弱培養(yǎng)基（Sabouraud＇s dextrose agar，SDA）基礎(chǔ)上加入慶大霉素，金霉素與放線菌酮，抑制細(xì)菌及絕大多數(shù)腐生真菌的生長，從而選擇性培養(yǎng)皮膚癬菌[1-3]。其中添加了酚紅指示劑，皮膚癬菌生長中釋放的堿性代謝物可使培養(yǎng)基pH升高，顏色由黃色變?yōu)榧t色，通常培養(yǎng)3～7d即可使培養(yǎng)基變色[1，4，5]。雖然僅根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化，難以將皮膚癬菌精確鑒定到菌種，但對治療藥物的選擇提供了充足的信息[2，6，7]。DTM具有簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，在癬病診治中有著較好的應(yīng)用前景[2，5，8]。在我國，由于DTM為進(jìn)口試劑，較為昂貴，購買周期也較長，李筱芳等報(bào)道了一種改良DTM培養(yǎng)基用于快速鑒定甲癬，將原酚紅改為溴百里酚藍(lán)，使其培養(yǎng)基顏色變化在視覺上更加直接、更易判讀，為皮膚癬菌感染的快速診斷及合理用藥提供了便利[4]。我們以溴百里酚藍(lán)和石蕊作為指示劑對DTM培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，比較分析了臨床常見皮膚癬菌使3種培養(yǎng)基顏色變化情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DTM培養(yǎng)基：葡萄糖，大豆蛋白，瓊脂，放線菌酮，氯霉素，慶大霉素，金霉素，酚紅指示劑，溴百里酚藍(lán)，紫色石蕊指示劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本實(shí)驗(yàn)菌株來自江西省皮膚病?？漆t(yī)院真菌科的臨床標(biāo)本菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS區(qū)分子學(xué)鑒定到菌種，分別為絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌、須癬毛癬菌、紫色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、斷發(fā)毛癬菌、許蘭毛癬菌、近平滑念珠菌、阿薩西毛孢子菌、尖孢支孢霉菌、球形孢子絲菌、傘枝橫梗霉菌、球孢枝孢菌、裴氏著色真菌各1株，白念珠菌和煙曲霉各2株；另外7份皮屑標(biāo)本來自真菌鏡檢陽性標(biāo)本，分別來自手部（經(jīng)培養(yǎng)鑒定為紅色毛癬菌）、面部（斷發(fā)毛癬菌）、頭發(fā)（斷發(fā)毛癬菌）、膝蓋（須癬毛癬菌）、耳朵（紅色毛癬菌）、小腿（紅色毛癬菌）和腹股溝（紅色毛癬菌），1份花斑糠疹陽性標(biāo)本，4份真菌鏡檢陰性標(biāo)本來自玫瑰糠疹、濕疹、神經(jīng)性皮炎和銀屑病患者。

1.3 質(zhì)控菌株和實(shí)驗(yàn)質(zhì)控本實(shí)驗(yàn)中采用了五株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株，分別為須癬毛癬菌CBS 347.55、紅色毛癬菌CMCC(F)T1i，紫色毛癬菌CMCC(F)T3l、許蘭毛癬菌CBS 139215。另外，對臨床菌株，均提取DNA，擴(kuò)增ITS區(qū)測序，明確菌種。臨床菌株分子測序方法具體方法見以前的報(bào)道，將臨床分離獲得的菌株轉(zhuǎn)種于弱沙煲葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（SDA）培養(yǎng)基，生長良好后，刮取適量菌絲提取DNA[9]，用ITS1/ITS4引物對擴(kuò)增ITS區(qū)[10]，測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫上Blast，鑒定菌種，要求序列同源性≥99%且形態(tài)學(xué)符合的菌種。

1.4 配制原DTM培養(yǎng)基[1]葡萄糖1%，大豆蛋白1%，瓊脂2%，酚紅0.02%，放線菌酮0.4g/L，氯霉素0.1g/L，慶大霉素0.1g/L，金霉素0.1g/L，pH5.5± 0.1；所有試劑溶解于800ml蒸餾水中，攪拌溶解，定容至1000ml，微波爐加熱至瓊脂完全溶解后分裝至試管中，于121℃高壓滅菌20min，繼而置于斜面冷卻備用。

1.5 改良DTM培養(yǎng)基-溴百里酚藍(lán)[4]葡萄糖1%，大豆蛋白1%，瓊脂2%，溴百里酚藍(lán)0.5%，放線菌酮0.4g/L，氯霉素0.1g/L，慶大霉素0.1g/L，金霉素0.1g/L，PH5.5±0.1；配制方法同上。

1.6 改良DTM培養(yǎng)基-石蕊葡萄糖1%，大豆蛋白1%，瓊脂2%，紫色石蕊0.5%，放線菌酮0.4g/L，氯霉素0.1g/L，慶大霉素0.1g/L，金霉素0.1g/L，pH5.5±0.1；配制方法同上。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組8種皮膚癬菌株和9種非皮膚癬菌株組為實(shí)驗(yàn)組，7種真菌鏡檢陽性皮屑標(biāo)本為陽性對照組，5種非皮膚癬病臨床標(biāo)本為陰性對照組。采用三點(diǎn)法接種實(shí)驗(yàn)樣本于新鮮配制培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d，每24h觀察一次菌落生長及三種培養(yǎng)基顏色變化情況。以上實(shí)驗(yàn)操作均重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 皮膚癬菌和非皮膚癬菌使三種培養(yǎng)基變色情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在以石蕊為指示劑的培養(yǎng)基上，菌株生長正常，但培養(yǎng)基顏色未見明顯改變，不能起到快速鑒定菌種的作用。原DTM和改良DTM-溴百里酚藍(lán)培養(yǎng)基上，8株皮膚癬菌株均使變色。原DTM顏色由橙黃→淡紅→紅色，溴百里酚藍(lán)改良后DTM顏色由土黃→青綠→深藍(lán)。

培養(yǎng)72h，改良DTM-溴百里酚藍(lán)上須癬毛癬菌、紫色毛癬菌、許蘭毛癬菌的質(zhì)控株和臨床來源的絮狀表皮毛癬菌略有變色，變?yōu)闇\青色；臨床來源的須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌和許蘭毛癬菌明顯變色，為青綠色，見圖1-a。使原DTM發(fā)生顏色改變的菌株相同，但變?yōu)榈t色。非皮膚癬菌均未使兩種培養(yǎng)基變色，見圖1-b。

培養(yǎng)第5d，13株皮膚癬菌使溴百里酚藍(lán)改良DTM和原DTM培養(yǎng)基均變色，其中臨床菌株變色最為明顯的菌種為絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、斷發(fā)毛癬菌和許蘭毛癬菌，而紅色毛癬菌和犬小孢子菌變色較淺。此外，阿薩西毛孢子菌和傘枝橫梗霉菌的培養(yǎng)基開始發(fā)生肉眼可辨的顏色改變，見圖1-c。

培養(yǎng)第7d，溴百里酚藍(lán)改良DTM上，臨床皮膚癬菌中除紫色毛癬菌外均使培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色；原DTM上，除紫色毛癬菌外均使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色；非皮膚癬菌中阿薩西毛孢子菌、尖孢支孢霉菌、枝頂孢霉菌、球形孢子絲菌、裴氏著色真菌、傘枝橫梗霉、煙曲霉菌也使改良的DTM變色，白念珠菌、球形孢子絲菌、裴氏著色真菌、傘枝橫梗霉菌和煙曲霉菌使原DTM培養(yǎng)基變色。見圖1-d。

不同的菌種在不同皮膚癬菌培養(yǎng)基上的變色時(shí)間存在差異。須癬毛癬菌、許蘭毛癬菌與絮狀表皮癬菌在改良DTM上變色時(shí)間為3d，在原DTM上為4d；非皮膚癬菌致DTM變色均在培養(yǎng)5d以后。改良后的DTM變色由土黃變?yōu)樯钏{(lán)色，原DTM變色由橙黃變?yōu)榧t色，由于橙黃色與紅色之間跨度并不是很大，因此易造成誤讀或延遲判讀，然而改良DTM變色跨度大，使判讀更為為迅速和直觀，有效的節(jié)省鑒定時(shí)間（表1）。

2.2 皮屑標(biāo)本使兩種DTM培養(yǎng)基變色情況將7種來自臨床皮膚癬菌病且真菌鏡檢陽性的皮屑和5種非皮膚癬病臨床標(biāo)本接種于溴百里酚藍(lán)改良DTM和原DTM培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d，結(jié)果顯示鏡檢陽性標(biāo)本均使兩種DTM變色，非皮膚癬病標(biāo)本未能使兩種DTM變色，其中手部和耳部皮屑標(biāo)本使改良DTM完全變色（深藍(lán)色），而原DTM并未完全變色，顯現(xiàn)出淡紅色，造成延遲判讀和診斷困難，見圖2。實(shí)驗(yàn)證明溴百里酚藍(lán)改良后DTM對皮膚癬菌感染診斷靈敏度高于原DTM，為臨床診斷縮短了時(shí)間。

表1 不同菌株使三種改良DTM變色情況

圖1 皮膚癬菌與非皮膚癬菌使兩種DTM變色情況

圖2 臨床標(biāo)本使兩種DTM變色情況情況，上排為改良DTM-溴百里酚藍(lán)，下排為原DTM培養(yǎng)基。從左到右的標(biāo)本分別來自手部、面部、頭發(fā)、膝蓋、耳朵、小腿，股部的癬病鏡檢陽性標(biāo)本，第五為花斑糠疹皮屑，后4個(gè)為真菌檢查陰性皮屑。

3 討論

皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基（DTM）無需專業(yè)培訓(xùn)[1，4]，相比沙氏培養(yǎng)基鑒定法縮短1周時(shí)間，是一種相對簡單、快速、有效的診斷方法[5，11，12]。更有專家學(xué)者認(rèn)為皮膚癬菌在DTM上的分離率與鑒別率高于SDA培養(yǎng)基，是一種污染率更低的，優(yōu)于SDA的培養(yǎng)方法[13-16]。美國關(guān)于甲真菌病的幾項(xiàng)研究表明，DTM鑒定法還可用于診斷甲真菌病，具有簡便、快速和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，比傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法效價(jià)比高，值得大力推廣應(yīng)用[2，8]。

本研究在原有DTM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇石蕊、酚紅和溴百里酚藍(lán)指示劑，摸索三種培養(yǎng)基對皮膚癬菌的變色情況。這三種指示劑為實(shí)驗(yàn)室常用酸堿指示劑，且變色點(diǎn)為外界環(huán)境由酸性變?yōu)閴A性。皮膚癬菌在酸性培養(yǎng)基中生長，釋放堿性酶類，導(dǎo)致培養(yǎng)基PH提高，可能會產(chǎn)生顏色改變。研究發(fā)現(xiàn)，改良DTM-石蕊培養(yǎng)基顯現(xiàn)深紫色，將皮膚癬菌和非皮膚癬菌接種后一周，可見菌落生長，但是顏色變化不明顯，難以區(qū)分皮膚癬菌和非皮膚癬菌。

而溴百里酚藍(lán)和酚紅指示劑組均觀察到明顯的顏色改變。實(shí)驗(yàn)研究表明，8種皮膚癬菌在培養(yǎng)一周時(shí)間內(nèi)酚紅組由橙黃色變?yōu)榈t，再到深紅，溴百里酚藍(lán)組由土黃色變?yōu)榍嗑G色，再到深藍(lán)色。但是，溴百里酚藍(lán)組顏色變化更早，且直觀敏感，更加直接易判讀，有助于準(zhǔn)確和迅速的診斷，大部分皮膚癬菌判斷時(shí)間可縮短一天。

不同皮膚癬菌的變色程度存在差異，其中須癬毛癬菌、許蘭毛癬菌和絮狀表皮癬菌最早，三天內(nèi)就可以在溴百里酚藍(lán)組看到明顯的顏色改變，此時(shí)酚紅組尚無明顯變化；培養(yǎng)7d皮膚癬菌均使兩種DTM變色，其中紅色毛癬菌和犬小毛癬菌變色時(shí)間較晚，另由于紫色毛癬菌生長緩慢，一般需2～3周方可見明顯菌落，因而本實(shí)驗(yàn)中紫色毛癬菌未能使兩種DTM培養(yǎng)基發(fā)生變色，推測不同的皮膚癬菌生長速率存在差異，產(chǎn)生堿性蛋白酶的速度也因之變化。這在一定程度上可以幫助大致判斷癬病感染的菌種。

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，培養(yǎng)基的特異性降低，如第7d，部分非皮膚癬菌培養(yǎng)基也發(fā)生類似的顏色改變，絲狀菌最為顯著。說明DTM培養(yǎng)基和改良培養(yǎng)基的特異性隨著時(shí)間延長而下降。

來自臨床的皮屑直接培養(yǎng)組顯示，皮膚癬菌感染標(biāo)本接種后，一周內(nèi)可觀察到顏色改變，且非皮膚癬菌標(biāo)本未見變色。提示DTM和改良DTM培養(yǎng)基可以用于臨床標(biāo)本的直接檢測。

研究結(jié)果表明，比較三種指示劑的皮膚癬菌培養(yǎng)基，石蕊無法起到鑒別皮膚癬菌的作用，而溴百里酚藍(lán)比酚紅更為敏感，判讀更容易，有利于快速診斷。此種培養(yǎng)基配制簡單，成本低廉，對設(shè)備和技術(shù)人員的要求較低，非常適用于缺乏專業(yè)真菌人才的醫(yī)療單位和廣大的基層醫(yī)療單位，有較好的臨床價(jià)值和良好應(yīng)用前景，值得大力推廣。

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Study on the modified dermatophyte test medium

JIANG Qing，LI Jie，JIN Yun，LUO Yunpeng，TAO Li，GAO Yangmin，ZHAN Ping.
Dermatology Hospital of Jiangxi Province，Institute of Dermatophyte of Jiangxi Province，Nanchang 330001，China.

Objective To study the traditional dermatophyte test medium(DTM)and its two modified(DTM)medium in identifying common dermatophytes.Methods Totally 8 dermatophytes species，9 non-dermatophytes fungi and 11 clinical samples were inoculated on DTM and the two modified DTM media，and all tests repeated three times.Results The medium color changed in both DTM(yellow to red)and DTM-BB(gray yellow to mazarine blue)with dermatophyte growth except Trichophyton violaceum，while no change occurred in DTM-L.The turning points of Trichophyton mentagrophytes，Trichophyton schoenleinii and Epidermophyton floccosum were 3 days in DTM-BB，4 days in DTM；However，the turning points of non-dermatophyte were longer than 5 days.The same results obtained when clinical samples were tried.Conclusion The DTM modified with bromothymol blue(DTMBB)was more specific and sensitive to identify dermatophytes species than the traditional DTM medium，and it could be applied in clinics as a dermatophyte test technique which is helpful for distinguishing dermatophytosis from non-dermatophytes infections.

∶Dermatophyte test medium；Bromothymol blue；Rapid diagnosis

R446.5，R379

A

1674-1129(2017)03-0318-04

2016-07-25；

2017-03-09)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.008

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目：20177050

江情，女，1985年生，檢驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)槠つw癬菌。

占萍，女，1980年生，皮膚性病學(xué)博士，主要研究方向是皮膚癬菌。zhanping1980@163.com