汝州白三葉草根瘤菌的分離與分子鑒定

張俊杰， 楊 旭， 陸 勇， 張志炎， 王志偉， 魏喜旺

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

汝州白三葉草根瘤菌的分離與分子鑒定

張俊杰， 楊 旭， 陸 勇， 張志炎， 王志偉， 魏喜旺

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

本研究采用16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP和16S rDNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析等分子鑒定方法，對分離的汝州白三葉草共生根瘤菌進行了多樣性研究。結果表明，21株供試菌株僅產(chǎn)生了一種16S rDNA酶切圖譜組合類型，通過IGS PCR-RFLP又把所有的供試菌株分為了6種酶切圖譜類型。經(jīng)過對代表菌株的16S rDNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，6個代表菌株之間具有99.9%～100%的相似性，且供試菌株與根瘤菌屬的已知種群Rhizobiumanhuiense和Rhizobiumleguminosarum等也具有99.9%～100%的相似性，因此，分離自汝州的白三葉草根瘤菌屬于根瘤菌屬(Rhizobium)。

白三葉草；根瘤菌； 16S rDNA；IGS；RFLP

長期以來，中國農業(yè)生產(chǎn)依賴化學肥料，造成生產(chǎn)成本的增加，引起土壤板結。由于作物只能在生長期吸收利用化肥中的部分營養(yǎng)元素，化肥中未被利用的氮磷鉀將隨降雨流失到地下水與江河等生態(tài)環(huán)境中，嚴重破壞了自然生態(tài)平衡和農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。生物固氮是一條很重要的向土壤輸?shù)耐緩?，是豆科植物有別于其他農作物最重要的優(yōu)勢。根瘤菌與豆科植物的共生體系是生物固氮中固氮能力最強的體系，占生物固氮量的65%以上，它為豆科植物提供氮素營養(yǎng)，培肥地力，從而增加了作物產(chǎn)量、改善作物品質。高效的固氮根瘤菌應用于生產(chǎn)，不僅可提高大豆的固氮能力，而且可以有效減少因長期使用化肥帶來的環(huán)境污染[3-6]。有研究表明，在含速效氮中等偏低肥力的土壤中，接種大豆根瘤菌可以有效提高大豆地上部植株生長和地下部根瘤形成，并且可以提高植株高度和鮮質量[6]。白三葉草(TrifoliumrepensL.)是一類重要的優(yōu)良豆科綠肥和牧草，是本屬植物中在中國很有推廣前途的種群[7]。在長期進化過程中，根瘤菌由于受到環(huán)境脅迫和寄主的選擇，各自向著不同的方向進化，從而形成了豐富的生物多樣性[8-9]。目前，對白三葉草根瘤菌的研究資料不多，國內外對白三葉草根瘤菌多樣性及系統(tǒng)分類研究的報道也很少，尤其是河南省境內，尚未見白三葉草根瘤菌多樣性研究的報道。因此，了解白三葉草根瘤菌的生物多樣性，選育高效與抗逆性能優(yōu)良的菌株用于農林生產(chǎn)具有非常重要的經(jīng)濟和生態(tài)學意義。

1 材料和方法

1.1 供試與參比菌株

本研究所用的材料為分離自河南省汝州市煤山公園野生白三葉草根瘤的21株共生根瘤菌，樣品采集采用張俊杰[10]采樣方法，根瘤菌的分離按照VINCENT[11]經(jīng)典方法進行。在系統(tǒng)發(fā)育分析過程中用到的模式及參比菌株有來自根瘤菌屬(Rhizobium)的R.anhuienseCCBAU 23252T、R.phaseoliATCC 14482T、R.acidisoliFH13T、R.indigoferaeCCBAU71042T、R.laguerreaeFB206T、R.leguminosarumUSDA2370T和R.sophoraeCCBAU03386T等；來自土壤農桿菌屬(Agrobacterium)的A.tumefaciensB6T等；來自中華根瘤菌屬的Sinorhizobiumsp. CCBAU65101；來自慢生根瘤菌屬的BradyrhizobiumjaponicumUSDA6T；和近期發(fā)表的根瘤菌新屬Pararhizobiumsp. F5.3及NeorhizobiumgalegaeG323T等。這些標準菌株的16S rDNA序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫下載獲得。

1.2 培養(yǎng)基

YMA (Yeast Extract D-mannitol Agar)培養(yǎng)基：酵母粉 3 g， K2HPO40.25 g，甘露醇10 g，無水MgSO40.1 g， KH2PO40.25 g， NaCl 0.l g，瓊脂粉(agar)18 g，去離子水(distilled water)1 000 mL，pH值6.8～7.2，121 ℃滅菌30 min；

TY(Tryptone-Yeast)培養(yǎng)基： CaCl2·2H2O 0.7 g，胰蛋白胨5 g，酵母粉 3 g，去離子水(distilled water)1 000 mL，pH值6.8～7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.3 根瘤菌DNA的提取

先將供試菌株活化在YMA平板上，挑去單菌落并接種于5 mL TY液體培養(yǎng)基，放至于28 ℃搖床上以130 r·min-1的轉速振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。DNA的提取方法參照Terefework的GUTC方法[12]，該方法基本過程是對收集的樣品通過GUTC(60%乙醇，20mmol·L-1pH值7.5 Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA和400 mmol·L-1NaCl)作用裂解細胞，然后去除樣品中的蛋白質等雜質，最終用硅藻土吸附沉淀核酸DNA，并用雙蒸水溶解并獲得樣品DNA。提取的DNA用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳估測濃度，所有DNA樣品在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rDNA和IGS PCR-RFLP

16S rDNA和IGS基因擴增程序方法等參見文獻[10]，PCR過程使用伯樂C1000 PCR擴增儀，所用的DNA聚合酶則來自生工生物工程(上海)股份有限公司。16S rRNA PCR產(chǎn)物用4種限制性內切酶：AluI、HaeIII、MspI和HinfI分別進行酶切，而IGS產(chǎn)物則選用3種限制性內切酶酶切：HaeIII 、MspI和HhaI。所用限制性內切酶均來生工生物工程(上海)股份有限公司。酶切體系參見文獻[10]，結果用2.5%的瓊脂糖凝膠(含10% GoldView I型核酸染色劑，索萊寶)在60～80 V電壓下電泳1～2 h，然后用DNI凝膠成像系統(tǒng)(DNI Bio-Imaging System，MiniBIS Pro)檢測酶切電泳結果。

1.5 代表菌株的16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

對16S rDNA和IGS PCR-RFLP結果進行整理和酶切圖譜類型分析，從每個圖譜組合類型中找出一個代表菌株，擴增其16S rDNA基因，并送公司進行測序和拼接，拼接好的序列經(jīng)過NCBI BLASTn比對找到序列相似性較高的菌株，最后利用Mega 6.0軟件對供試序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，具體方法同文獻[10]中的方法，采用Kimura 2-parameter模型，bootstrap值為1000，獲得Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 供試菌株16S rDNA 和IGS基因序列PCR擴增結果

16S rDNA 和IGS基因序列PCR產(chǎn)物大小分別為1.5 kb和1 kb。

2.2 三葉草根瘤菌16S rDNA RFLP分析

21株待測菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物分別經(jīng)AluI、HaeIII和MspI共3種限制性內切酶分別酶切后，酶切產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖凝膠電泳中分別呈現(xiàn)出相同的單一的酶切圖譜類型，如圖1所示，所有待測菌株的16S rDNA具有相同的酶切圖譜組合類型。由于HinfI在所有供試菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物中均無酶切位點，所以未給出相關電泳圖譜。結果表明，21株三葉草根瘤菌同屬于1個屬。

a:AluI酶切圖譜;b:HaeIII酶切圖譜;c:MspI酶切圖譜(每種酶的酶切圖譜都相同，僅顯示部分代表酶切結果，下同)。

a.AluI finger-print; b.HaeIII finger-print; c.MspI finger-print (each enzyme with the same kind of finger-print, and only some representative bands showed here. The same as below).

圖1 供試菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物酶切電泳圖譜
Fig.1 The electrophoresis results of the 16S rDNA PCR RFLP for the representatives

2.3 IGS PCR RFLP結果與分析

21株待測菌株的IGS PCR產(chǎn)物經(jīng)過MspI、HaeIII

和HhaI共3種限制性內切酶的酶切，在2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到RFLP酶切圖譜(圖2)，圖2中列出了每種限制性內切酶酶切后所有的酶切圖譜代表類型，其中HaeIII酶切圖譜共有5種圖譜類型，HhaI酶切圖譜共有2種圖譜類型，而MspI酶切圖譜則有4種圖譜類型。

a：HaeIII酶切圖譜；b：HhaI酶切圖譜；c：MspI酶切圖譜。a.HaeIII finger-print； b.HhaI finger-print； c.MspI finger-print.圖2 供試菌株IGS PCR-RFLP電泳圖譜Fig.2 The IGS PCR-RFLP for the representatives

經(jīng)過對所有供試菌株酶切圖譜的分析，21株供試菌株一共被分為6個酶切圖譜組合類型(T1～T6)，見表1。T1占所有菌株的47.6 %，T2占9.5 %，T3占23.8 %，T4占9.5 %，而T5和T6各占4.8 %。 其中，T1和T3為主要圖譜類型，占到供試菌株的71.4 %，而T5和T6是其中占少數(shù)的酶切圖譜類型。

表1 供試菌株的IGS PCR RFLP分型結果Table 1 The IGS PCR RFLP typing results of all the strains slected

2.4 代表菌株16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，結果見圖3。根據(jù)IGS基因酶切結果從6種IGS圖譜類型中一共選擇了6個代表菌株：T1代表菌株R2-6，T2代表菌株R2-4，T3代表菌株R3-7，T4代表菌株R1-6，T5代表菌株R1-3和T6代表菌株R1-7，用于16S rDNA基因的序列測定和分析。經(jīng)PCR反應得到的16S rDNA基因產(chǎn)物送公司進行序列測定，然后分析和拼接測序結果，并應用NCBI BLASTn工具進行序列比對，選取序列相似性較高的參考序列及相關種屬的已知種群部分序列，利用Mega 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果見圖3。由系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖可以得知，6個代表菌株與根瘤菌屬的代表菌株聚為一個大的分支，所以可以判定汝州三葉草根瘤菌都屬于根瘤菌屬，并且6個代表菌株序列相似性為99.9% ～100 %。具體來看，6個代表菌株都分布在樹狀圖的小分支I(Clade-I)，并且與該分支的所有已知代表菌株的序列相似性范圍為99.9%～100 %，如：R.anhuienseCCBAU 23252T等；6個代表菌株與小分支II(Clade-II)中已知代表菌株的序列相似性為99.7%～99.3 %，如：R.phaseoliATCC 14482T等。而代表菌株測序后的拼接序列都已經(jīng)提交Genbank并獲得相應的序列登錄號，見圖3。

采用Neighbour-Joining方法的Kimura 2-parameter 模型和1000的bootstrap值構建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中菌株B.japonicumUSDA 6T被作為發(fā)育樹的外群，僅大于50%的bootstrap值被保留在系統(tǒng)發(fā)育樹上。字體加粗的菌株為本試驗中三葉草根瘤菌代表菌株，Genbank登錄號在相對應的括號中標出。

The Neighbour-Joining tree was derived from a distance matrix (Kimura 2-parameter model) and 1000 of the bootstrap value. Bootstrap confidence levels >50% are indicated at the internodes.B.japonicumUSDA 6Twas taken as the outgroup. The representatives were in boldface and the correspondence accession numbers were in the bracket following the strain numbers.

圖3 代表菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 The phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of the representatives

3 討論

本研究以分離自河南省汝州市煤山公園草坪白三葉草根瘤的21株根瘤菌菌株為研究對象，充分結合16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP和16S rDNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析方法進行了遺傳多樣性的研究。經(jīng)過16S rDNA PCR-RFLP分析，所有的供試菌株僅產(chǎn)生了一種酶切圖譜組合類型，并初步判定所有供試菌株屬于同一個屬；又通過IGS PCR-RFLP把所有的供試菌株分為了6種酶切圖譜類型。然后經(jīng)過對代表菌株的16S rDNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，6個代表菌株之間具有99.9%～100%的相似性，且供試菌株與根瘤菌屬的已知種群R.anhuiense和R.leguminosarum等也具有99.9%～100 %的相似性，最終確認供試菌株均屬于Rhizobium。

21株供試菌株都屬于根瘤菌屬，較為單一。這與劉曉云等[13]在江西、湖北、云南等地分離出的三葉草根瘤菌分別歸屬于快生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬的研究結果不同，顯示出三葉草根瘤菌在地區(qū)分布的局限性，可能與當?shù)氐牡乩憝h(huán)境和氣候條件有關。劉曉云等[13]分離的根瘤菌主要采自江西、湖北、云南等地的三葉草屬植物，范圍較廣，具有良好的多樣性，而本研究的三葉草根瘤菌均來源于河南汝州。而我們過去的研究中也發(fā)現(xiàn)來自中國新疆木壘鷹嘴豆主產(chǎn)區(qū)的鷹嘴豆共生根瘤菌種群也是很單一的一個種群——木壘中慢生根瘤菌種群[17]，這說明長期的地理隔離可能導致某一地區(qū)某種豆科植物的共生根瘤菌種群比較單一。楊亞珍[14]在對西北干旱地區(qū)三葉草根瘤菌的研究中發(fā)現(xiàn)，不同地理來源、同一地理來源、甚至同一植株不同根瘤的菌株在各方面存在著差異的生理生化性狀，本研究一定程度上也證明了三葉草地理分布的差異，導致其共生根瘤菌類群組成的差異，二者是一致的。通過IGS PCR-RFLP的結果分析來看，21株白三葉草的根瘤菌分為6種類型，這說明盡管在同一采樣地點的根瘤菌在很大程度上受地域、生態(tài)環(huán)境影響而表現(xiàn)為相似的類群，但是進化過程中卻表現(xiàn)出較好的群內多樣性，這與潘明洪等[15]分離自四川地區(qū)的白三葉草根瘤菌的屬較為單一，但卻含有豐富的群內多樣性的結果相一致。在今后的研究中，需要擴大地理范圍和菌株數(shù)量，以便更全面探索白三葉草根瘤菌的多樣性分布。

[1] 金曉梅，Синеговская В Т，趙念力. 根瘤菌、微肥和作物生長調節(jié)劑對大豆氮磷鉀積累和產(chǎn)量的影響[J]. 大豆科學，2009，28(4)：751-754.

[2] 陳文新. 豆科植物根瘤菌-固氮體系在西部大開發(fā)中的作用[J]. 草地學報，2004，12(1)：1-2.

[3] 趙宇樞，段玉璽，王媛媛，等. 遼寧省大豆根瘤菌資源抗逆性及生防潛力研究[J]. 大豆科學，2009，28(1)：113-117.

[4] 馬中雨，李俊，張永芳，等. 大豆根瘤菌與大豆品種共生匹配性研究[J]. 大豆科學，2008，27(2)：221-227.

[5] 戴廷波，孫傳范，荊奇，等. 不同施氮水平和基追比對小麥籽粒品質形成的調控[J]. 作物學報，2005，31(2)：248-253.

[6] 孟慶英，張立波，張春峰，等. 根瘤菌對大豆生理及農藝性狀的影響[J].黑龍江農業(yè)科學，2015(1)： 27-28.

[7] 徐廣. 西安地區(qū)三葉草根瘤菌生物學特性及共生固氮效應的研究[D]. 西寧：青海師范大學， 2009.

[8] 姚竹云，陳文新. 根瘤菌的現(xiàn)代分類及其系統(tǒng)發(fā)育[J]. 微生物學雜志，1998，18(1)：38-43.

[9] 張小平，李阜棣. 根瘤菌的遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育研究進展[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2002，8(3)：325-333.

[10]張俊杰. 新疆鷹嘴豆根瘤菌的生物學特征研究[D]. 北京：中國農業(yè)大學，2014.

[11]VINCENT J M.A manual for the practical study of the root-nodule bacteria[M].Oxford and Edinburgh: Blackwell Scientific Publications，1970: 1-13.

[12]TEREFEWORK Z, KAIJIALAINEN S, LINDSTROM K. AFLP fingerprinting as a tool to study the genetic diversity ofRhizobiumgalegaeisolated fromGalegaorientalisandGalegaofficinalis[J]. Journal of Biotechnology, 2001, 91:169-180.

[13]劉曉云，陳文新. 三葉草、豬屎豆和含羞草植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP分析和數(shù)值分類研究[J]. 中國農業(yè)大學學報，2003，8(3)：1-6.

[14]楊亞珍. 西北干旱地區(qū)甘草根瘤菌的表型多樣性及系統(tǒng)發(fā)育[D]. 楊凌：西北農林科技大學， 2004.

[15]潘明洪，凌瑤，景文，等. 四川白三葉根瘤菌遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究[J]. 草業(yè)學報，2014，3(5)： 143-152.

[16]吳云漢. 大豆根瘤菌菌株接種效果的研究[J].河南農業(yè)大學學報，1996，30(1)：99-101.

[17]張俊杰，郭晨，楊旭，等. 鷹嘴豆根瘤菌多樣性研究進展[J].輕工學報，2016，31(6)：1-7.

(責任編輯：朱秀英)

The isolation and molecular identification ofRhizobiaassociated with white clover from Ruzhou

ZHANG Junjie, YANG Xu, LU Yong, ZHANG Zhiyan, WANG Zhiwei, WEI Xiwang

(College of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

A series of molecular identification methods including 16S rDNA PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), IGS PCR-RFLP, 16S rDNA gene sequencing and phylogenetic analysis were used to study the genetic diversity of clover rhizobia from Ruzhou. The results showed that a total of 21 clover rhizobia were obtained and they were of the same kind of 16S rDNA PCR-RFLP pattern and were divided into six IGS PCR-RFLP patterns. Through the 16S rDNA gene sequencing and phylogenetic alalysis of the representative strains, the representatives were with inner group similarities of 99.9-100% and were with 99.9%～100% similarities of the knownRhizobiumspp., such asR.anhuienseandR.leguminosarum. So the clover rhizobia isolated from Ruzhou can be identified asRhizobiumstrains.

white clover;Rhizobia; 16S rDNA; IGS; RFLP

2016-04-13

國家自然科學基金項目(31400008)；鄭州輕工業(yè)學院博士科研基金項目(2014bsjj006)。

張俊杰(1984-)，男，河南鄭州人，講師，主要從事細菌分類與分子生態(tài)學方面的研究。

1000-2340(2017)01-0076-06

Q939.11+4

A