兩種麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑應(yīng)用比較的研究

龔甜，施勇，李健雄，張艷妮，徐剛

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

·實(shí)驗(yàn)研究·

兩種麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑應(yīng)用比較的研究

龔甜，施勇，李健雄，張艷妮，徐剛

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的比較評(píng)價(jià)兩種含內(nèi)質(zhì)控三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)麻疹病毒和風(fēng)疹病毒結(jié)果的差異。方法對(duì)江西省市級(jí)麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室上送的麻疹病毒或風(fēng)疹病毒核酸陽性咽拭子標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)用兩種含內(nèi)質(zhì)控的麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重?zé)晒釸T-PCR試劑盒檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果麻疹病毒和風(fēng)疹病毒核酸陽性咽拭子標(biāo)本符合率分別為95.12%和100.00%；兩種試劑檢測(cè)麻疹病毒特異度和靈敏度均較好；試劑A和試劑B檢測(cè)風(fēng)疹病毒特異度較好，靈敏度分別為71.43%和100%；試劑A和試劑B檢測(cè)人RNase P核酸靈敏度分別為100%和92.73%。結(jié)論試劑A在對(duì)麻疹病毒核酸檢測(cè)方面具有較高的敏感度及特異度，有較高應(yīng)用和推廣價(jià)值。

麻疹病毒；風(fēng)疹病毒；三重?zé)晒釸T-PCR

2013年江西省麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)在原血清學(xué)診斷網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上[1]，引進(jìn)了麻疹病毒和風(fēng)疹病毒熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，并在全省進(jìn)行推廣，與全國(guó)麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)同步，建立了麻疹病毒（Measles virus，MV）和風(fēng)疹病毒（Rubella virus，RV）核酸快速診斷實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)[2]。本研究使用麻疹病毒和風(fēng)疹病毒雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR商品化檢測(cè)試劑對(duì)江西省市級(jí)麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室上送的MV或RV核酸陽性咽拭子標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)為了更有效的監(jiān)控臨床標(biāo)本的采樣質(zhì)量及因操作失誤等所致的假陰性結(jié)果出現(xiàn)，本研究還引進(jìn)余蓓蓓[3]等人關(guān)于含使用人RNase P作為內(nèi)質(zhì)控的麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，并與國(guó)內(nèi)1種含內(nèi)質(zhì)控人RNase P核酸麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重?zé)晒釸T-PCR商品化試劑，同時(shí)對(duì)上述咽拭子標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，進(jìn)行試劑比較研究?，F(xiàn)將研究情況分析如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源標(biāo)本主要來自于江西省市級(jí)麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《全國(guó)麻疹監(jiān)測(cè)方案》[4，5]對(duì)麻疹風(fēng)疹疑似病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行MV和RV核酸檢測(cè)的MV或RV核酸陽性咽拭子標(biāo)本。其中：MV核酸陽性標(biāo)本41份，RV核酸陽性標(biāo)本14份。

1.2 MV和RV核酸檢測(cè)

1.2.1 病毒RNA提取取咽拭子標(biāo)本200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（lot no：145046864）提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。1.2.2 MV和RV雙重?zé)晒釸T-PCR商品化檢測(cè)試劑麻疹病毒/風(fēng)疹病毒雙通道核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）購自達(dá)安基因公司（Lot No：2014003）。相關(guān)操作和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)在美國(guó)ABI熒光PCR儀7500進(jìn)行。

1.2.3 含內(nèi)質(zhì)控MV和RV三重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法

1.2.3.1 本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的含內(nèi)質(zhì)控MV和RV三重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法引物和探針于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列[3]見表1。

表1 含內(nèi)質(zhì)控麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)引物具體序列表

采用ABI公司生產(chǎn)的AgPath-ID(TM)Onestep RT-PCR Kit（lot no：1407156）進(jìn)行反應(yīng)體系配制，命名為試劑A，總體積為25μl，相關(guān)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：45℃10min，95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃延伸1min，（收集熒光信號(hào)），共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在美國(guó)ABI熒光PCR儀7500進(jìn)行。

1.2.3.2 含內(nèi)質(zhì)控MV和RV三重?zé)晒釸T-PCR商品化檢測(cè)試劑麻疹和風(fēng)疹病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光定量PCR方法)購自國(guó)內(nèi)目前較為常見的公司，命名為試劑B（lot no：20141201）。相關(guān)操作和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)在美國(guó)ABI熒光PCR儀7500進(jìn)行。

1.3 檢測(cè)結(jié)果判定根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MV和RV雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法41份MV核酸陽性標(biāo)本，檢出39份陽性，陽性符合率均95.12%。RV核酸陽性標(biāo)本標(biāo)本14份均為陽性，陽性符合率為100%。

2.2 含內(nèi)質(zhì)控MV和RV三重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法

2.2.1 MV核酸檢測(cè)結(jié)果比較41份MV核酸陽性標(biāo)本，兩種試劑均檢出39份MV核酸陽性，陽性符合率均為95.12%，兩種試劑檢測(cè)結(jié)果與MV和RV雙重?zé)晒釸T-PCR商品化檢測(cè)試劑一致。見表2。

表2 兩種方法檢測(cè)MV比較

2.2.2 RV核酸檢測(cè)結(jié)果比較試劑A均檢出10份RV核酸陽性，陽性符合率均為71.43%；試劑B檢出14份RV核酸陽性，陽性符合率為100%。試劑B檢測(cè)結(jié)果與MV和RV雙重?zé)晒釸T-PCR商品化檢測(cè)試劑一致。見表3。

表3 兩種方法檢測(cè)RV比較

2.2 人RNase P核酸檢測(cè)結(jié)果比較試劑A均檢出55份人RNase P核酸陽性，陽性率為100.00%；試劑B檢出51份人RNase P核酸陽性，陽性率為92.73%。見表4。

表4 兩種方法檢測(cè)RNase P比較

3 討論

MV和RV均可引起急性全身性出疹性呼吸道傳染病[6]，二者在臨床癥狀上較難以區(qū)分，因此，MV和RV的鑒別主要依賴于特異性的實(shí)驗(yàn)室診斷，尤其是在消除麻疹階段和達(dá)到麻疹消除目標(biāo)期間，由風(fēng)疹引起的出疹樣病例會(huì)更加的凸顯。及時(shí)、敏感和特異的病原檢測(cè)方法對(duì)于麻疹甚至風(fēng)疹的消除極為重要的。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)快速、高靈敏度和高特異性的核酸檢測(cè)技術(shù)，目前，廣泛用于病毒等病原微生物核酸的快速檢測(cè)[7-12]。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)和診斷麻疹，降低麻疹的漏診率，尤其在麻疹疫情處置中能夠在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可得到實(shí)驗(yàn)室確診，為麻疹疫情的處理和控制贏取寶貴的時(shí)間[13-15]。

通過上述檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，江西省麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)MV和RV核酸陽性咽拭子標(biāo)本符合率分別為95.12%和100.00%；3份MV核酸陽性咽拭子標(biāo)本經(jīng)復(fù)核為陰性，可能與原始咽拭子標(biāo)本核酸量少，經(jīng)過凍融在進(jìn)行復(fù)核，核酸量降至檢出限有關(guān)。由于江西省麻疹病毒和風(fēng)疹病毒核酸快速診斷實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)于2013年新建立，因此需要加強(qiáng)對(duì)標(biāo)本采集質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)質(zhì)量控制等，為消除麻疹階段病例的早期診斷提供可靠的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

為了避免因人為操作失誤而導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性檢測(cè)結(jié)果[16]，本研究引進(jìn)含使用人RNase P作為內(nèi)質(zhì)控的麻疹病毒和風(fēng)疹病毒多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)本的人RNase P檢測(cè)均為陽性，有效的監(jiān)控了樣本中的PCR抑制因素以及由操作誤差所造成的假陰性結(jié)果；本方法在對(duì)麻疹病毒和以人RNase P作為內(nèi)質(zhì)控的核酸檢測(cè)靈敏度和特異度較好，但在風(fēng)疹病毒檢測(cè)方面靈敏度低于商品化試劑B，而商品化試劑B在對(duì)以人RNase P作為內(nèi)質(zhì)控核酸檢測(cè)方面靈敏度低于本研究引進(jìn)的方法。另外，本研究引進(jìn)的方法為實(shí)驗(yàn)室自行合成引物和探針，因此，在檢測(cè)費(fèi)用方面也僅為商品化試劑的一半。

綜上所述，本研究引進(jìn)的含使用人RNase P作為內(nèi)質(zhì)控的麻疹病毒和風(fēng)疹病毒三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)費(fèi)用低，在對(duì)麻疹病毒和人RNase P核酸檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異度，具有較高的應(yīng)用和推廣價(jià)值。但是還需要進(jìn)一步改進(jìn)提高風(fēng)疹病毒的核酸檢測(cè)靈敏度。

[1]許松濤，張燕，王慧玲，等.中國(guó)2012年麻疹/風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)運(yùn)轉(zhuǎn)情況分析[J].中國(guó)疫苗和免疫，2014，20（1）：62-66.

[2]龔甜，熊英，張艷妮，等.2013年江西省麻疹/風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)運(yùn)轉(zhuǎn)分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，42(5)：841-843.

[3]余蓓蓓，馮燕，徐昌平，等.含內(nèi)質(zhì)控多重?zé)晒釸T-PCR同時(shí)檢測(cè)麻疹病毒和風(fēng)疹病毒的研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2010，26（2）：109-114.

[4]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.全國(guó)麻疹監(jiān)測(cè)方案[S].2009.

[5]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.全國(guó)麻疹監(jiān)測(cè)方案[S].2014.

[6]Xiong Y，Wang D，Lin W，et al.Age-related changes in serological susceptibility patterns to measles：results from a seroepidemiological study in Dongguan，China[J].Hum Vaccin Immunother，2014，10(4)：1097-2003.

[7]楊鵬飛，燕清麗，張麗萍，等.漢坦病毒通用型實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法的建立及應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43(2)：321-324. [8]許聯(lián)紅，岳玉林，王永仿，等.雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)腸道病毒方法的建立及應(yīng)用[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45(33)：4688-4690.

[9]唐海淑，杜相品，甫爾哈提·吾守爾，等.脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的應(yīng)用與發(fā)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37(18)：2603-2605.

[10]周其偉，高秀潔，陳華云，等.H7N9禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2015，15(1)：36-39.

[11]呂莉琨，楊東靖，李力，等.手足口病柯薩奇病毒A2、A4和A5型SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2017，12(1)：15-19.

[12]劉婷婷，謝芝勛，宋德貴，等.H3N8亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，49 (12)：84-89.

[13]Michel Y，Saloum K，Tournier C，et al.Rapid molecular diagnosis of measles virus infection in an epidemic setting[J].J Med Virol，2013，85(4)：723-730.

[14]高丹，張國(guó)斌，賈妮娜.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法快速檢測(cè)麻疹病毒核酸[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25(11)：1815-1819.

[15]陳玲霞，姬莉莉，孫建飛.麻疹實(shí)驗(yàn)室診斷中ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法的比較[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，23(1)：106-108.

[16]Hwang S，Kang B，Hong J，et al.Development of duplex real-time RT-PCR based on Taqman technology for detecting simultaneously the genome of pan-enterovirus and enterovirus 71[J].J Med Virol，2013，85(7)：1274-1279.

Study on the Comparative of two types of triplex real-time RT-PCR detection reagent for measles virus and rubella virus

GONG Tian，SHI Yong，LI Jianxiong，ZHANG Yanni，XU Gang.
Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective A comparative evaluation of two kinds of triplex real-time RT-PCR detection reagents containing internal control for the detection of measles virus and rubella virus.Methods Provincial Measles Laboratory Network measles virus and rubella virus nucleic acid positive throat swab specimens were checked，and two kinds of triplex fluorescence quantitative PCR kits(reagent A and B)were compared.Results Measles and rubella virus nucleic acid positive throat swab specimens coincidence rate were 95.12%and 100.00%；the specificity and sensitivity of both reagents were good；the specificity of reagent A and B for detection of rubella virus were good，and their sensitivity were 71.43%and 100%；the sensitivity of reagent A and B for measuring human RNase P RNA were 92.73%and 100%respectively.Conclusions The reagent A has high sensitivity and specificity in the detection of measles virus nucleic acid，and has high application value.

∶Measles virus；Rubella virus；Three realtime RT-PCR

R446.62，R373.1

A

1674-1129(2017)03-0315-03

2016-08-17；

2017-03-10)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.007

龔甜，女，1982年生，碩士，病原生物學(xué)，主要從事麻疹病毒等傳染性病毒分子生物學(xué)研究。