慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平分析

侯春陽，馬玉梅，劉 莉，李宗芬

慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平分析

侯春陽，馬玉梅，劉 莉，李宗芬

目的 探討慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)及乙型肝炎后肝硬化(liver cirrhosis， LC)、肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)的表達(dá)水平。方法 選擇2014年1—3月建平縣疾病預(yù)防控制中心傳染病網(wǎng)絡(luò)報(bào)告的HBV 34例(CHB組)及2014年1—12月在建平縣疾病預(yù)防控制中心登記注冊的乙型肝炎后LC 31例(乙型肝炎后LC組)和乙型肝炎后HCC 29例(乙型肝炎后HCC組)，另選擇2014年1—3月參加建平縣醫(yī)院體格檢查結(jié)論健康的志愿者30例(對照組)。所有入選患者均進(jìn)行Th(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)檢測并比較。結(jié)果 4組外周血Th各指標(biāo)值總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CHB組、乙型肝炎后LC組及乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于對照組，外周血CD8+值均明顯高于對照組；乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組及乙型肝炎后LC組，而CD8+值明顯高于CHB組及乙型肝炎后LC組；乙型肝炎后LC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組，而CD8+值明顯高于CHB組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 CHB及乙型肝炎后LC、HCC患者均存在明確外周血Th異常表達(dá)，乙型肝炎后HCC患者最為嚴(yán)重。

乙型肝炎,慢性；肝硬化；肝腫瘤；輔助性T淋巴細(xì)胞;外周血

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染所致，并以肝臟慢性炎癥經(jīng)過為主要病理改變，CHB可引起宿主體內(nèi)消化系統(tǒng)多器官損害，部分CHB患者形成肝硬化(liver cirrhosis， LC)，甚至可以進(jìn)展為肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)，嚴(yán)重影響患者存活壽命及生活質(zhì)量。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為人體內(nèi)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)發(fā)生功能紊亂，未能有效、及時(shí)地清除HBV是發(fā)生CHB及其進(jìn)展成為LC、HCC的主要原因，宿主體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)對CHB預(yù)后及轉(zhuǎn)歸起主導(dǎo)作用，其中輔助性T淋巴細(xì)胞(Th，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)在上述過程中扮演重要角色[1-3]。國內(nèi)專門觀察CHB、LC及HCC患者外周血Th組間表達(dá)差異性及探討HBV 對機(jī)體細(xì)胞免疫功能影響的研究不多。為此，我們選擇2014年在遼寧省建平縣疾病預(yù)防控制中心調(diào)查登記的CHB、LC及HCC患者為研究對象，觀察他們外周血Th表達(dá)水平，并與對照組進(jìn)行比較，現(xiàn)分析報(bào)告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2014年1—3月經(jīng)遼寧省建平縣疾病預(yù)防控制中心傳染病網(wǎng)絡(luò)報(bào)告的HBV患者及2014年1—12月在建平縣疾病預(yù)防控制中心登記注冊的乙型肝炎后HCC和LC患者。將符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的CHB 34例作為CHB組，乙型肝炎后LC 31例作為乙型肝炎后LC組，乙型肝炎后HCC 29例作為乙型肝炎后HCC組。另選擇2014年1—3月參加建平縣醫(yī)院體格檢查結(jié)論健康的志愿者30例作為對照組。CHB組男21例(61.76%)，女13例(38.24%)；年齡19～62(35.71±8.40)歲。LC組男20例(64.52%)，女11例(35.48%)；年齡25～66(34.25±8.91)歲。HCC組男20例(68.97%)，女9例(31.03%)；年齡25～65(36.12±7.56)歲。對照組男19例(63.33%)，女11例(36.67%)；年齡21～69(34.90±6.78)歲。4組性別及年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.229，P=0.516;χ2=0.734,P=0.982)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HBV感染后不同臨床分型疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。②在建平縣居住5年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①甲、丙、丁、戊及其他型病毒性肝炎患者；②自身免疫性疾病患者；③乙醇、血吸蟲及藥物等其他原因引起肝損害患者；④近1年接受抗病毒及免疫調(diào)節(jié)治療患者；⑤接受手術(shù)及介入治療患者。

1.3 CHB、LC及HCC診斷標(biāo)準(zhǔn) ①CHB及LC診斷標(biāo)準(zhǔn)：選擇2010年由中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)修訂的“CHB防治指南[4]”中的CHB及LC診斷標(biāo)準(zhǔn)。②HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)：選擇2001年中國抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)修訂的“原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)[5]”中的HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 外周血Th表達(dá)水平測定 采取各組空腹靜脈血8 ml，高速離心后，分離血清，保存于-18℃低溫冰箱待檢。外周血Th (CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)表達(dá)水平測定應(yīng)用美國FC-500-MPL流式細(xì)胞儀，采用四色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測。血液標(biāo)本采集均在入選后10 d內(nèi)進(jìn)行。

2 結(jié)果

4組外周血Th各指標(biāo)值總體比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CHB組、乙型肝炎后LC組及乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于對照組(t=2.615、P=0.012，t=2.490、P=0.017，t=2.453、P=0.018；t=2.004、P=0.041，t=2.373、P=0.022，t=2.560、P=0.014；t=2.397、P=0.019，t=2.469、P=0.018，t=2.482、P=0.017)，外周血CD8+值均明顯高于對照組(t=2.452、P=0.018，t=2.516、P=0.016，t=2.172、P=0.038)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乙型肝炎后HCC 組外周血CD3+、CD4+及CD4+/ CD8+值均明顯低于CHB組及乙型肝炎后LC組(t=2.438、P=0.018，t=2.040、P=0.045;t=2.519、P=0.016，t=2.357、P=0.024;t=2.473、P=0.017，t=1.986、P=0.046)，而CD8+值明顯高于CHB組及乙型肝炎后LC組(t=2.552、P=0.037，t=1.821、P=0.047)；乙型肝炎后LC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組(t=1.025、P=0.049；t=1.376、P=0.048；t=1.865、P=0.046)，而CD8+值明顯高于CHB組(t=1.419、P=0.048)，差異亦均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 CHB、乙型肝炎后LC、乙型肝炎后HCC組及對照組4組外周血輔助性T淋巴細(xì)胞各指標(biāo)表達(dá)水平比較±s)

注：CHB為慢性乙型肝炎，LC為肝硬化，HCC為肝癌；與對照組比較，aP<0.05；與乙型肝炎后HCC組比較，cP<0.05；與乙型肝炎后LC組比較，eP<0.05

3 討論

肝臟是一個(gè)易誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受的特殊器官，HBV就是引起這樣細(xì)胞破壞的嗜肝臟 DNA 病毒， CHB患者的先天性免疫與后天獲得性免疫都存在某些缺陷，HBV感染并不直接損傷他們的肝細(xì)胞，而是誘導(dǎo)宿主體內(nèi)發(fā)生自身免疫反應(yīng)，間接傷害肝細(xì)胞，這一類細(xì)胞免疫反應(yīng)在HBV感染初期即對宿主轉(zhuǎn)歸和預(yù)后發(fā)揮著影響，并成為CHB后發(fā)生LC及HCC的重大影響因素[6-7]。不同個(gè)體感染 HBV后轉(zhuǎn)歸及結(jié)局存在顯著區(qū)別，有相當(dāng)比例感染人群死于CHB后LC及HCC，故探討HBV感染后結(jié)局差異的免疫學(xué)機(jī)制成了感染科室專家和學(xué)者們的關(guān)注熱點(diǎn)。在這里面，自然包括了Th所扮演的角色，CD4+ Th屬于人體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中樞，協(xié)助 B細(xì)胞進(jìn)行分化和產(chǎn)生抗體，CD4+又分為Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群，前者主要分泌干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素(IL)-2，參與遲緩型細(xì)胞免疫反應(yīng)；后者主要產(chǎn)生IL-4、IL-5因子及合成免疫球蛋白E(IgE)，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。在HBV持續(xù)作用下，這2類細(xì)胞因子數(shù)量發(fā)生了動(dòng)態(tài)波動(dòng)致使Th1/Th2 失衡，這是決定CHB發(fā)生不同轉(zhuǎn)歸的重要免疫學(xué)病因[8-9]。目前，國內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道涉及了Th參與肝臟免疫及炎癥反應(yīng)經(jīng)過內(nèi)容[6-7,9]，提出了一些觀點(diǎn)與看法。本文選擇2014年1—3月遼寧省建平縣疾病預(yù)防控制中心傳染病網(wǎng)絡(luò)報(bào)告的HBV患者及2014年1—12月在建平縣疾病預(yù)防控制中心登記注冊的乙型肝炎后LC及乙型肝炎后HCC患者為研究對象，觀察不同結(jié)局HBV感染患者外周血Th表達(dá)水平變化，并與2014年1—3月在建平縣醫(yī)院進(jìn)行體格檢查的健康者進(jìn)行比較，結(jié)果顯示CHB組、乙型肝炎后LC組及乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于對照組，外周血CD8+值均明顯高于對照組；乙型肝炎后HCC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組及乙型肝炎后LC組，而CD8+值明顯高于CHB組及乙型肝炎后LC組；乙型肝炎后LC組外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明顯低于CHB組，而CD8+值明顯高于CHB組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CHB及乙型肝炎后LC、乙型肝炎后HCC患者均存在明確外周血淋巴細(xì)胞各亞群比例失衡及Th表達(dá)異常，乙型肝炎后HCC患者最為嚴(yán)重。有部分學(xué)者認(rèn)為，CHB、乙型肝炎后LC及乙型肝炎后HCC患者外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值表達(dá)低下代表著這些宿主體內(nèi)持續(xù)存在著HBV感染，并遭遇后者不斷刺激，呈反復(fù)復(fù)制活動(dòng)，并且這些Th相關(guān)指標(biāo)體內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度不同帶來了HBV感染患者不同結(jié)局[10-12]。一些國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用不同方法進(jìn)行類似研究，得出了與本研究較為一致結(jié)論[13-14]。

總之，在HBV感染過程中，宿主體內(nèi)發(fā)生了Th表達(dá)異常，Th1/Th2失衡程度決定著CHB病程遷延程度和(或)是否轉(zhuǎn)歸為其他更為嚴(yán)重的結(jié)局(乙型肝炎后HCC和LC)。Th相關(guān)指標(biāo)可作為HBV感染免疫學(xué)病因診斷、選擇治療及療效評(píng)估的定量標(biāo)識(shí)，也開辟了對這一患病群體進(jìn)行分級(jí)預(yù)防及免疫治療的新途徑。

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Expression Levels of Helper Lymphocyte T in Peripheral Blood of Patients with Chronic Hepatitis B, Liver Cirrhosis after Hepatitis B and Hepatocellular Carcinoma

HOU Chun-yang1, MA Yu-mei1, LIU Li2, LI Zong-fen3

(1. The Second Department of Infection, the Sixth People Hospital of Shenyang, Shenyang 110006, China; 2. Center for Disease Prevention and Control of Liaoning Province, 110005 Shenyang, China; 3. Center for Disease Prevention and Control of Jianping County, Jianping, Liaoning 122400, China)

Objective To investigate expression levels of helper T lymphocyte (Th) in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B (CHB), liver cirrhosis (LC) after hepatitis B infection and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods A total of 34 hepatitis B virus (HBV) patients (CHB group) reported in legal infectious diseases network of Jianping County from January to March in 2014, 31 LC patients after hepatitis B infection (LC group) registered from January to December 2014, 29 HCC patients after hepatitis B infection (HCC group) registered in disease prevention and control center of Jianping County from January to March in 2014 and 30 healthy people taking physical examination from January to March in 2014 (control group) were recruited in this study. Detections of T cells (CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/ CD8+) were performed for all the groups. Results There were significant differences in Th index values in peripheral blood in the four groups (P<0.05). Values of CD3+, CD4+ and CD4+/CD8+ in peripheral blood were significantly lower, while CD8+ values in peripheral blood were significantly higher in CHB, LC and HCC groups than those in control group; values of CD3+, CD4+ and CD4+/ CD8+ in peripheral blood were significantly lower, while CD8+ value was significantly higher in HCC group than those in CHB and LC groups; values of CD3+, CD4+ and CD4+/ CD8+ in peripheral blood was significantly lower, while CD8+ value was significantly higher in LC group than those in CHB group (P<0.05). Conclusion Abnormal expression of Th in peripheral blood can be found in patients with CHB, LC after hepatitis B infection and HCC after hepatitis B infection, and HCC patients after hepatitis B infection are especially severe.

Hepatitis B, chronic; Liver cirrhosis; Liver neoplasms; Helper T cells; Peripheral blood

遼寧省科技惠民計(jì)劃專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2013GS210102)

110006 沈陽，沈陽市第六人民醫(yī)院感染二科病房(侯春陽、馬玉梅)；110005 沈陽，遼寧省疾病預(yù)防控制中心(劉莉)；122400 遼寧 建平，建平縣疾病預(yù)防控制中心(李宗芬)

R512.62；R575.2；R735.7

A

1002-3429(2017)05-0098-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.05.030

2017-02-11 修回時(shí)間：2017-03-10)